PD-L1 и PD-L2 (Programmed (cell) Death Ligand 1 and 2) — лиганды программируемой клеточной гибели 1 и 2 [1, 2] относятся к семейству белков B7 [1]. Лиганды связываются с рецептором PD-1 (Programmed (cell) Death 1, белок программируемой клеточной гибели 1), который неотъемлемо экспрессируется на поверхности T-лимфоцитов и B-лимфоцитов при их активации антигеном и играет роль в дифференцировке иммунных клеток [3]. PD-1 участвует в отрицательной регуляции иммунной системы путем предотвращения активации T-лимфоцитов, что снижает аутоиммунность и повышает аутотолерантность. Экспрессия PD-L наблюдается в норме на поверхности клеток жизненно важных органов, в том числе сердца, легких, почек и др.

Экспрессия PD-L1 была обнаружена в клетках некоторых опухолей, в связи с чем высказано предположение о возможной роли PD-1/PD-L-сигнального пути в ускользании опухолевых клеток из-под иммунного надзора и вместе с тем гипотеза о возможности терапевтического применения специфических антител-блокаторов при ряде злокачественных новообразований.

Способность некоторых опухолей экспрессировать на своей поверхности лиганды PD-1 представляет собой самостоятельный механизм опухолевой иммунорезистентности. Экспрессия PD-L1 была показана в клетках многих солидных опухолей человека, в том числе в опухолях легкого, молочной железы, урогенитального и желудочно-кишечного трактов, в клетках меланомы и глиобластомы, при ряде гематологических злокачественных новообразований. На сегодняшний день в России зарегистрировано пять противоопухолевых препаратов, блокирующих PD-1/PD-L1-сигнальный путь, два из которых (ниволумаб и пембролизумаб) представляют собой гуманизированные моноклональные антитела к рецептору PD-1, а три (атезолизумаб, дурвалумаб и авелумаб) — гуманизированные моноклональные антитела к его лиганду PD-L1. Для каждого противоопухолевого препарата валидированы свои клоны и тест-системы (табл. 1).

Таблица 1. Ингибиторы PD-1/PD-L1 и тест-системы для сопровождающей и комплементарной диагностики экспрессии PD-L1

Активно изучается возможная связь экспрессии PD-L1 с эпидемиологическими, клинико-морфологическими и молекулярно-генетическими особенностями рака желудка. В частности, C. Böger и соавт. [4] среди 465 представителей европеоидной расы наблюдали корреляцию экспрессии PD-L1 с позитивным HER2-статусом, наличием маркеров вируса Эпштейна—Барр и микросателлитной нестабильности (MSI).

При изучении аденокарциномы желудка в рамках проекта «Атлас ракового генома» (The Cancer Genome Atlas, TCGA) группой ученых среди EBV-ассоциированных опухолей была обнаружена амплификация участков короткого плеча 9-й хромосомы (9p24.1) в локусе, кодирующем PD-L1 и PD-L2, несвойственная для других подтипов. Определение мРНК показало повышенную экспрессию PD-L1 и PD-L2 при наличии амплификации. В данной когорте не оценивались различия в выживаемости [5].

В свою очередь, специалисты The Asian Cancer Research Group (ACRG) в 2015 г. при изучении PD-L1-статуса среди выделенных подтипов также отметили высокую частоту экспрессии среди опухолей с микросателлитной нестабильностью и EBV-ассоциированных опухолей [6]. В дальнейшем B.H. Sohn и соавт. [7], F. Di Pinto и соавт. [8] и J.-Y. Yoon и соавт. [9] также наблюдали, что экспрессия PD-L1 установлена преимущественно среди EBV-ассоциированных опухолей и опухолей с MSI. По наблюдениям B.H. Sohn [7], EBV-ассоциированные опухоли характеризуются наилучшим прогнозом, выраженная воспалительная инфильтрация опухолевой ткани является одной из характерных гистологических особенностей EBV-ассоциированных раков желудка, это свидетельствует о высокой иммуногенности EBV, и считается, что именно такое свойство определяет хороший прогноз [9].

Несмотря на отмеченные авторами корреляции, ни в одной работе предметно не изучалась экспрессия PD-L1 в EBV-ассоциированном раке желудка, не оценивалась ее связь с клинико-морфологическими параметрами и прогнозом. Таким образом, PD-L1 является перспективным предиктивным маркером при раке желудка, однако вопросы, касающиеся его экспрессии в EBV-ассоциированных карциномах, изучены недостаточно.

Цель исследования — оценить частоту выявления экспрессии PD-L1 в EBV-ассоциированных аденокарциномах желудка, уточнить связь экспрессии PD-L1 с клинико-морфологическими характеристиками и ее влияние на прогноз заболевания.

Материал и методы

В исследовании использованы образцы операционного материала от 127 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка. Средний возраст пациентов составил 62 года (минимальный 22 года; максимальный 82 года).

Каждый образец был окрашен методом гибридизации in situ с использованием праймеров к малым вирусным РНК вируса Эпштейна—Барр (INFORM EBER, Roche Ventana, США) и системы визуализации ISH iVIEW Blue Detection Kit (Roche Ventana, США). Реакции гибридизации in situ осуществлялись по технологии Ventana BenchMark Ultra.

Результаты реакций оценивали в соответствии с общепринятыми стандартами [10, 11]. Реакцию считали положительной, если сигнал EBER был локализован в ядре опухолевых клеток, но при этом отсутствовало цитоплазматическое окрашивание, за исключением случаев митоза, при которых ядерная мембрана утрачивает свою целостность [10]. При каждой постановке реакций в обязательном порядке использовали положительный контроль в виде тканевого образца EBV-ассоциированной назофарингеальной карциномы.

Постановку реакций с PD-L1 осуществляли с помощью прибора Ventana BenchMark Ultra (Roche Ventana, США) по стандартному протоколу не позднее чем через 24 ч после изготовления парафиновых срезов. В качестве контроля для иммуногистохимических реакций использованы ткани миндалины и плаценты. Антителами к PD-L1 SP263 были окрашены все 127 образцов, антителами к PD-L1 SP142 — 113 образцов.

Критерием для позитивного PD-L1-статуса опухоли выбрано полное или частичное мембранное окрашивание не менее 1% опухолевых и иммунных клеток, расположенных в толще опухоли или не далее 1 мм от границы опухоли. В подсчет включали как опухолевые, так и иммунные клетки (использовали показатель Combined Positive Score — CPS [12]). Допускалось наличие гранулярного или зернистого окрашивания по ходу мембраны клетки. Процент окрашенных клеток подсчитывали отдельно для каждого из полей зрения и выводили среднее значение для всего препарата. Для удобства сравнения результаты оценки реакции отображали в баллах: 0 — полное отсутствие реакции, 1 — CPS 1% клеток или менее, 2 — CPS более 1%, но менее 10%, 3 — CPS более 10%, но менее 50%, 4 — CPS более 50%. К положительному PD-L1-статусу относили случаи с экспрессией на уровне 2—4 баллов.

Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. При этом результаты со степенью злокачественности по классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2019 г. из анализа были исключены перстневидноклеточные раки, они не подлежат этой градации.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием анализа таблиц сопряженности, критерия χ², непараметрических критериев для парного и множественного сравнений, анализа выживаемости по Каплану—Мейеру, логрангового критерия, многофакторного анализа выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Statistica 10, StatSoft, Inc., США).

Результаты и обсуждение

По результатам идентификации EBER в опухолевых клетках из 127 исследованных случаев рака желудка 15 (11,8%) случаев оказались EBER-положительными и 112 (88,2%) — EBER-отрицательными.

Среди EBER-позитивных случаев число наблюдений с положительным PD-L1-статусом (SP263) составило 15 (100%) из 15, а число наблюдений с положительным PD-L1-статусом (SP142) — 10 (76,9%) из 13. При этом в группе EBER-негативных карцином число наблюдений с положительным PD-L1-статусом (SP263) было 26 (23,2%) из 112, а с положительным PD-L1-статусом (SP142) — 13 (13%) из 100. При статистической обработке получены значимые различия по экспрессии PD-L1 (SP263, SP142) между EBER-позитивными и EBER-негативными карциномами. Таким образом, положительный PD-L1-статус (SP263, SP142) значимо чаще выявлялся в EBER-позитивных карциномах желудка (p<0,001), что соответствует данным литературы. Подробное распределение экспрессия маркеров в зависимости от EBER-статуса представлено в табл. 2 и на рис. 1.

Таблица 2. Уровень экспрессии PD-L1 (SP142, SP263) в сопоставлении с EBER-статусом

Примечание. В скобках указан процент.

Рис. 1. Различия аденокарцином желудка по экспрессии PD-L1 в сопоставлении с EBER-статусом.

Экспрессия PD-L1 (SP263) в EBER-позитивных карциномах желудка и ее связь с клинико-морфологическими параметрами

Все 15 (100%) наблюдений EBER-позитивных карцином демонстрировали положительный PD-L1-статус (SP263), данные случаи обозначены как группа PD-L1 (SP263)+/EBER+ (рис. 2а—2в): 4 случая с экспрессией более 1%, но менее 10% клеток (CPS 2 балла); 7 случаев с экспрессией более 10%, но менее 50% клеток (CPS 3 балла); 4 случая с экспрессией более 50% клеток (CPS 4 балла).

Рис. 2. Экспрессия PD-L1 в EBV-ассоциированных карциномах желудка.

а — экспрессия PD-L1 SP263 в низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме желудка (CPS >50%, 4 балла, положительная); б — экспрессия PD-L1 SP142 в низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме желудка (CPS >50%, 4 балла, положительная); в — экспрессия EBER в низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме желудка; г — экспрессия PD-L1 SP263 в дискогезивном раке желудка (10%>CPS>1%, 2 балла, положительная); д — экспрессия PD-L1 SP142 в дискогезивном раке желудка (CPS <1%, 1 балл, отрицательная); е — экспрессия EBER в дискогезивном раке желудка.

а, б, г, д — иммуногистохимическая реакция, ×200; в, е — выявление EBER методом гибридизации in situ, ×200.

В данной группе средний возраст пациентов составил 56,3 года, наблюдалась преимущественно проксимальная локализация опухолей (12 случаев из 15), язвенная форма роста 2-го и 3-го типа по R. Bormann (12 наблюдений — язвенная форма, 3 — экзофитная форма роста). Преобладающим гистологическим типом был тубулярный (14 (93,3%) наблюдений из 15,), лишь 1 случай относился к дискогезивному подтипу. Распределение по стадиям следующее: 2 (13,3%) случая — I стадия, 7 (46,7%) — II стадия, 4 (26,7%) — III стадия и 2 (13,3%) — IV стадия. Бóльшая часть опухолей относилась к промежуточному подтипу по P. Lauren (11 (73,3%) наблюдений), лишь в 3 (20%) случаях был кишечный подтип и в 1 (6,7%) — диффузный.

При сравнении группы PD-L1 (SP263)+/EBER+ с группами PD-L1 (SP263)+/EBER– и PD-L1 (SP263)–/EBER– выявлены значимые различия по возрасту и полу: в первой группе возраст пациентов значимо ниже, чем в двух других (p=0,013), а пол пациентов преимущественно мужской (p<0,017). Других различий между группами PD-L1+/EBER+ и PD-L1+/EBER– по клинико-морфологическим параметрам не обнаружено. Есть тенденция к различиям между группами PD-L1+/EBER+ и PD-L1–/EBER– по макроскопической форме, гистологическому типу (ВОЗ, 2019) и типу по P. Lauren (в группе PD-L1+/EBER+ чаще встречается тубулярный гистологический тип, язвенная форма роста и промежуточный подтип по P. Lauren), однако данные различия статистически незначимы.

Подробные данные по клинико-морфологическим параметрам в группах приведены в табл. 3.

Таблица 3. Клинико-морфологические характеристики рака желудка в группах с различной экспрессией PD-L1 (SP263), PD-L1 (SP142) и EBER

Примечание. *КЛС — карцинома с лимфоидной стромой.

Экспрессия PD-L1 (SP142) в EBER-позитивных карциномах желудка и ее связь с клинико-морфологическими параметрами

Среди 13 наблюдений EBER-позитивных карцином, окрашенных антителами к PD-L1 (SP142), в 10 случаях выявлен положительный PD-L1-статус (SP142), данные случаи обозначены как группа PD-L1 (SP142)+/EBER+: 7 случаев с экспрессией более 1%, но менее 10% клеток; 2 случая с экспрессией более 10%, но менее 50% клеток; 1 случай с экспрессией более 50% клеток. Следует отметить, что положительный PD-L1-статус по двум маркерам — PD-L1 (SP142) и PD-L1 (SP263) наблюдался у одних и тех же пациентов, за исключением трех. В 3 наблюдениях, когда PD-L1-статус (SP263) был оценен как положительный (более 1% в одном случае и более 10% в двух случаях), уровень экспрессии PD-L1 (SP142) был ниже 1% и статус оценен как отрицательный (рис. 2—2е). Более того, в целом уровень экспрессии PD-L1 (SP142) был ниже, чем PD-L1 (SP263): среди всех случаев с положительным PD-L1-статусом (SP263) преобладают наблюдения (11 из 15), когда экспрессия превышает 10% клеток; при этом положительный PD-L1-статус (SP142) чаще характеризуется реакцией 1—10% клеток (8 случаев из 11).

В группе PD-L1 (SP142)+/EBER+ средний возраст пациентов составил 55,6 года, при этом наблюдалась преимущественно проксимальная локализация опухолей (9 случаев из 10), язвенная форма 2-го и 3-го типа по R. Bormann (7 наблюдений — язвенная форма, 3 — экзофитная форма роста). Все опухоли относились к тубулярному гистологическому подтипу. Распределение по стадиям следующее: 1 (10%) случай — I стадия, 8 (80%) — III стадия и 1 (10%) — IV стадия. Бóльшая часть опухолей относилась к промежуточному подтипу по P. Lauren (9 (90%) наблюдений), лишь 1 случай относился к кишечному подтипу.

Таким образом, клинико-морфологическая характеристика наблюдений в группе PD-L1 (SP263)+/EBER+ и PD-L1 (SP142)+/EBER+ полностью совпадает, что является закономерным следствием экспрессии маркеров у одной группы пациентов. Подробные данные по клинико-морфологическим параметрам в группах приведены в табл. 3.

При сравнении группы PD-L1 (SP142)+/EBER+ с группой PD-L1 (SP142)+/EBER– выявлены существенные различия по возрасту и полу. В группе PD-L1 (SP142)+/EBER+ средний возраст составил 55,6 года, что значимо меньше, чем в группе PD-L1 (SP142)+/EBER– (69,7 года; p=0,006). В группе PD-L1 (SP142)+/EBER+ преобладали пациенты мужского пола (p<0,017) и проксимальная локализация опухолей. Других различий между группами PD-L1+/EBER+ и PD-L1+/EBER– по клинико-морфологическим параметрам не обнаружено. Есть тенденции к различиям между группами PD-L1(SP142)+/EBER+ и PD-L1(SP142)–/EBER– по макроскопической форме, гистологическому типу (ВОЗ, 2019) и типу по P. Lauren (в группе PD-L1+/EBER+ чаще встречаются тубулярный гистологический тип, язвенная форма роста и промежуточный подтип по P. Lauren), однако данные различия статистически незначимы.

В целях уточнения различий в выживаемости пациентов разных групп были рассчитаны медианы выживаемости (табл. 4). Также был проведен анализ 5-летней выживаемости пациентов по Каплану—Мейеру (рис. 3).

Таблица 4. Средние значения и медианы выживаемости пациентов для групп PD-L1/EBER

Рис. 3. Анализ выживаемости пациентов в зависимости от PD-L1-статуса и EBER-статуса.

Установлено, что медиана выживаемости в группах с положительным PD-L1-статусом при EBV-ассоциированных аденокарциномах желудка выше, чем при отрицательном PD-L1-статусе как для маркера PD-L1 (SP142), так и для маркера PD-L1 (SP263). Также обращает на себя внимание, что спустя 3 года после постановки диагноза выживаемость в группе PD-L1 (SP263)+/EBER+ явно превышает показатели других групп (см. рис. 2а), при этом в группе PD-L1 (SP142)+/EBER+ данный феномен не наблюдается. Статистически достоверных различий по выживаемости между группами не обнаружено, что может быть следствием малого количества наблюдений.

Дополнительно был проведен многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса и установлено, что PD-L1-статус в EBV-ассоциированном раке желудка не является значимым прогностическим признаком (HR=0,671; ДИ 0,501—0,898). Это свидетельствует о том, что отдельно взятый PD-L1-статус не оказывает существенного влияния на прогноз у пациентов с раком желудка.

Заключение

Положительный PD-L1-статус (SP263, SP142) значимо чаще выявляется в EBV-ассоциированных карциномах желудка. Установлено, что пациенты с положительным PD-L1-статусом в EBV-ассоциированных карциномах желудка отличаются более молодым возрастом, принадлежностью к мужскому полу, проксимальной локализацией опухолей, наличием язвенной формы роста. Бóльшая часть этих опухолей относятся к тубулярным ракам. Данные характеристики не зависят от исследованного клона антител: положительный PD-L1-статус SP142 и SP 263 выявляется у одних и тех же пациентов, за небольшим исключением.

Не выявлены статистически достоверные различия в выживаемости между группами, а отдельно взятый PD-L1-статус не оказывает значимого влияния на прогноз у пациентов с раком желудка, в том числе в группе EBV-ассоциированных карцином.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда №20-75-00037.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова, П.Г. Мальков

Сбор и обработка материала — Д.В. Калинин, А.В. Чайка, В.М. Хомяков, В.В. Какоткин, Д.В. Вычужанин

Статистическая обработка данных — Н.В. Данилова, Т.Н. Сотникова

Написание текста — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Редактирование — Ю.Ю. Андреева, П.Г. Мальков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.