Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Имянитов Е.Н.

НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург

Выявление мутаций в гене BRAF для выбора терапии мела-номы

Авторы:

Имянитов Е.Н.

Подробнее об авторах

Журнал: Архив патологии. 2012;74(5): 65‑71

Просмотров: 6775

Загрузок: 148


Как цитировать:

Имянитов Е.Н. Выявление мутаций в гене BRAF для выбора терапии мела-номы. Архив патологии. 2012;74(5):65‑71.
Imianitov EN. BRAF mutation testing for the choice of melanoma treatment. Russian Journal of Archive of Pathology. 2012;74(5):65‑71. (In Russ.)

Эпидемиология меланомы

Меланома составляет не более 4% всех новообразований кожи, но на ее долю приходится примерно 80% случаев летальных исходов в онкодерматологии. В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности. Заболеваемость меланомой колеблется от ~1 до 55 случаев на 100 тыс. человек в год, в зависимости от географического расположения, поведенческих особенностей и расовой принадлежности изучаемой популяции. Индивидуальный риск данной патологии в развитых странах с преимущественно белым населением составляет около 2%. Пациенты с меланомой примерно на 10 лет моложе других онкологических больных: средний возраст на момент диагноза находится в интервале 50—55 лет. Меланома характеризуется весьма агрессивным течением и резистентностью к стандартной цитостатической терапии, поэтому 5-летняя выживаемость больных с метастатическим процессом не превышает 10—15% [30].

Заболеваемость меланомой проявляет устойчивую тенденцию к росту. Если рассматривать встречаемость меланомы в целом, то наибольшее число случаев, по-видимому, обусловлено эпизодической экспозицией представителей белой расы к большим дозам ультрафиолетового (UV) облучения. В процессе эволюции кожа человека освободилась от шерстяного покрова и поэтому выработала защитные барьеры, позволяющие снизить мутагенный эффект UV-облучения. В частности, у родоначальников человечества — представителей негроидной расы — кожа содержит «активный» вариант защитного пигмента, меланина. Меланин вырабатывается меланоцитами и проникает в расположенные по соседству кератиноциты. Данное вещество играет роль хромофора — оно абсорбирует на себя ультрафиолетовые лучи и свободные радикалы. Меланин встречается в различных изоформах, что, по крайней мере отчасти, обусловлено полиморфизмом рецептора меланокортина (MC1R). Исходный тип данного рецептора, продуцирующий т.н. эумеланин, обладает высокой способностью к поглощению ультрафиолета. В процессе миграции из Африки в северные регионы преимущество в отборе стали получать люди, способные усваивать достаточное количество ультрафиолета даже в странах с низкой солнечной инсоляцией — так возникла разновидность рецептора меланокортина, продуцирующая другую, неспособную к эффективной абсорбции УФ-лучей разновидность меланина — феомеланин [22].

Развитие человеческой цивилизации в последние 2—3 столетия сопровождалось массовым перемещением людей в непривычные климатические пояса. Неудивительно, что одним из главных последствий подобных переселений стало резкое увеличение частоты опухолей кожи. Так, если у проживающих в США негров встречаемость меланомы на 100 тыс. человек в год составляет примерно 1 случай, то аналогичный показатель для представителей европеоидной расы находится в пределах 20—30 [http://seer.cancer.gov/statfacts/html/melan.html]. Примечательно, что заболеваемость меланомой слизистых оболочек, патогенез которой не связан с солнечной инсоляцией, является примерно одинаковой у представителей всех рас [32].

Однако главенствующую роль в росте частоты меланомы играет не столько эмиграция, сколько появившаяся с развитием авиации возможность регулярно посещать солнечные курорты и подвергаться интенсивному загоранию [18]. Например, в большинстве развитых стран Европы заболеваемость меланомой в конце прошлого века составляла 10—20 случаев на 100 тыс. человек в год, а в относительно бедных Белоруссии, Латвии, Литве, Сербии — не более 3. Интересно, что единственной профессиональной категорией людей, у которых увеличен риск меланомы, являются летчики и стюардессы — предполагается, что именно эти индивидуумы имеют наибольшие возможности для эпизодического интенсивного загорания [28]. Риск меланомы может заметно увеличиваться при злоупотреблении соляриями [12].

До 5% пациентов с меланомой сообщают о кровных родственниках, переболевших этим же заболеванием, — таким образом, соответствующий семейный анамнез является существенным фактором риска. Резкое повышение вероятности развития меланомы также отмечается у тех людей, которые уже переболели данной патологией. Это связано с тем, что среди пациентов наблюдается повышенное количество индивидуумов с неблагоприятным генотипом или историей избыточного UV-облучения [16, 28].

Заболеваемость меланомой ассоциирована с присутствием на коже множественных невусов. Наибольшая вероятность возникновения меланомы наблюдается у людей с бледными оттенками кожи, особенно у блондинов и рыжеволосых. Как упоминалось выше, решающим фактором риска развития меланомы является эпизодическое облучение интенсивными дозами ультрафиолета; в наибольшей мере роль опасных спектров солнечных лучей проявляется у тех индивидуумов, которые подверглись избыточной инсоляции в детском возрасте. Примечательно, что заболеваемость меланомой несколько выше у лиц с высоким социально-экономическим статусом — по-видимому, это связано с расширенными возможностями к путешествиям и посещению соляриев [5, 28].

Разновидности меланом

Меланома характеризуется значительной гетерогенностью молекулярного портрета, причем профиль генетических нарушений строго коррелирует с особенностями этиопатогенеза заболевания [10, 23]. Принято различать 5 основных групп меланом:

1) опухоли, возникшие на участках кожи, подвергавшихся хроническому солнечному облучению; эти новообразования характеризуются активацией генов клеточного цикла (cyclin D1, CDK4);

2) опухоли, развившиеся на скрываемых одеждой участках кожи; в данной категории меланом часто наблюдается активация сигнального каскада RAS-RAF-MEK-ERK, например за счет мутаций в генах NRAS и BRAF (рис. 1);

Рисунок 1. Пролиферативный сигнальный каскад, вовлеченный в молекулярный патогенез меланомы.

3) новообразования кистей и стоп, возникшие в переходных зонах эпителия; в них часто наблюдается активация рецептора KIT (рис. 1);

4) меланомы слизистых оболочек; для этой редкой категории новообразований также характерна активация рецептора KIT (рис. 1);

5) меланомы сетчатки, характеризующиеся мутациями в генах GNA11 и GNAQ.

BRAF как терапевтическая мишень

Онкоген BRAF кодирует молекулу, участвующую в передаче пролиферативного сигнала с мембранных тирозинкиназных рецепторов к ядру (рис. 1). Семейство киназ RAF представлено несколькими генами — ARAF, BRAF и CRAF. В нормальных тканях доминирующая роль в передаче сигналов принадлежит, по-видимому, CRAF. Тем не менее, активирующие мутации в опухолях поражают преимущественно BRAF; в этом случае именно BRAF становится главенствующим звеном соответствующего сигнального каскада, оттесняя CRAF на второй план. Изменения последовательности BRAF как правило затрагивают 600-й кодон и встречаются примерно в 50% меланом, в заметной доле случаев папиллярных опухолей щитовидной железы, а также в небольшом проценте новообразований толстой кишки, легкого и т.д. В то время как нормальный BRAF активируется только при поступлении сигнала от расположенного выше белка семейства RAS, повреждения гена BRAF приводят к автономной активации этой серин-треониновой киназы. В результате BRAF безостановочно передает стимулы к киназам MEK и ERK, которые играют ключевую роль в запуске процессов клеточного деления [11, 31].

Генетические повреждения BRAF стали вызывать огромный интерес в связи с появлением специфических ингибиторов мутированной изоформы упомянутого белка (PLX4032, GSK2118436). Наиболее изученным агентом этого класса является препарат вемурафениб (vemurafenib, PLX4032, Zelboraf). Терапевтическое использование данной молекулы приводит к уменьшению размеров меланомных очагов практически у всех пациентов, опухоль которых содержит мутацию, и сопровождается заметным увеличением времени до прогрессирования заболевания и общей выживаемости [8, 17, 38]. Столь выраженная клиническая эффективность Зелборафа в отношении практически некурабельной категории опухолей привела к его быстрой регистрации в США [http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/202429s000lbl.pdf] и Европе [http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Product_Information/human/002409/WC500124317.pdf].

Необходимость отбора пациентов на лечение селективными ингибиторами мутированного BRAF

Вся совокупность предклинических и клинических данных указывает на то, что эффект селективных ингибиторов мутированной киназы BRAF ограничивается только теми пациентами, опухоль которых содержит мутацию [17]. Более того, воздействие этих же молекул на клетки с интактным BRAF сопровождается парадоксальной активацией каскада RAS-RAF-MEK-ERK; биохимические причины подобного феномена являются предметом интенсивных исследований [20, 21, 34]. Именно с таким неожиданным эффектом связывают наиболее необычный побочный эффект вемурафениба — появление плоскоклеточных карцином и, в редких случаях, меланома-подобных образований [17, 41]. Предполагается, что ошибочное назначение ингибиторов мутантного BRAF пациентам с нормальным внутриопухолевым статусом данного гена может сопровождаться ускорением роста меланомы!

Спектр мутаций BRAF

Развитие методов анализа последовательности ДНК позволило протестировать статус гена BRAF в десятках тысяч новообразований [http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=bygene&ln=BRAF&start=1&end=767&coords=AA:AA]. В целом, мутации могут поражать различные области гена, однако подавляющее большинство из них затрагивает 600-й кодон [3]. До недавнего времени считалось, что доминирующей мутацией является 1799T>A, приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту (V600E). Примечательно, что единственная зарегистрированная для медицинского применения тест-система (Сobas 4800 BRAF V600 Mutation Test, http://molecular.roche.com/assays/Pages/cobas4800BRAFV600MutationTest.aspx) способна надежно распознавать лишь этот вариант мутации. Относительно недавние исследования установили, что до 20% замен в 600-м кодоне могут быть представлены другими вариантами — V600K (валин на лизин), V600R (валин на аргинин), V600D (валин на аспарагиновую кислоту) и V600M (валин на метионин) (табл. 1)

[1, 27, 29]. Клиническая эффективность ингибиторов BRAF пока убедительно доказана только для одной из «минорных» мутаций — V600K — хотя есть целый ряд оснований предположить чувствительность к лечению по крайней мере для некоторых (если не для всех) оставшихся вариантов мутированного BRAF [8, 36].

Проблема внутриопухолевой гетерогенности статуса BRAF

Аномалии этого онкогена могут обнаруживаться еще на стадии диспластического невуса; это свидетельствует о том, что самой по себе активации BRAF недостаточно для полной реализации злокачественного фенотипа [35]. Что же происходит с BRAF-мутированными клетками дальше, в ходе их злокачественной трансформации и метастазирования меланомы? Следует упомянуть, что вся идеология молекулярной онкологии основывается на клональном характере биологически значимых событий; подразумевается, что единожды приобретенная онкогенная мутация сохраняется во всех участках опухолевой ткани. Одним из наиболее неожиданных наблюдений последних лет представляется убедительная, хорошо воспроизводимая демонстрация внутриопухолевой гетерогенности меланомы в отношении статуса гена BRAF. Например, множественные биопсии разных участков одной и той же первичной опухоли зачастую приводят к получению дискордантных результатов анализа мутаций BRAF. Более того, повреждения BRAF могут не только приобретаться в процессе метастазирования (что вполне соответствует классическим представлениям о генетической эволюции опухолевого клона), но и утрачиваться при диссеминации клеток меланомы! Предполагается, что некоторые меланомы являются смесью BRAF-интактных и BRAF-мутированных опухолевых клонов [9, 25, 40].

Изложенные выше данные ставят новые, пока неразрешенные вопросы перед молекулярной диагностикой. Современные стандарты генетического анализа меланом подразумевают исследование всего одного биологического образца, вне зависимости от давности и анатомического места забора опухолевого материала. Сведения о молекулярной гетерогенности меланом указывают на возможную целесообразность повторных и множественных биопсий, представленных как первичной опухолью, так и метастатическими очагами. Еще более сложной является проблема выбора терапевтического решения в случае дискордантности статуса BRAF; следует напомнить, что назначение специфических ингибиторов BRAF может сопровождаться не только регрессом мутированных клонов опухоли, но и стимуляцией клеток меланомы с интактным BRAF.

Мутации BRAF и клинические характеристики меланом

Мутации в гене BRAF наблюдаются преимущественно в новообразованиях, возникающих на необлученных участках кожи. Тем не менее, из BRAF-тестирования не следует исключать опухоли с облучаемых участков кожи и слизистых, а также меланомы переходных зон эпидермиса — эти разновидности новообразований характеризуются весьма заметной частотой активации BRAF [24, 37]. Напротив, мутации BRAF почти никогда не встречаются в меланомах внутренних слизистых покровов, а также в опухолях сетчатки [14, 39].

Мутации BRAF могут быть ассоциированы с целым рядом клинических особенностей опухолей. Например, BRAF-мутированные меланомы чаще возникают у относительно молодых пациентов, отличаются частым метастазированием в лимфатические узлы и более агрессивным характером течения заболевания [3, 4, 6, 26].

Методы выявления мутаций BRAF

В качестве субстрата для молекулярно-генетического исследования выступают непосредственно трансформированные клетки — именно они содержат мутацию в гене BRAF. Поэтому одним из наиболее существенных условий получения правильного результата является качественная макро- или микродиссекция опухолевой ткани, позволяющая избежать значительной контаминации образца нормальными клетками. Наиболее удобным материалом для анализа служат обычные архивные биообразцы, зафиксированные в формалине и залитые в парафин. Следует прокомментировать, что неоправданно длительная фиксация ткани или использование незабуференного формалина могут приводить к необратимой деградации ДНК. К сожалению, именно меланомы являются наиболее трудным объектом для молекулярного анализа: считается, что высокое содержание меланина может затруднять амплификацию ДНК-фрагментов посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) [13]. Впрочем, это препятствие как правило успешно преодолевается простым разведением образца ДНК [19].

Практически любое молекулярное исследование предусматривает накопление ПЦР-продукта, содержащего 600-й кодон гена BRAF. Относительно недавно некоторые специалисты стали использовать модификацию ПЦР — т.н. COLD-ПЦР (co-amplification at lower denaturation temperature PCR; ко-амплификация при пониженных температурах денатурации); в данном случае ПЦР-протокол предусматривает небольшое снижение температуры плавления ДНК-фрагментов, что приводит к предпочтительной денатурации гетеродуплексов, и, как следствие, обогащению реакции мутированными последовательностями. Считается, что COLD-ПЦР может в определенной мере скомпенсировать недостаточное качество микродиссекции опухолевых клеток или выявить мутированную копию гена в новообразованиях с гетерогенным статусом BRAF [33].

Последнее время необыкновенную популярность приобрел метод HRM (high-resolution melting; высокоточный анализ кинетики плавления ДНК-фрагментов), позволяющий быстро и эффективно получать предварительные результаты о наличии или отсутствии мутации в исследуемом гене. Данный подход предусматривает медленное контролируемое нагревание двуцепочечных ДНК-фрагментов. Если в анализируемом гене присутствует мутация, то при соблюдении определенных условий ПЦР-продукты будут содержать гетеродуплексы, содержащие как минимум одну некомплементарную пару нуклеотидов. Подобные гетеродуплексы будут денатурироваться при чуть более низкой температуре, чем нормальные фрагменты ДНК; приборы, обладающие функцией HRM, способны выявлять эту разницу и таким образом отбирать аномальные последовательности для дальнейшего тестирования [33].

«Золотым стандартом» молекулярного анализа считается секвенирование ДНК. Этот метод основан на синтезе комплементарной ДНК-цепи на исследуемой одноцепочечной ДНК-матрице. Реакционная смесь содержит модифицированные терминирующие нуклеотиды, каждый из которых (аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и тимин (Т)) метится собственным флуоресцентным красителем. Электрофоретическое разделение ДНК позволяет определить идентичность терминирующего нуклеотида в каждом из синтезированных фрагментов, т.е. распознать фактическую нуклеотидную последовательность анализируемого ПЦР-продукта. Популярной модификацией классического автоматизированного секвенирования является т.н. пиросеквенирование. При выполнении этой методики каждый из нуклеотидов (А, Г, Т и Ц) поступает в реакционную смесь последовательно; в случае добавления «правильного» (комплементарного) нуклеотида происходит удлинение синтезируемого фрагмента на 1 звено, что сопровождается продукцией хемолюминесцентного сигнала. Считается, что пиросеквенирование обладает несколько большей способностью выявлять мутированный фрагмент в присутствии нормальных ДНК-последовательностей. Поистине революционным событием в биомедицине стала разработка технологии массивного параллельного секвенирования (massively parallel sequencing), которую часто называют секвенированием нового поколения (next-generation sequencing). Данный метод предусматривает многократное (100—500 раз) считывание одной и той же нуклеотидной последовательности, причем возможности соответствующих приборов допускают одновременный анализ миллиардов оснований ДНК. Подобные характеристики позволяют выполнять углубленный анализ биологического материала, в частности выявлять единичные мутированные клетки в присутствии громадного избытка (>99%) нормальных тканей. Помимо этого, массивное параллельное секвенирование предоставляет возможность выполнять одновременный анализ десятков генов в десятках биологических образцов [2, 15, 19].

Альтернативным секвенированию является метод аллель-специфической ПЦР. Его принцип заключается в использовании праймеров, специфических к нормальной и определенным мутантным последовательностям гена (рис. 2).

Рисунок 2. Принцип аллель-специфической ПЦР. В случае полной комплементарности праймера ДНК-матрице происходит накопление ПЦР-продукта (а); при несоответствии вариабельного нуклеотида эффективность ДНК-амплификации заметно снижается (б).
В случае полной комплементарности праймера ДНК-матрице (норма/норма или мутант/мутант) происходит накопление ПЦР-продукта; при несоответствии вариабельного нуклеотида эффективная ДНК-амплификация считается невозможной (рис. 2, 3).
Рисунок 3. Пример выявления мутации в гене BRAF посредством аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с использованием красителя SYBR Green. Кривые на графиках отражают динамику накопления ПЦР-продукта в реакциях с праймерами, соответствующими нормальной или мутированной последовательности ДНК.
Аллель-специфическая ПЦР была изобретена более 20 лет назад, однако получение достоверных результатов стало возможным только после появления технологий мониторинга синтеза ПЦР-продукта в режиме реального времени (real-time PCR). Принцип аллель-специфической ПЦР лежит в основе большинства коммерческих наборов, в частности Сobas 4800 BRAF V600 Mutation Test. Данная методика позволяет достоверно выявлять только те нуклеотидные замены, которые предусмотрены дизайном теста (например, только 1799T>A в случае Сobas). Аллель-специфическая ПЦР способна идентифицировать единичные мутированные копии гена в присутствии избытка нормальных последовательностей [2, 15, 19]. Недостатками метода являются относительно высокие требования к качеству исходного образца ДНК, а также определенный риск получения недостоверных или неинтерпретируемых результатов.

Относительно недавно в распоряжении морфологов появились антитела, специфические в отношении мутированной изоформы белка BRAF [7]. Единственным преимуществом иммуногистохимического метода определения мутаций BRAF является возможность его выполнения в обычной патоморфологической лаборатории. Однако, достоверность и межлабораторная воспроизводимость результатов, получаемых при использовании BRAF-антител, заметно уступает аналогичным показателям ДНК-анализа. Учитывая исключительную важность BRAF-теста, а также возможность транспортировки блоков в централизованные лаборатории для выполнения исследования, подмена молекулярно-генетического анализа иммуногистохимической процедурой представляется неприемлемой.

В табл. 2

систематизированы основные сведения о характеристиках методов, используемых при определении статуса BRAF.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail



Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.