Механизм, побуждающий волосяные фолликулы (ВФ) циклически генерировать волосяное волокно, остается загадкой. Некоторые авторы [1] полагают, что дирижера, регулирующего хореографию жизненных циклов ВФ, в природе не существует, и волосы растут в соответствии со своими стохастическими законами. Надо признать, что в настоящее время ВФ оказался не таким простым и понятным органом, как считалось ранее.

ВФ претерпевает циклические периоды регенерации (анаген), между которыми проходят последовательные стадии дегенерации (катаген) и отдыха (телоген).

В ходе фазы анагена волос растет со скоростью около 0,3 мм в сутки. Продолжительность данной фазы различается в зависимости от конкретного ВФ: она может длиться от 1 года до 10 лет (в среднем 3—4 года). В ходе фазы катагена ВФ прекращает синтез клеток и смещается ближе к поверхности кожи головы. Это короткая фаза, продолжающаяся 2—3 нед. Фаза телогена состоит из двух фаз — фазы экзогена, в ходе которой волос выпадает, и фазы кеногена, во время которой волосяная луковица остается пустой. По окончании данной фазы волос переходит в фазу покоя на 2—5 мес.

В ходе фазы телогена запускается регенерация ВФ, и наступает фаза неогена. В наступающей новой фазе анагена ВФ снова опускается на исходную позицию, и стартует фаза роста — так начинается повторный цикл.

Неоднократная регрессия и самовосстановление ВФ в течение жизни организма предполагает наличие свойств, характерных для тканевых стволовых клеток (СК). СК входят в состав малых клеточных популяций и являются исходными элементами, образующими разные типы клеток и тканей в эмбриональном периоде и постнатальном онтогенезе [2]. Основной характеристикой СК является их способность к самообновлению и возможности дифференцироваться в несколько типов клеток разных органов.

Взрослые СК участвуют в поддержании тканевого гомеостаза и заживлении ран. На основании тщательного морфологического исследования тканей скальпа при разных патологиях волос ученые пришли к выводу, что основная зона генерации СК ВФ находится в зоне bulge, или «выпуклости». Клинические наблюдения демонстрировали, что повреждения клеток в зоне «выпуклости» — небольшом участке наружной оболочки корня ВФ, ограниченном устьем протока сальной железы сверху и местом прикрепления m. еrector pili снизу, являющейся маркером основания неменяющейся (постоянной) части ВФ, ведут к его необратимым изменениям, делая невозможным сохранение тканевого гомеостаза и соответственно дальнейшее функционирование органа.

«Выпуклость» визуально обнаруживается в разные фазы цикла развития волоса как биохимически и морфологически определяемый компартмент (реакционные пространства). В фазе покоя между клетками «выпуклости», развивающимися медленными циклами, и клетками сосочка дермы (СД) наблюдается небольшое скопление клеток, называется герминативными клетками, или волосяным зародышем (ВЗ). Лучше всего ВЗ обнаруживается в фазу телогена, когда он существует как стабильная морфологическая единица. Результаты исследований свидетельствуют о том, что клетки ВЗ происходят из СК «выпуклости», а потомство клеток, покинувших «выпуклость», способно выживать до следующего цикла, пополняя клетки ВЗ. При этом популяция клеток ВЗ морфологически и биологически отличается от клеток «выпуклости». Как и клетки «выпуклости», они находятся в покое в течение большей части фазы телогена цикла развития волоса. Вместе с тем к концу телогена ВЗ активируется, и присутствующие в нем клетки обеспечивают поддержку первых этапов очередного цикла развития волоса. Особенностью клеток ВЗ является приобретаемая способность быстрее реагировать на стимулирующие сигналы дермального сосочка (ДС). Способность клеток ВЗ формировать большие колонии in vitro, обладающие небольшим потенциалом пассирования, отчетливо отличает клетки ВЗ от клеток матрикса, которые в подобных условиях формируют или не формируют единичные колонии [3].

В то же время эти же самые свойства клеток ВЗ быстро формировать большие колонии, но затем лишаться данного потенциала после относительно небольшого количества пассажей в сочетании с их повышенной транскрипционной динамикой свидетельствуют о том, что клетки ВЗ, возможно, обладают способностью инициировать взрыв клеточной пролиферации, необходимой для начала регенерации ВФ. Учитывая последующую активность клеток «выпуклости», можно предположить, что СК «выпуклости» используются более экономно, чтобы распространиться по НКВ и обеспечить поддержку пула клеток матрикса, которые после нескольких циклов пролиферации дифференцируются в разные клеточные структуры ВФ. По мнению S. Waghmare и соавт. [4], это объясняет способность клеток «выпуклости» проходить медленные циклы развития в фазу анагена.

Таким образом, основной функцией клеток ВЗ является поддержка начальных стадий регенерации ВФ. Это согласуется с моделью, согласно которой клетки ВЗ возбуждаются под воздействием сигналов ДС и первыми реагируют на них [5]. В отличие от этого «выпуклость» выполняет функцию поддержания фазы анагена и заключает длительно используемые СК. Можно сказать, что клетки ВЗ поддерживают начальные этапы регенерации волоса, в то время как клетки «выпуклости» обеспечивают поддержание всего процесса [3].

Клональный анализ in vitro показал, что клетки с высоким клоногенным потенциалом содержатся фактически не в зоне «выпуклости», а в более нижней части фолликула, под этой зоной [6—8]. Кроме того, радиационные [9] и диссекционные [10, 11] исследования показали, что клетки, находящиеся выше зоны луковицы ВФ, имеют высокий регенеративный потенциал и что обе — верхняя и более низкая часть человеческого ВФ в состоянии трансдифференцировать и восстанавливать эпидермис [12].

В зависимости от выбранного критерия СК человеческого ВФ могли быть расположены в так называемой области выпуклости или в более низкой части ВФ или в обоих.

Поиск маркеров СК позволял идентифицировать на роль потенциальных кандидатов такие белки, как базонуклин [13], коннексин-43 [14], E-кадерин и b-катенин [15], высокоэкспрессированный b₁-интегрин [16—20], цитокератин-19 (K19) [16—18, 21, 22] и a₆-интегрин [23]. В итоге клетки с высокой экспрессией b₁-интегрина и K19 были предложены как предполагаемые ориентиры СК ВФ.

Положительные K19-клетки всегда демонстрируют высокий уровень кo-экспрессии b₁-интегрина [18, 22], поэтому поиск распределения СК ВФ может быть ограничен изучением распределения во всех циклах роста волоса кератина 19 — второго предполагаемого маркера СК ВФ. Следует уточнить, что в целом популяция кератин 19⁺-клеток гетерогенна. Среди К19⁺-клеток встречаются очень мелкие клетки, по размерам соответствующие стволовым, и крупные, которые могут соответствовать дифференцированным клеткам. Исследования в культуре показывают увеличение доли К19⁺-клеток. В процессе культивирования происходит дополнительная индукция синтеза кератина 19 в клетках, где ранее этот белок не экспрессировался.

В ходе изучения экспрессии К19 в терминальном анагеновом фолликуле оказалось, что выявление этих клеток ограниченно двумя областями — нижним и верхним НВК. S. Commo и соавт. продемонстировали повышенную экспрессию b₁-интегрина в нижней и верхней части фолликула и наименее выраженную — в средней части, что предполагало гетерогенность распределения компартментов СК в ВФ [24].

Эти две области несимметрично распространены по всей окружности НВК. Во время катагеновой фазы область нижнего НВК, положительная в отношении К19, движется вверх вместе с клубочком волоса и соединяется во время фазы телогена с K19-положительной частью из верхней области НКВ. Эти две области вновь индивидуализируются в начале следующего анагена [25].

Таким образом, можно сказать, что СК ВФ существуют в двух нишах. Термин «ниша» впервые был предложен в 1978 г. R. Schofield [26] для микроокружения СК, необходимого для ее жизнедеятельности и координации с нуждами организма. Ниша обеспечивает координацию между разными популяциями клеток, регулируя их ориентацию и местоположение в тканевом компартменте, а следовательно, регулирует морфогенез и функции тканей [27].

В основе функционирования ниши лежат многие взаимосвязанные механизмы: межклеточные взаимодействия между СК, а также СК и соседними дифференцированными клетками; взаимодействия между СК и компонентами внеклеточного матрикса [28], регуляция уровня кислорода (наличие или отсутствие гипоксии) [29], факторы роста и цитокины, физико-химическое состояние окружающей среды (рН, концентрация ионов Ca²⁺) и др.

Ниши СК формируются в процессе онтогенеза. Размер ниши позволяет поддерживать определенное число СК. Избыточные СК дифференцируются при наличии определенного сигнала или подвергаются апоптозу, если его не получают. Таким способом ниши обеспечивают регуляцию числа СК в организме и защищают его от избыточной пролиферации СК [30].

Несмотря на то что результаты функциональных и иммуногистохимических исследований свидетельствуют о существовании в человеческих ВФ, по крайней мере, двух пулов плюрипотентных клеток, верхняя и нижняя ниши, содержащие K19+-клетки, не идентичны. Они экспрессируют разные маркеры и демонстрируют разный состав окружающей соединительнотканной оболочки. Верхний резервуар выделяет высокие уровни кератина К15 и β1-интегрина (CD29) и в большой степени состоит из Кi-67-клеток (непролиферативных), в то время как нижний резервуар, также содержащий К15 и CD29, выделяет CD34 — мембранный белок, опосредующий связывание СК с внеклеточным матриксом, а также охватывает некоторые К67⁺-клетки [31].

К19 считается геном, индуцируемым гипоксией [32], которая является характеристикой нескольких ниш СК, одним из важных условий для поддержания и функционирования разных их типов. Гипоксия сохраняет способность колониеобразующих клеток образовывать колонии во вторичных культурах [33], независимо от присутствия факторов роста [34]. Например, гемопоэтическим клеткам ниша определяет нормальный темп самообновления и выхода в дифференцировку путем поддержания низких уровней внутриклеточного содержания активных форм кислорода посредством регулирования NADPH-оксидазы [2, 35]. Это способствует сохранению СК в спокойном состоянии с необходимой скоростью самовоспроизведения. Гипоксия является непременным и важнейшим атрибутом костномозговых ниш гемопоэтических СК [36, 37]. Для нижней ниши СК фолликулов человеческого волоса также характерна гипоксическая среда [38].

Ключевым оператором в передаче клеточных сигналов гипоксии является транскрипционный фактор HIF (hypoxia-inducible factor) — HIF-1 и его более клеточно-специфичная изоформа HIF-2 [39]. Фактор гипоксии HIF имеет дуалистические свойства, воздействуя более чем на 60 целевых генов, вовлеченных в метаболизм, ангиогенез, гликолиз. Экспрессия HIF-α и уровень этого белка зависят от концентрации и парциального давления кислорода в крови [40—43]. Повышение активности HIF-α наблюдается в состоянии гипоксии [43]. Ген HIF-α активируется в физиологически важных местах регуляции кислородных путей, обеспечивая быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз.

В исследованиях последних лет показано, что гипоксия способствует сохранению мезенхимальными СК (МСК) их недифференцированного фенотипа, а также положительно влияет на их способность к формированию колоний, пролиферации и миграции/мобилизации. При сниженном напряжении кислорода HIF-α облегчает сигнальную трансдукцию, способствуя самообновлению и торможению дифференцировки нейтральных СК или апоптозу [34]. Периодические гипоксические тренировки ведут к накоплению в тканях большого количества гемопоэтических СК, что может увеличивать общий регенеративный потенциал, который обеспечивается способностью гемопоэтических СК к трансдифференцировке, пластичности и межклеточному взаимодействию [37].

В присутствии кислорода HIF-α разрушается путем гидроксилирования, медиатором реакции выступает пролил-4-гидроксилаза, т.е. деградация HIF-α свидетельствует об условиях нормоксии — нормального содержания кислорода, что нарушает условия существования определенных пулов СК и влияет на функциональную активность органа в целом.

Предполагают, что увеличение числа неактивных ВФ при поредении волос связано с меньшим количеством контактов между популяциями СК клеток-предшественников. Выявлена связь между алопецией на коже головы и сокращением популяции прогениторных клеток нижнего резервуара, идентифицируемым по экспрессии CD34 — особого маркера СК нижнего резервуара фолликула [44]. Фаза покоя становится дольше, что приводит к увеличению числа «спящих» фолликулов (рис. 1).

За решение сложной задачи, направленной на уточнение роли гипоксии в функционировании ниш СК волос, взялись специалисты «L’Oréal Research» — научно-исследовательского центра Л’Ореаль, более 20 лет работающего в области изучения волос.

С целью характеристики распределения СК в ВФ человека в течение цикла роста волос была исследована экспрессия К19 — маркера для предполагаемого эпителиального компартмента, содержащего СК. Обнаружено, что анагеновые ВФ человека содержат два разных резервуара СК в верхней и нижней трети фолликула. Оба резервуара соединяются во время катаген/телогеновой фазы и индивидуализируются вновь во время нового анагена [25] (рис. 2).

Учитывая особенность распределения клеток, экспрессирующих К19, этот маркер может быть использован для оценки защитного воздействия активного компонента на популяцию СК ВФ, поскольку присутствие маркера K19 позволяет измерить это воздействие in vitro.

Проведенные исследования основывались на сравнительном анализе сохранения К19-экспрессирующих клеток в популяциях двух групп фолликулов — контрольной и с воздействием активного компонента.

Гипоксия является характеристикой нескольких ниш СК. Насколько данный факт важен для функционирования ниши СК и клеток-предшественников в ВФ? С этой целью в человеческом анагеновом ВФ были проанализированы экспрессия и локализация нескольких протеинов, индуцируемых в гипоксической среде. Также проведены исследования in vitro, целью которых являлось изучение степени влияния гипоксии на популяцию регенеративных эпителиальных клеток, взятых из человеческого ВФ, и анализ гипоксии-подобного влияния мощного химического ингибитора деградации HIF-α как на фолликулы, так и на изолированные клеточные популяции.

В ВФ человека проанализирована экспрессия двух индуцируемых гипоксической средой протеинов — карбоангидразы IX (CA IX) [32, 45] и переносчика глюкозы 1 (GLUT1) [32, 46].

Оба протеина предпочтительно выделялись базальным слоем НВК в нижнем отделе анагеновых фолликулов. Субпопуляция клеток СА IX+ казалась позитивной в отношении К19 и CD34, являющихся протеиновыми маркерами СК и клеток-предшественников нижнего резервуара СК человеческих фолликулов. Эти наблюдения позволили сделать вывод: в верхнем и нижнем резервуарах СК микросреда существенно различается, и гипоксическая среда характерна только для нижнего резервуара.

Для того чтобы лучше понять влияние гипоксической среды на популяции СК и клеток-предшественников, находящихся в НВК, а также в более глобальном смысле — на регенерацию волоса, проведено несколько анализов ex vivo. Культуры клеток волос, а также первичные клетки из НВК культивировали в условиях гипоксии (3% О₂) и нормоксии (21% О₂). Одновременно был протестирован диэтилпиридин-2,4-дикарбоксилат, мощный трансмембранный ингибитор пролил-4-гидроксилазы (Р4Н) названный Стемоксидином (US патент 7,598,278B2), на наличие гипоксии-подобного эффекта [47].

Медиатором гипоксического сигнала являлся индуцируемый гипоксией транскрипционный фактор HIF-1, состоящий из α- и β-гетеродимеров. Регуляция α-субъединицы является кислородзависимым процессом и происходит через медиацию Р4Н-гидроксилирования, которая в свою очередь медиирует протеосомальную деградацию [48].

Для выявления молекулы, способной оказать замедляющее действие на пролингидроксилазу, в «L’Oréal Research» исследовали и протестировали более 100 молекул, которые предположительно могли оказывать подобное воздействие. Долгие поиски показали, что предшественник Стемоксидина (Stemoxydine) является самой эффективной молекулой для замедления активности пролингидроксилазы. Эта молекула-предшественник была оптимизирована и запатентована «L’Oréal Research» под названием Стемоксидин. Поскольку Стемоксидин является сложным диэфиром, молекулы этого типа могут оптимально действовать внутри клетки (рис. 3).

Ожидалось, что Стемоксидин должен стабилизировать экспрессию HIF-α даже в присутствии кислорода за счет ингибирования пролил-4-гидроксилазы.

Эксперименты с применением вестерн-блоттинга проведены на клеточных культурах, которые выдерживали в условиях гипоксии (3% О₂), с кислородом (21% О₂), а также с 300 млМ Стемоксидина и без него в течение 24, 48 и 72 ч. Повышение протеинового уровня HIF-α наблюдалось через 24 и 48 ч в культурах, инкубированных в гипоксической среде, а также через 48 и 72 ч в культурах, содержащих Стемоксидин. Таким образом, экспериментальные данные подтвердили, что Стемоксидин стабилизирует протеиновый уровень HIF-α в такой же степени, как и гипоксия.

Для того чтобы оценить влияние стабилизации HIF-1 на транскрипцию генов, проведен транскрипторный анализ уровня экспрессии 11 генов в ВФ, потенциально регулируемых гипоксией. Анализ на фолликулах, культивированных ex vivo, проведен при гипоксии и нормоксии, в присутствии и без Стемоксидина. В ходе анализа, проведенного в 2 промежутках времени, выяснилось, что гипоксия усиливает экспрессию 4 генов (SLC2A1, CA9, EGLN3 и BNIP3) и снижает экспрессию 2 генов (COX4i1 и FGFBP1). Также установлено, что экспрессия генов FGF2, EPO, HIF-α снижается через 24 ч культивации в условиях гипоксии. Обработка Стемоксидином не модифицировала профиль экспрессии генов так, как это происходило в гипоксической среде, но гены, экспрессия которых усиливалась Стемоксидином, вырабатывались также в большей степени и при гипоксии; в то время как гены, экспрессия которых в присутствии Стемоксидина снижалась, аналогично реагировали и при культивации в условиях гипоксии.

Для того, чтобы более детально исследовать влияние гипоксии на функции СК и клеток-предшественников, проведен тест на колониеобразующую эффективность клеток (CFE-test), взятых из НВК. Считается, что сильный клоногенный потенциал является характеристикой СК и клеток ранних предшественников, в то время как дифференцированные кератиноциты теряют клонообразующий потенциал [49].

Клеточные клоны, полученные при культивировании в гипоксической среде или при нормоксии, но в присутствии Стемоксидина, имели более низкую плотность клеток и меньшую дифференциацию по краям колоний, чем колонии, культивированные в условиях нормоксии. Это позволило сделать вывод о том, что состояние гипоксии поддерживает жизнедеятельность и усиливает автоматическое обновление СК ВФ.

Таким образом, результаты проведенных in vitro тестов свидетельствуют о том, что гипоксия может являться важным регулятором регенеративной способности СК и клеток-предшественников, и, возможно, присутствует в человеческом ВФ. Молекулы, которые имитируют сигналы гипоксии, такие как Стемоксидин, могут быть применены для поддержания роста волос и нормализации циклов в ВФ.

Для изучения возможного влияния Стемоксидина на рост волос проведено исследование в большой группе пациентов с андрогенетической алопецией. Именно при этой форме потери волос A. Luis и соавт. [44] продемонстрировали снижение пула CD34hi-клеток нижнего резервуара СК ВФ.

В многоцентровом рандомизированном двойном слепом исследовании проведен сравнительный анализ эффективности 5% водно-спиртового лосьона Стемоксидина в составе средства Виши Деркос Неоженик и водно-спиртового лосьона (плацебо).

В исследовании приняли участие 100 мужчин-добровольцев 18—55 лет, с клиническими признаками явного выпадения волос в III—IV стадии алопеции (классификация Гамильтона в модификации Норвуда). Однократные аппликации тестируемых продуктов наносили 2 раза в сутки. Продолжительность лечения составила 3 мес. С целью объективной оценки роста волос в начале и в конце лечения проводили фототрихограмму: на макушке выбривали небольшой (около 1 см²) участок, на котором наблюдалось прогрессирующее выпадение волос. Зону помечали с помощью микромечения (точечной татуировки), а затем фотографировали. Через 3 мес зону, выделенную с помощью микромечения, повторно брили и фотографировали. Сравнение двух фотографий позволяет количественно оценить изменение общей густоты волос на 1 см² для каждого участника исследования [50].

После 3-месячного курса лечения у добровольцев, использовавших 5% лосьон Стемоксидина, густота волос значительно повысилась без изменения в соотношении фолликулов в фазах анаген/телоген (рис. 4).

Субъективно добровольцы отмечали значительное увеличение количества волос на голове и их объема, увеличение скорости их роста. Также их легче стало укладывать. Результаты клинической балльной оценки свидетельствуют о том, что лосьон хорошо переносится [51].

В человеческом ВФ находятся два отдела эпителиальных СК, обладающих определенным количеством общих биологических маркеров, включая экспрессию К19, но которые могут различаться в области дифференциальной экспрессии некоторых протеинов, а также ниш и микроокружения. Результаты, представленные Научно-исследовательским центром «L’Oréal Research», свидетельствуют о том, что нижний резервуар клеток К19⁺/CD34^.+ частично находится в условиях гипоксии. Это заключение является интересным, учитывая тот факт, что на лысом скальпе клеток CD34hi меньше [52], из чего следует вывод: нижний резервуар вовлечен в процесс контроля цикла роста волоса, в частности, в процесс возобновления их роста.

Результаты продолжительного (более 14 лет) наблюдения, проведенного среди взрослых, продемонстрировали, что средняя продолжительность анагена в ВФ скальпа с возрастом сокращается [50]. Телоген остается постоянным в течение 3 мес, в то время как возвращение к анагену отсрочивается. Этот период между выпадением волоса и началом следующего анагена назвали «скрытой фазой» или кеногеном. Сокращение продолжительности анагена и продление кеногена происходит в большей степени у мужчин с андрогенетическим облысением. Вполне вероятно, что аналогичные возрастные изменения в цикле роста волос также встречаются и у женщин [53]. Эти два изменения в цикличности роста волос с возрастом — сокращение продолжительности анагена и продление кеногена — приводят к потере плотности и объема волос.

Доступные лекарственные средства против выпадения волос действуют, сокращая кеноген и продлевая анаген в волосах большого диаметра, не изменяя полностью миниатюризацию. Этот эффект характерен для финастерида [54] и ввиду скорости ответа лечения для миноксидила [55]. Средство Виши Деркос Неоженик, содержащее Стемоксидин – первую молекулу с биомиметическим эффектом, восстанавливает рост волос путем имитации условий, поддерживающих клоногенную способность СК ВФ.

Проведенные in vitro тесты колониеобразующей эффективности, представленные в данной статье, показывают, что гипоксия является важным регулятором регенеративной способности СК и клеток-предшественников, и, возможно, присутствует в человеческом ВФ. Использование молекулы с биомиметическим эффектом демонстрирует абсолютно новый подход к восстановлению регенеративного потенциала волос и позволяет оптимизировать лечение длительно существующего облысения. Специфическое влияние Стемоксидина направлено на ингибирование фермента пролил-4-гидроксилазы, действие которого ограниченно зоной экспрессии HIF-α, что обусловливает влияние средства Виши Деркос Неоженик исключительно на область нижнего резервуара СК ВФ с гипоксической средой.