Проблема женского бесплодия актуальна в России и мире по сей день. В структуре идиопатического женского бесплодия важную роль играют наследственные тромбофилии (НТ). Согласно определению ВОЗ и Международного общества по тромбозу и гемостазу, тромбофилия — необычная наклонность к тромбозу с началом в раннем возрасте, отягощенность семейного анамнеза, степень тяжести тромбоза, непропорциональная известному причинному фактору и эпизодам рецидивов тромбоза. Наследственные тромбофилии, согласно T. Bombeli и соавт. [1], встречаются у 9% практически здоровых пациентов и у 30% с артериальным или венозным тромбозом в анамнезе, что подтверждается данными M. Demir и соавт. [2].

НТ, по данным разных исследований, оказывают негативное влияние на исход беременности как на ранних, так и на поздних ее сроках. В исследовании F. Azem и соавт. [3] выявлено, что частота встречаемости НТ в группе пациенток с 4 и более неудачными циклами ЭКО в анамнезе почти в 3 раза больше, чем в группе контроля. Также в метаанализе M. Di Nisio и соавт. [4] показано, что у пациенток с неудачными ЭКО выявляются НТ, в частности мутация фактора V Leiden.

В исследовании C. Coulam и соавт. [5] не выявлено статистически значимых различий в частоте специфических генных мутаций факторов свертывания в группе с повторным невынашиванием беременности и группе контроля. Однако гомозиготные мутации гораздо чаще встречались в группе с привычным невынашиванием беременности (59% против 10% в группе контроля) и множественными генными мутациями (68% против 21% в группе контроля). В исследовании Н. Qublan и соавт. [6] приводятся следующие данные: комбинированные тромбофилии (2 тромбофилических фактора и более) встречаются существенно чаще среди женщин с повторными неудачыми ЭКО по сравнению с группой контроля (35,6% против 4,4% в группе контроля). Поэтому для развития невынашивания беременности необходимо наличие выраженных нарушений системы гемостаза.

В настоящее время в патогенезе нарушений имплантации (особенно в рамках ЭКО) обсуждается роль следующих факторов: дефицит факторов противосвертывающей системы (протеинов С и S, антитромбина III), дефекты факторов свертывания II, V и XIII, полиморфизм ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) и адгезивных белков тромбоцитов (GPIIb/IIIa) [7].

Недифференцированная дисплазия соединительной ткани (нДСТ) — генетически гетерогенная группа заболеваний мультифакториальной природы, в основе которых лежат нарушения синтеза и распада внеклеточного матрикса, возникающие под действием неблагоприятных факторов внешней среды у индивидуумов с определенной генетической предрасположенностью уже в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально и характеризующиеся нечеткой клинической картиной [8, 9].

Имеется ряд сведений, косвенно указывающих на роль нДСТ в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия и НТ.

Для инвазии трофобласта необходимы матриксные металлопротеиназы: ММР 1, 2, 3, 9, активность которых повышается посредством ингибирования TIMP 1, 2 и 3, индуцируемого LIF [10].

Остеопонтин обеспечивает прикрепление остеобластов к неорганическому компоненту костного матрикса путем прочного связывания с кристаллами гидроксиапатита, а в эндометрии он необходим для адгезии бластоцисты за счет связывания с другими интегринами на пиноподиях эпителия [11].

Гены, которые могут инициировать развитие синдромов НТ и нДСТ, находятся в одном локусе. Например, в локусе 13q34 расположены гены коллагена IV типа COL4A1 и COL4A2, а также гены факторов свертывания FVII и FX, также в локусе 7q22.1 расположен ген SERPINE1, кодирующий белок PAI-1, и ген COL1A2, кодирующий α₂-цепь коллагена 1-го типа [12—14].

Белок PAI-1 имеет двоякую функцию: помимо своей основной функции ингибирования процессов фибринолиза, он также играет важную роль в процессах интерстициального фиброза [13].

Цель исследования — определить морфологический субстрат и молекулярные механизмы нарушений исходов беременности у женщин с нДСТ и НТ.

В исследование включили 130 пациенток репродуктивного возраста с первичным бесплодием, находившихся на обследовании и лечении по поводу первичного бесплодия во ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» и ООО «Гематологический кабинет доктора Димитрия Колосовского» и 11 пациенток группы контроля (суррогатные матери). В рамках этапа исследования эндометрия им выполняли пайпель-биопсию на 6—8-й день после овуляции по данным УЗИ. Пациенткам основной группы с НТ также проводили молекулярно-генетическое исследование сыворотки крови на полиморфизмы или мутации следующих генов: FII, FV (Leiden), FVII, FXII, FXIII, GpIa, GpIb (-5), GpIb (T145M), GpIIIa, PAI-1, FBGb, MTHFR, MTRR, MTR, SLC19A1, ангиотензиногена (M235T и Т145М), ангиотензинпревращающего фермента, их гомо- или гетерозиготность. Диагноз Н.Т. основывался на молекулярно-генетическом исследовании в соответствии с клиническими рекомендациями Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии, диагноз нДСТ — на углубленном анамнестическом исследовании с подробным изучением признаков нДСТ по Т.И. Кадуриной. Пациенток основной группы подразделили на подгруппы: 1А — с бесплодием и НТ (n=91), 1Б — с бесплодием, НТ и нДСТ (n=19), 1 В — с бесплодием и нДСТ (n=20; группа морфологического контроля).

Проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования эндометрия с использованием первичных антител к рецепторам половых гормонов, LIF, PAI-1, остеопонтину, а также статистическую обработку результатов.

Количество беременностей в основной группе было сопоставимо с количеством пациенток в каждой подгруппе. Исходы беременности рассматривали как благоприятные — роды и неблагоприятные — замершие беременности. Больше всего благоприятных исходов отмечено в подгруппе 1 В с нДСТ, меньше всего — в подгруппе 1Б. Суммарные данные по исходам беременности представлены в табл. 1.

При анализе свертывающей системы в группе с НТ в 25% случаев наблюдалась повышенная концентрация PAI-1 в плазме крови, в 12,5% — гипергомоцистеинемия, в 55% — дезагрегационная тромбоцитопатия, в 35% случаев — синдром липких тромбоцитов и в 5% случаев отмечался низкий уровень толерантности к метиониновому тесту.

Исследовали также структуру полиморфизов гена PAI-1, из 91 пациентки выявлено 27 с гомозиготным полиморфизмом 4G/4G, 38 с гетерозиготным полиморфизмом 4G/5G и 25 без полиморфизма 5G/5G (рис. 1, а).

Частота мутаций и полиморфизмов факторов свертывания в структуре рожавших и нерожавших женщин с НТ показана на рис. 1, б.

В группе с сочетанием признаков НТ и нДСТ обнаруживали следующие изменения: в 15,8% случаев повышенная концентрация PAI-1 в плазме крови, в 10,5% — гипергомоцистеинемия, в 88% — дезагрегационная тромбоцитопатия, в 36,8% случаев синдром липких тромбоцитов и в 5,2% случаев отмечали низкий уровень толерантности к метиониновому тесту.

Качественный состав мутаций и полиморфизмов в группе с НТ и нДСТ показан на рис. 1, в.

Исследовали также структуру полиморфизов гена PAI-1, среди 19 пациенток в подгруппе с нДСТ и НТ выявлено 12 с гомозиготным полиморфизмом 4G/4G, 5 с гетерозиготным полиморфизмом 4G/5G и 2 без полиморфизма 5G/5G.

Также проведен анализ частот мутаций генов факторов свертывания в зависимости от наличия родов в анамнезе у женщин подгрупп 1А и 1Б. В группе женщин, которые не имели родов в анамнезе, отмечены существенно более высокие частоты полиморфизмов генов фибриногена и метилентетрагидрофолатредуктазы, при этом мутация фактора VII была чаще у женщин с родами в анамнезе (см. рис. 1, г).

Чаще всего у пациенток с НТ, страдающих бесплодием, наблюдали мутации и полиморфизмы генов PAI-1, SLC19A1, GpIa, MTRR. В подгруппе 1А у 9 (9,9%) пациенток наблюдали полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных их было 4 и более — от 4 до 11, в среднем полиморфизм 6,6±2,3 гена у каждой пациентки. Поскольку предполагалось, что большее количество мутаций и полиморфизмов генов белков, влияющих на свертываемость крови, приведет к снижению вероятности родоразрешения, проведен анализ частот мутаций генов, факторов свертывания в зависимости от наличия родов в анамнезе. Анализ показал неоднозначные результаты в группе с НТ: у пациенток с бесплодием, у которых в анамнезе были роды (т.е. у пациенток с вторичным бесплодием), частота мутаций в целом выше, чем у пациенток, у которых в анамнезе родов не было (т.е. у пациенток с первичным бесплодием) (табл. 2).

У пациенток обеих подгрупп с НТ наблюдали мутации и полиморфизмы генов PAI-1, SLC19A1, GpIa, MTRR, в подгруппе с НТ и нДСТ в большем проценте случаев выявлены мутации FV (Leiden), GрIa и SLC19A1, а также GрIb. В структуре мутаций гена PAI-1 в группе с НТ и нДСТ гомозиготные полиморфизмы встречались существенно чаще, чем в группе 2 (77,8% против 30%), что может свидетельствовать в пользу того, что мутации PAI-1 могут играть определенную роль в патогенезе синдрома нДСТ, аналогично можно говорить о структуре полиморфизмов гена GpIa.

В группе с НТ у 4 (10%) пациенток наблюдали полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных их было 4 и более — от 4 до 11, в среднем полиморфизм 6,6±2,3 гена у каждой пациентки. В группе с сочетанием НТ и нДСТ только у 1 (5,3%) пациентки был полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных 18 — 5 и более, до 12. В среднем наблюдали полиморфизм 7,3±3,0 гена у каждой пациентки. Коэффициент Манна—Уитни U=136,0; р=0,266. Полученные данные подтверждаются полигенным наследованием НТ в исследуемых подгруппах. При этом различие в числе полиморфизмов в этих подгруппах не является статистически значимым, т. е. наличие нДСТ не влияет на число полиморфизмов генов белков, влияющих на свертываемость крови.

В морфологическое исследование вошел биопсийный материал эндометрия от 141 пациентки основной и контрольной групп. Распределение материала в каждой исследуемой группе по морфологическим стадиям эндометрия в период «окна имплантации» показано в табл. 3.

Пиноподии в поверхностном эпителии эндометрия определялись в подгруппах 1А, 1Б и 1 В и 19, 12 и 24 соответственно (p>0,05). В основной группе часто обнаруживали очаговый склероз, расстройства микроциркуляции — кровоизлияния в строме, сладж и тромбы в микрососудах. В подгруппах 1Б и 1 В расстройства микроциркуляции выявлены в 47,3 и 55% случаев соответственно, в подгруппе 1А их было 40%, тогда как в контроле указанные изменения не обнаружены (p>0,05). Очаги склероза встречались в подгруппах 1Б и 1 В в 68,4 и 70% случаев, в группе с НТ в 50%; p>0,05 (см. табл. 3).Частота сладжа, микротромбоза или очагов склероза в основной группе с НТ (1А и 1Б) зависела не столько от каких-то конкретных мутаций генов системы свертывания, сколько от их количества (см. рис. 1, д).

При анализе результатов иммуногистохимического исследования показано, что у пациенток основной группы имеются нарушения рецептивности как на структурном, так и на молекулярном уровне, что проявляется снижением количества зрелых пиноподий, экспрессии LIF, а также дисбалансом экспрессии рецепторов эстрогеновых и прогестероновых гормонов в строме эндометрия. Данные по экспрессии рецепторов половых гормонов и LIF опубликованы ранее в наших статьях [8, 15].

В нашем исследовании PАI-1 выявлялся на более высоком уровне в эпителии и строме у пациенток основной группы по сравнению с группой контроля (p≤0,05). Важно отметить, что максимальная экспрессия белка обнаружена в поверхностном эпителии эндометрия пациенток подгруппы 1Б с НТ и нДСТ, составив 5±1,2 балла, и в подгруппе с НТ — 4,5±1,1 балла, что превысило аналогичный показатель в группе контроля — 0,95±1,23 балла (p≤0,05). Похожая тенденция прослеживалась и в экспрессии маркера в эндотелии сосудов и в строме эндометрия (p≤0,05) (см. рис. 2, ж).

Следующим новым маркером рецептивности эндометрия был остеопонтин, являющийся одним из факторов адгезии. В нашем исследовании маркер обнаруживался в поверхностном и железистом эпителии эндометрия, в пиноподиях и строме слизистой тела матки (см. рис. 2, д, е). В группе контроля экспрессия белка достоверно выше вне зависимости от его локализации в эндометрии по сравнению с основной группой (p≤0,05) (см. рис. 2, з).

Результаты исследования показали, что синдром нДСТ играет определенную роль в развитии бесплодия у пациенток с НТ, однако она не является определяющей. Это подтверждается следующими данными: отсутствие статистически значимых различий в частоте замерших беременностей и родов у пациенток в обеих группах. Частота мутаций и полиморфизмов всех исследованных факторов свертывания в целом сопоставима, однако нет статистически значимых различий между количеством мутаций и полиморфизмов у пациенток в исследуемых подгруппах с НТ (1А и 1Б). Кроме того, между частотами выявления отклонений в различных показателях системы гемостаза, как правило, статистически значимые различия отсутствовали. Однако при этом отмечается ряд тенденций, указывающих на роль синдрома нДСТ в патогенезе бесплодия у пациенток с НТ. Во-первых, в подгруппе 1Бс НТ и нДСТ существенно чаще встречались гомозиготные полиморфизмы гена PAI-1, а также статистически значимо чаще выявлялась дезагрегационная тромбоцитопатия. Во-вторых, отмечается тенденция к замедлению морфологического созревания эндометрия: в группе с НТ средняя стадия секреции, необходимая для имплантации бластоцисты, отмечалась более чем в 2 раза чаще, чем в подгруппе 1А с НТ, а морфологические изменения, соответствующие стадии пролиферации, при которой имплантация бластоцисты невозможна, на 12% чаще. Кроме того, в данной подгруппе статистически значимо чаще встречались очаги склероза и дисциркуляторные расстройства в эндометриальной строме. Данные этого исследования сопоставимы с ранее опубликованными в наших предыдущих работах [8, 15].

Кроме того, отмечается нарушение адгезии и имплантации бластоцисты, о чем косвенно свидетельствует понижение экспрессии LIF и остеопонтина особенно существенно, что уменьшает накопление данных маркеров в пиноподиях.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Д.Т.А., К.Е.А.

Сбор и обработка материала — Д.Т.А., К.Д.Ю., З.А.С.

Статистическая обработка — З.А.С.

Написание текста — Д.Т.А., З.А.С.

Редактирование — К.Е.А., Д.Т.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Демура Татьяна Александровна — д-р мед. наук, проф. каф. патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова; https://orcid.org/ 0000-0002-6946-6146; e-mail: uursula90@gmail.com; demura-t@yandex.ru