Ишемические поражения нижних конечностей занимают важное место в структуре сердечно-сосудистой заболеваемости. Распространенность этого заболевания среди населения старше 50 лет составляет 5-8%, а при наличии таких факторов риска, как гиперлипидемия, курение, артериальная гипертензия или сахарный диабет достигает 30% [18]. Перемежающейся хромотой страдает около 5% лиц пожилого возраста в Российской Федерации, т.е. около 2 млн человек [3]. У 50% больных заболевание может протекать бессимптомно, 40% страдают от перемежающейся хромоты, у 5-10% развивается критическая ишемия [22]. Таким образом, количество больных, нуждающихся в постоянном специализированном лечении и наблюдении, в РФ составляет около 1 млн. Прогрессирование хронической ишемии нижних конечностей приводит к ампутации с той же частотой, что 30 лет назад [20, 22].

Несмотря на бурное развитие сосудистой хирургии за последние три десятилетия, внедрение новых технологий в лечении больных облитерирующим атеросклерозом (эндоваскулярная ангиопластика и стентирование), общее количество хирургических вмешательств на сосудах в нашей стране невелико. По данным А.В. Покровского и В.Н. Гонтаренко [10], в 2012 г. число реконструкций в бедренно-берцовой зоне, выполненных в специализированных отделениях сосудистой хирургии, составило около 14 тыс. Л.А. Бокерия и Б.Г. Алекян [2] в отчете о состоянии сердечно-сосудистой хирургии в РФ за 2012 г. представили цифру 3745 эндоваскулярных процедур при поражении аналогичного артериального сегмента. Таким образом, за год в Российской Федерации выполняется менее 18 тыс. вмешательств при поражении артерий инфраингвинальной зоны. Еще около 10 тыс. операций выполнено, по данным тех же авторов, при поражении аортобедренного сегмента. По мнению А.В. Покровского и В.Н. Гонтаренко [10], число операций на артериях должно быть больше в десятки раз. Так, по данным Egorov и соавт. (J Vasc Surg 2010; 51: 878-885), в США за 2007 г. было выполнено 162 реконструкции артерий нижних конечностей на 100 000 населения. В РФ в 2012 г. на 100 000 населения выполнено 37 артериальных реконструкций, включая эндоваскулярные. Из всего сказанного выше можно сделать вывод, что бо'льшая часть больных хроническими облитерирующими заболеваниями нижних конечностей (ХОЗАНК) даже при критической ишемии не имеют возможности получать помощь в условиях специализированных стационаров и лечатся в условиях общехирургических отделений.

Одним из новых путей в лечении этой группы больных может быть использование генно-терапевтических технологий, направленных на индукцию и стимуляцию процесса неоангиогенеза в пораженных конечностях. Опыт зарубежных коллег и отечест­венных исследователей показывает возможности генной терапии как метода, способствующего сохранению конечности, увеличивающего дистанцию безболевой ходьбы (ДБХ) и улучшающего показатели качества жизни намного эффективнее, чем стандартная фармакотерапия [1, 4, 6, 14, 22].

В TASC второго пересмотра (2007) уделялось особое внимание положениям, касающимся генной терапии при ХОЗАНК [20]. Международное сообщество (Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease) относит подобные методики к категории перспективных способов лечения, чья эффективность при критической ишемии нижних конечностей на сегодняшний день в должной степени не доказана, а при II стадии ХОЗАНК уже имеет определенную доказательную базу [1, 8, 12]. Российские сердечно-сосудистые хирурги и ангиологи в Национальных рекомендациях по ведению пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей (2013) относят применение генно-терапевтических конст­рукций к классу доказательности IIA [9].

Концепция терапевтического ангиогенеза берет начало от инновационных работ J. Folkman [17] в 70-х годах прошлого века, который заметил, что развитие и поддержание достаточного количества микрососудов имеют важное значение для роста опухолевых тканей. Вскоре, после идентификации ангиогенных факторов роста, исследователи начали проверять гипотезу улучшения кровоснабжения в ишемизированных тканях с помощью стимуляции ангиогенеза независимо от операций на сосудах [22]. Ангиогенез - это рост новых кровеносных сосудов, являющийся важным естественным процессом, необходимым для репарации тканей и улучшения микроциркуляции при ряде заболеваний. Он начинается с индукционных сигналов на клетки эндотелия, которые приводят к их миграции в межклеточное пространство в направлении закладывающегося сосуда. Основными молекулярными факторами, инициирующими и контролирующими данный процесс, являются в большей степени различные виды сосудистых эндотелиальных факторов роста (vascular endothelial growth factor - VEGF), в меньшей степени фибропластические факторы роста (fibroblast growth factor - FGF). Таким образом, перенос генов этих факторов в клетки сосудов ишемизированной ткани может инициировать их рост и развитие [15, 16]. К настоящему времени несколько вариантов этих генов (vegf 165 и vegf 121; fgf 1 и fgf 4) прошли I и II фазы клинических испытаний в качес­тве терапевтических агентов [19, 21], причем убедительно показано, что как при ишемии конечностей, так и при ишемии миокарда препараты на основе vegf 165 безусловно лидируют по критериям как безопасности, так и эффективности [8, 11].

Наиболее безопасной и эффективной стратегией переноса нужного гена в клетки-мишени является использование невирусных систем, в частности плазмид. В клинической практике в большинстве наблюдений, раствор плазмиды вводят пациентам внутримышечно, так как ДНК имеет слабую устойчивость при контакте с кровью [5]. При любом способе введения отмечается экспрессия трансгена в мышечных волокнах ишемизированной ткани, местное повышение концентрации продуцируемого белка, в частности vegf, и улучшение перфузии тканей за счет развития новых капилляров [5, 7, 13]. Анализ эффективности использования этих субстанций в лечении больных ХОЗАНК и послужил поводом для выполнения настоящего исследования.

На базе Института стволовых клеток человека (Москва) был разработан новый препарат Неоваскулген, представляющий собой высокоочищенную сверхскрученую форму плазмиды pCMV- vegf 165, кодирующей эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF) под контролем промотора (управляющего участка ДНК). Препарат создан для лечения перемежающейся хромоты у больных с хронической ишемией конечности. Особенно это актуально для больных, которым не может быть проведена стандартная реваскуляризация по поводу окклюзионного поражения периферических артерий (многоэтажное поражение артерий нижних конечностей, дистальная форма атеросклероза, в том числе в сочетании с диабетической ангиопатией).

В ходе доклинического исследования (Институт токсикологии ФМБА России, Санкт-Петербург, 2008) показано, что Неоваскулген стимулирует пролиферацию клеток эндотелия человека, чем обеспечивает рост кровеносных сосудов (в эксперименте на мышах). Препарат относится к группе с низкой токсичностью, не оказывает местно-раздражающего действия на кожу и не обладает аллергизирующими свойствами. Не установлено побочного влияния препарата на функциональную активность, морфологическую структуру внутренних органов экспериментальных животных. Не выявлено эмбриотоксических, мутагенных и канцерогенных свойств.

Клиническое исследование (фазы 1-2а и 2б-3) проводили одновременно в трех медицинских центрах на основании разрешений на проведение клинических исследований (№250 от 03.07.09 и №177 от 21.04.10), выданных Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития РФ [12]. Протоколы исследований одобрены Национальным комитетом по этике (выписка из протокола №36 от 27.05.09 и №62 от 07.04.10).

Общий дизайн исследования: проспективное, простое, открытое. По результатам проведенного в трех центрах комплекса исследований был составлен итоговый отчет о безопасности и эффективности препарата и направлен для принятия решения о регистрации нового лекарственного средства в Министерство здравоохранения и социального развития РФ. 28 сентября 2011 г. Неоваскулген внесен в Государственный реестр лекарственных средств; регистрационный номер ЛП-000671.

Цель настоящего исследования - проследить ближайшие и отдаленные результаты, характеризующие безопасность и эффективность использования генно-терапевтического препарата на основе гена vegf 165 в течение 3 лет у больных ХОЗАНК.

Одними из важнейших критериев включения в исследование были: 1) полная проходимость проксимального артериального русла исходно или после операции (более 3 мес) - гемодинамически незначимый стеноз аортобедренного сегмента до 50%; 2) наличие неоперабельного дистального поражения или анатомо-функциональная недостаточность коллатеральных путей кровотока; 3) хроническая ишемия нижней конечности II или III стадии по А.В. Покровскому-Фонтейну. Кроме того, больные должны быть в возрасте старше 40 лет. Обязательными были подписание добровольного информированного согласия для участия в исследовании, способность пациентов понять суть исследования, выполнить требования протокола. Критерии исключения: декомпенсация функции любого органа или системы, инфекционные заболевания, онкологическое заболевание в течение последних 5 лет, наличие гнойно-трофических изменений на нижних конечностях.

За период с сентября 2009 г. по декабрь 2010 г. в отделении сосудистой хирургии Ярославской областной клинической больницы проведено консервативное лечение 45 больным ХОЗАНК IIА, IIБ, III стадий по А.В. Покровскому-Фонтейну. Возраст больных варьировал от 40 до 78 лет и в среднем составил 63,3±5,8 года. Мужчин было 36 (75%), женщин - 9 (25%). У 29 больных отмечены сопутствующие кардиальные заболевания. Ишемической болезнью сердца страдали 20 больных, из них 4 в анамнезе перенесли острый инфаркт миокарда (ОИМ). Артериальная гипертензия выявлена у 12 человек. В 6 наблюдениях имелась ишемическая болезнь головного мозга на фоне атеросклероза экстра- и интракраниальных артерий. Два пациента в анамнезе перенесли острое нарушение мозгового кровообращения без выраженного неврологического дефицита.

Все больные проходили стандартный курс сосудистой терапии в условиях стационара, который включал внутривенное введение пентоксифиллина 200 мг №10, внутримышечное введение никотиновой кислоты 20 мг 2 раза в сутки, per os трентал 400 мг 2 раза в сутки и per os тромбо-асс 100 мг/сут. Из немедикаментозных средств применяли магнитотерапию на голени, стандартизованную нагрузочную ходьбу 3-5 км в день. На амбулаторном этапе больным назначали пентоксифиллин в дозе 1000-1200 мг/сут, клопидогрел 75 мг/сут, статины, антиатеросклеротическую диету, дозированную нагрузочную ходьбу 3-5 км в день. Рекомендовали категорический отказ от курения. Кроме того, все пациенты получили двукратное введение препарата Неоваскулген 1,2 мг в мышцы пораженной конечности с интервалом 1 и 2 нед.

Методы исследования. Основным критерием эффективности выбрано изменение ДБХ, что является основополагающим элементом классификации ХОЗАНК, критерием оценки качества жизни пациентов, показанием к хирургическому лечению. Этот показатель определяли при проведении тредмил-теста - ходьба по ровной дорожке (угол наклона 0°) со скоростью движения дорожки 1 км/ч). Регистрировали и оценивали вторичные критерии эффективности, к которым отнесли лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ); чрескожно (транскутанно) определяемое парциальное давление (напряжение) кислорода (ТКНК, мм рт.ст.); среднее значение линейной скорости кровотока (ЛСК) по данным ультразвукового дуплексного ангиосканирования задней большеберцовой артерии, а при ее окклюзии на всем протяжении - передней большеберцовой артерии.

В 35% наблюдений проводили ангиографическое исследование дистального артериального русла перед началом лечения и через 6 мес после введения препарата. Клинико-лабораторные показатели исследовали у всех больных до ведения препарата, через 2 нед, 1, 3, 6 мес, через 1, 2 и 3 года от начала клинического исследования. Через 1, 2 и 3 года проводили скрининговое обследование на онкологическое заболевание.

Методы статистического анализа. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, доверительный интервал (ДИ) 90 и 95%. Межгрупповые различия оценивали с помощью теста Манна-Уитни. Для повторных измерений использовали критерий Вилкоксона. Для анализа зависимостей применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Уровень значимости был принят 0,05.

Для изучения клинической эффективности больные разделены на три группы в зависимости от стадии ХОЗАНК: группа А - стадия IIА (n=5), группа В - стадия IIБ (n=22), группа С - стадия III (n=18). Ближайшие и отдаленные результаты прослежены у всех больных в сроки до 3 лет.

В группе А во всех наблюдениях отмечено увеличение всех вторичных критериев эффективности, но, учитывая небольшое число больных, статистически оценивать эти данные нецелесообразно. ДБХ в среднем увеличилась на 850 м. Этот показатель достоверно не изменился и в течение последующих лет наблюдения, т.е. у всех больных заболевание из IIА стадии перешло в I стадию.

Первые положительные изменения в группах В и С в виде потепления дистальных отделов исследуемой нижней конечности и увеличения ДБХ были субъективно отмечены больными уже через 2 нед от начала лечения. У больных группы С отмечалось значительное уменьшение интенсивности болей в ноге в покое. Через 1 мес у всех больных боли в покое были купированы. Достоверный прирост ДБХ в группе В в процессе наблюдения составил к 3 мес в среднем 42,7% (р=0,001), в группе С - 30,3% (p<0,05). Увеличение ЛПИ в обеих группах было статистически малозначимо. Динамика показателя ТКНК в течение первых 3 мес: в группе В превышение исходных показателей на 21,8% (p<0,05), в группе С - на 43,1% (p=0,001). Также отмечено изменение показателя ЛСК у больных группы В: увеличение составило 25,4% (p<0,05). В группе С достоверных изменений ЛСК за этот период не получено. Дальнейшую динамику первичного и вторичных критериев эффективности можно проследить по таблице.

Заметное изменение показателей за 1 год наблюдения демонстрировали больные группы В: увеличение ДБХ по тредмил-тесту составило 456 м (95% ДИ от 100 до 800) - со среднего значения 115±65 до 571±342 м. К концу второго года наблюдения прирост составил 468 м (95% ДИ от 70 до 810) - до среднего значения 583±455 м. Через 3 года ДБХ недостоверно снизилась по отношению к двум предшествующим годам наблюдения и составила 563±315 м. Прирост по отношению к исходным данным составил 448 м (95% ДИ от 100 до 740) (см. таблицу). Увеличение ЛПИ у больных к концу первого года составило 0,04 (90% ДИ от 0 до 0,18) - со среднего значения 0,53±0,05 до 0,57±0,04. В отдаленном периоде (2 года) отмечено небольшое повышение показателя до 0,06 (90% ДИ от 0 до 0,20). Среднее значение 0,59±0,04. Через 3 года ЛПИ составил 0,57±0,03. Изменения этого критерия эффективнос­ти были статистически малозначимы.

Отчетливую положительную динамику в течение всего срока наблюдений можно было констатировать по косвенному признаку развития микрососудистой сети - ТКНК. Увеличение через 1 год составило 19,8 мм рт.ст. (95% ДИ от 10 до 31) - со среднего значения 70,1±9 до 89,9±7 мм рт.ст. К концу второго года этот показатель составил 91,2±5 мм рт.ст. (+21,1 мм рт.ст.; 95% ДИ от 9 до 28) Через 3 года ТКНК оставался на стабильно высоком уровне - 90,6±4 мм рт.ст. (+20,5 мм рт.ст.; 95% ДИ от 8 до 26). При оценке следующего критерия эффективности - ЛСК также выявлены положительные стабильные сдвиги. В течение первого года увеличение ЛСК составило 5,9 см/с (90% ДИ от 2 до 17) - со среднего значения 15,3± 2,1 до 21,2±2,5 см/с. В отдаленном периоде отмечена стабилизация состояния: через 2 года наблюдения среднее значение показателя 21,4±2,4 см/с, прирост составил 6,1 см/с (90% ДИ от 3 до 15). Через 3 года ЛСК 20,5±2,1 см/с (+5,3 см/с; 90% ДИ от 2 до 19).

Следовательно, у больных группы В выявлены статистически достоверные результаты, свидетельствующие об улучшении кровообращения в ишемизированных нижних конечностях по данным ДБХ, ТКНК и ЛСК. В то же время динамика ЛПИ оказалась статистически малозначимой. Клиническое улучшение через 1 год отмечено в 90,5% наблюдений - у 19 из 21 больного (1 больной умер от ОИМ через 6 мес после включения в исследование). При этом заболевание у 62% (n=13) больных перешло из IIБ в IIА стадию. За второй год еще в 2 наблюдениях заболевание перешло в более легкую стадию, общее число таких больных составило 71,4% (n=15). В течение третьего года отмечена стабилизация клинического течения ХОЗАНК у всех больных. Один больной умер от ОИМ на третьем году наблюдения.

В группе С получены следующие результаты. Увеличение ДБХ в первый год наблюдения составило 168 м (95% ДИ от 80 до 275) - со среднего значения 32±25 до 200±107 м. В дальнейшем положительная динамика нарастала, и этот показатель достиг значения 274±72 м. Средний прирост ДБХ за 2 года составил 242 м (95% ДИ от 70 до 230). Через 3 года первичный критерий эффективности стабилизировался на значении 271±63 м. Средний прирост ДБХ за 3 года составил 239 м (95% ДИ от 65 до 221). Все изменения были статистически значимыми на протяжении всех 3 лет. В течение первого и последующих годов наблюдения в группе С отмечен статистически малозначимый прирост ЛПИ, который за первый год составил 0,14 (95% ДИ от 0,13 до 0,20)  - со среднего значения 0,23±0,09 до 0,37±0,06. В дальнейшем показатель достоверно не изменился и через 2 года составил 0,36±0,03 (+0,13; 95% ДИ от 0,15 до 0,21), через 3 года - 0,34±0,03 (+0,11; 95% ДИ от 0,09 до 0,23)). Динамика изменения TКНК: средний прирост за 1 год 31,5 мм рт.ст. (95% ДИ от 14 до 22) - со среднего значения 46,3±15 до 77,8±8 мм рт.ст. Через 2 года средний прирост составил 41,1 мм рт.ст. (95% ДИ от 5 до 30) - до среднего значения 87,4±9 мм рт.ст. Через 3 года отмечена стабилизация состояния: средний прирост составил 40,7 мм рт.ст. (95% ДИ от 7 до 15) - до среднего значения 87,0±8 мм рт.ст. Все изменения были статистически значимыми на протяжении 3 лет. Годовое увеличение ЛСК составило 5,1 см/с (90% ДИ от 3 до 7) - со среднего значения 8,5±9 до 13,6±8 см/с. При 2-летнем наблюдении среднее значение ЛСК незначительно увеличилось - до 14,1±12 см/с (+5,6 см/с; 90% ДИ от 1 до 12). Но даже через 3 года продолжала регистрироваться положительная динамика. Среднее значение ЛСК составило 15,6±7 см/с (+7,1 см/с; 90% ДИ от 7 до 13). Динамика прироста ЛСК в течение всего периода наблюдения оказалась статистически значимой.

В ходе наблюдения за больными группы С получены статистически достоверные данные об улучшении кровообращения в нижних конечностях по результатам измерения ДБХ, ТКНК и ЛСК в течение всего периода наблюдения (p<0,05). Изменения ЛПИ на всех сроках наблюдения оказались статистически малозначимыми. Клиническое улучшение отмечено в 77,7% наблюдений. При этом у 44,4% (n=8) больных по клиническим данным заболевание перешло в более легкую стадию - IIБ, у 6 (33,3%) больных - даже во IIА стадию. В 3 наблюдениях в течение первого года и в 1 - в течение второго года выполнена ампутация нижних конечностей на уровне бедра в связи с прогрессированием хронической ишемии (1 больной умер в послеоперационном периоде).

Распределение больных в зависимости от стадии заболевания до проведения лечения и через 1, 2 и 3 года наблюдения представлено на рисунке.

Клинико-лабораторные показатели, которые регулярно исследовали в течение всего периода лечения и наблюдения за всеми больными, не демонстрировали заметных отклонений от первоначальных значений. За весь период наблюдения не отмечено нежелательных явлений, связанных с использованием препарата, не выявлено онкологических заболеваний.

Таким образом, использование генной терапии в комплексном лечении больных хронической ишемией нижних конечностей эффективно. Клиническое улучшение при IIБ стадии ХОЗАНК отмечено более чем в 90% наблюдений. При этом в течение 2 лет более чем в 70% наблюдений заболевание перешло во IIА стадию. На протяжении третьего года наблюдения отмечена стабилизация клинического течения ХОЗАНК у всех больных. При III стадии хронической ишемии клиническое улучшение отмечено у 78% больных. Во IIА стадию заболевание перешло у 33% больных.

Использование генно-терапевтической конст­рукции vegf 165 безопасно, технически несложно и хорошо переносится больными. Число наблюдений использования препарата Неоваскулген при ХОЗАНК на территории РФ на период до 2014 г. еще не велико - около 300 больных. Необходимо накап­ливать опыт генной терапии у больных с разными стадиями ХОЗАНК, продолжать всестороннее изучение воздействия препарата, контролировать эффективность его применения в максимально отдаленные сроки. Широкое использование генной терапии в условиях общехирургических стационаров позволит значительно расширить возможности комплексного лечения этой многочисленной группы больных.