Карбапенемазы — ферменты грамотрицательных микроорганизмов, которые гидролизуют бета-лактамные антибиотики: пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы. До последнего времени карбапенемы являлись препаратами выбора для лечения угрожающих жизни инфекций, вызванных грамотрицательными микроорганизмами. Появление и распространение штаммов бактерий, устойчивых к этим антибиотикам, приводит к неэффективности антибактериальной терапии и представляет серьезную угрозу общественному здоровью во всем мире. При этом особую озабоченность вызывает быстрое распространение карбапенем-устойчивых штаммов энтеробактерий. В Российской Федерации за 5лет, с 2012 по 2016 г., согласно доступным данным ресурса AMRmap [1], доля энтеробактерий, нечувствительных (устойчивых и умеренно-устойчивых) к меропенему, выросла с 1,28 до 13,84%, имипенему — с 7,69 до 14,11%, эртапенему — с 8,97 до 25,84%. Среди представителей порядка Enterobacterales наибольшей устойчивостью к карбапенемам обладает K. pneumoniae. Доля нечувствительных к карбапенемам штаммов K. pneumoniae увеличилась за тот же период времени к меропенему с 1,3 до 24,41%, к имипенему с 9,09 до 22,24%, к эртапенему с 12,9 до 43,94%. Оперативно проследить динамику роста устойчивых к карбапенемам штаммов энтеробактерий в Москве с использованием данного ресурса не представляется возможным в связи с небольшим количеством доступных данных, которые размещаются на ресурсе со значительной задержкой во времени. Усредненный уровень резистентности энтеробактерий к карбапенемам в Москве за доступный для анализа период (2014—2016 гг.) составил 9,49% к меропенему, 10,44% к имипенему, 22,47% к эртапенему. Анализ штаммов K. pneumoniae, выделенных за тот же период, показал гораздо более высокий уровень резистентности (25,25; 21,21 и 56,57% соответственно). В нашем стационаре доля штаммов K. pneumoniae, нечувствительных к меропенему, увеличилась за период с 2012 по 2016 г. с 8,0 до 34,4%, к имипенему — с 5,0 до 36,5%, к эртапенему — с 14,3 до 43,9%. В 2018 г. около ½ выделенных штаммов K. pneumoniae оказалась нечувствительна к карбапенемам: к меропенему — 44,9% штаммов, к имипенему — 45,5% штаммов, к эртапенему — 44,3% штаммов.

Согласно данным ресурса AMRmap, кроме K. pneumoniae, на территории Российской Федерации обнаружены нечувствительные к карбапенемам P. mirabilis (их доля в 2016 г. составляла 7,69% к меропенему, 17,95% к имипенему, 7,69% к эртапенему), E. cloacae (4,69% нечувствительны к меропенему, 3,2% — к имипенему, 9,38% — к эртапенему), E. coli (1,78% нечувствительны к меропенему, 1,18% — к имипенему, 6,8% — к эртапенему). В нашем стационаре в 2016 г. доля P. mirabilis, нечувствительных к меропенему, составила 2,5%, к имипенему — 12%, к эртапенему — 7,8%, доля E. cloacae, нечувствительных к меропенему, — 8,0%, к имипенему — 11,4%, к эртапенему — 21,3%, доля E. coli, нечувствительных к меропенему, — 1,3%, к имипенему — 1,5%, к эртапенему — 2,6%.

В большинстве случаев нечувствительность энтеробактерий к карбапенемам обусловлена продукцией карбапенемаз. Гены, кодирующие приобретенные карбапенемазы, чаще всего локализуются на мобильных клеточных элементах, которые также могут содержать и другие детерминанты резистентности. Эта особенность карбапенемаз способствует быстрому внутри- и межвидовому распространению и обусловливает опасность возникновения вспышек инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, вызванных полирезистентными штаммами.

Наиболее распространенными карбапенемазами энтеробактерий являются КРС (сериновые бета-лактамазы класса А), OXA-48 и ее производные (сериновые бета-лактамазы класса D), NDM, VIM, IMP (металло-бета-лактамазы класса В). Терапия инфекций, вызванных штаммами с карбапенемазной активностью, представляет серьезную проблему, так как широко используемые ингибиторы бета-лактамаз (клавуланат, сульбактам, тазобактам) не инактивируют карбапенемазы классов В и D. Карбапенемазы класса, А также приобретают устойчивость к их действию. Современный ингибитор авибактам проявляет активность против КРС, OXA-48, но не действует на карбапенемазы класса В и большинство ферментов класса D (кроме ОХА-48) [2].

Микробиологическая диагностика на современном этапе не может ограничиться определением чувствительности выделенных штаммов энтеробактерий к карбапенемам. Для назначения эффективной этиотропной антибактериальной терапии при лечении тяжелых инфекций, вызванных полирезистентными микроорганизмами, необходимо иметь информацию о наличии и типах карбапенемаз, продуцируемых грамотрицательными микроорганизмами в каждом конкретном случае. Кроме того, локальный микробиологический мониторинг спектра выделяемой микрофлоры, уровня ее антибиотикорезистентности, данных о наличии и типах генов карбапенемаз и других генов устойчивости микроорганизмов к антимикробным препаратам необходим для назначения эмпирической антибактериальной терапии и для целей инфекционного контроля в стационаре.

Цель исследования— анализ распространенности генов наиболее часто встречающихся карбапенемаз энтеробактерий, выделенных из клинического материала от больных стационара (кровь, раневое отделяемое, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, моча), сравнение полученных результатов с доступными данными об уровне продукции карбапенемаз энтеробактерий в Российской Федерации и сопредельных государствах.

Исследовано 769 штаммов энтеробактерий, выделенных из клинического материала, поступившего в бактериологическую лабораторию за октябрь—декабрь 2017 г. На первом этапе исследования определяли чувствительность выделенных энтеробактерий стандартным диско-диффузионным методом (ДДМ), описанным в актуальной версии клинических рекомендаций «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» 2015−02 (КР) [3] и методом определения пограничных концентраций антибиотиков. Для ДДМ использовали диски с антибиотиками «BIO-RAD» (Франция) и готовый агар Мюллера—Хинтона в чашках Петри «ЦФГС» (Россия). Определение пограничных концентраций антибиотиков проводили с помощью тест-систем SENSILATEST «Erba Mannheim» (Германия). В исследование включали энтеробактерии, нечувствительные (устойчивые или с промежуточной устойчивостью) к одному или нескольким карбапенемам (меропенем, имипенем, эртапенем), согласно критериям, указанным в клинических рекомендациях «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» 2015−02 [3]. Повторно выделяющиеся микроорганизмы с одинаковым профилем антибиотикорезистентности, выделенные от одного пациента, в исследование не включали. На втором этапе штаммы, нечувствительные к карбапенемам, исследовали на продукцию карбапенемаз с помощью фенотипического метода инактивации карбапенемов (Сarbapenem inactivation method, CIM) [4]. На третьем этапе штаммы, демонстрирующие продукцию карбапенемаз в CIM-тесте (CIM-положительные), для подтверждения продукции карбапенемаз и выявления генов приобретенных карбапенемаз основных групп исследовали молекулярно-генетическим методом (полимеразно-цепная реакция — ПЦР — в реальном времени). Данное исследование проводили с помощью наборов, позволяющих определять гены наиболее часто встречающихся карбапенемаз: АмплиСенс MDR MLB-FL для выявления генов металло-бета-лактамаз групп VIM, IMP, NDM и АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL для выявления генов карбапенемаз групп КPC и OXA-48 (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерной программы Система Микробиологического Мониторинга МИКРОБ-2 (СМММ) [5].

Из 769 исследованных штаммов энтеробактерий 146 (19%) штаммов проявили нечувствительность к одному или нескольким карбапенемам. Из 146 нечувствительных к карбапенемам штаммов 100 продемонстрировали продукцию карбапенемаз в CIM-тесте, что составило 68,4%, или 13% от общего количества исследованных штаммов. Остальные 46 (31,6%) штаммов оказались CIM-отрицательными, следовательно, не продуцировали карбапенемазы, в дальнейшее исследование их не включали. На этапе молекулярно-генетического типирования обнаружено, что 100% CIM-положительных штаммов продуцировали гены наиболее часто встречающихся карбапенемаз.

Результаты исследования генов карбапенемаз у разных видов энтеробактерий представлены в таблице.

Среди энтеробактерий, продуцирующих карбапенемазы, наибольший удельный вес имеет K. pneumoniae (87% от общего количества), P. mirabilis — 7%, E. coli — 4%, E. cloacae — 2%. Среди карбапенемаз K. pneumoniae 47,1% составляют OXA-48, 32,1% — NDM, 18,4% представлены сочетанием OXA-48 и NDM. Сочетания карбапенемаз OXA-48 и VIM, NDM и VIM представлены каждое одним штаммом. Ни один штамм K. pneumoniae не демонстрировал продукцию KPC. Все 7 устойчивых к карбапенемам штаммов E. coli продуцируют карбапенемазы OXA-48, все штаммы P. mirabilis (4 штамма) и E. cloaceae (2 штамма) продуцируют NDM.

В общей сложности 55% всех протипированных штаммов энтеробактерий, продуцирующих карбапенемазы, несут гены, кодирующие продукцию металло-бета-лактамаз, среди которых преобладают NDM (54 штамма из 55).

Нами было проведено сравнение полученных результатов с доступными данными, размещенными на интернет-ресурсе AMRmap, которые содержат суммарную информацию, полученную в результате многоцентровых исследований, проводимых НИИ антимикробной химиотерапии (Смоленск) и Межрегиональной ассоциацией по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), а также других опубликованных исследований [1, 6].

Согласно данным AMRmap, на территории Российской Федерации в 2017 г. карбапенемазы OXA-48 продуцировали 73,4% K. pneumoniae (n=79), NDM — 25,3%, сочетанную продукцию OXA-48 и NDM продемонстрировали 1,3% штаммов. Относительно других видов энтеробактерий все штаммы P. mirabilis (n=9) продемонстрировали продукцию карбапенемаз NDM, штаммы E. cloacae (n=11): OXA-48 63,6%, NDM 36,4%, штаммы E. coli (n=27): OXA-48 52,0%, NDM 48,0%, штамы Serratia marcescens (S. marcescens): OXA-48 87,5%, NDM 12,5%. В Москве за 2013—2017 гг. (период, доступный для анализа на ресурсе AMRmap) было изучено 150 штаммов K. pneumoniae, доля карбапенемаз OXA-48 среди них составила 86,0%, NDM — 13,3%, сочетания генов OXA-48 и NDM — 0,7% штаммов. Энтеробактерий других видов было проанализировано за тот же период всего 10 штаммов, из которых 80,0% продуцировали OXA-48, 20% — NDM. Из представленных данных можно сделать вывод, что в Москве доля штаммов энтеробактерий, продуцирующих карбапенемазы OXA-48, больше, чем в целом по Российской Федерации.

Эти данные подтверждаются исследованиями из Института нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко. Все выделенные в 2013—2014 гг. штаммы энтеробактерий являлись продуцентами OXA-48-подобных генов (52 штамма K. pneumoniae, 7 штаммов P. mirabilis, 3 штамма E. aerogenes и 1 штамм E. cloacae), при этом не было обнаружено ни одного штамма-продуцента генов NDM, KPC, VIM [7]. В Санкт-Петербурге, по данным разных авторов, основной причиной устойчивости K. pneumoniae к карбапенемам является карбапенемаза NDM. В исследовании, проведенном в 2012 г. (С.А. Егорова и соавт.), 100% из 22 карбапенем-устойчивых штаммов K. pneumoniae обладали геном NDM [8]. В исследовании карбапенем-устойчивых штаммов K. pneumoniae (n=100), выделенных в 2012—1014 гг. в Северо-Западном медицинском исследовательском центре им. В.А. Алмазова (Санкт-Петербург), гены NDM были обнаружены у 69% штаммов, гены OXA-48 — у 29%, гены KPC — у 2% [9]. У пациентов ожоговых отделений ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» (Нижний Новгород) в 2016 г. из 78 карбапенем-устойчивых штаммов K. pneumoniae у 79,6% штаммов обнаружены гены ОХА48, у 3,8% — ген KPС [10]. В исследовании, проведенном в 2013—2016 гг. в Беларуси (РБ), 27,3% карбапенем-резистентных K. pneumoniae (всего 55 штаммов) продуцировали ген NDM, 47% — ген OXA-48, 1,8% — NDM и OXA-48, 23,6% — KPC [11].

1. Проведенный анализ распространенности генов карбапенемаз энтеробактерий, выделенных в стационаре, показал, что у штаммов K. pneumoniae 47,1% составляют гены OXA-48, 32,1% — NDM, 18,4% штаммов K. pneumoniae представлены сочетанием генов OXA-48 и NDM. У 2 штаммов K. pneumoniae обнаружены гены МБЛ VIM, в сочетании с OXA-48 (1 штамм) и в сочетании с NDM (1 штамм). Все устойчивые к карбапенемам штаммы E. coli продуцируют карбапенемазы OXA-48, все штаммы P. mirabilis и E. cloacae продуцируют NDM. Металло-бета-лактамазы (преимущественно NDM) продуцируют 55% исследованных штаммов энтеробактерий.

2. Спектр карбапенемаз энтеробактерий, выделенных в стационаре, типичен для территории Российской Федерации (РФ) и Москвы, но имеет свои локальные особенности: отличается большим удельным весом карбапенемаз группы NDM и сочетанной продукцией карбапенемаз групп OXA-48 и NDM. В стационаре существует вероятность распространения штаммов P. mirabilis, несущих гены приобретенных металло-бета-лактамаз группы NDM. Карбапенемазы группы KPC не характерны для РФ в целом и нашего стационара в частности.

3. Сравнительный анализ полученных данных с опубликованными данными показал, что распространение карбапенемаз энтеробактерий на территории РФ и РБ неоднородно. Публикаций по аналогичным исследованиям недостаточно, они отражают ситуацию только в конкретной медицинской организации. Интернет-ресурс AMRmap предоставляет постоянно обновляющиеся данные, которые носят усредненный характер, результаты анализируются с временнóй задержкой, количество данных по конкретным населенным пунктам, медицинским организациям недостаточно.

4. Необходимо проведение локального микробиологического мониторинга уровня антибиотикорезистентности выделяемой микрофлоры, а также распространенности генов приобретенных карбапенемаз в конкретном стационаре. На основании этих данных должны разрабатываться алгоритмы назначения эмпирической терапии, определяться политика закупки антимикробных препаратов в стационаре, проводиться противоэпидемические мероприятия, направленные на предотвращение распространения полирезистентных штаммов.

Авторы статьи выражают благодарность врачам-бактериологам бактериологической лаборатории ГКБ № 15 им. О.М. Филатова В.В. Балиной, Н.А. Бондаренко, Н.В. Пивкиной за помощь в выполнении лабораторных исследований.

Сведения об авторах

Тимофеева О.Г. — https://orcid.org/0000-0002-3921-8870

Поликарпова С.В. — https://orcid.org/0000-0003-3201-0804

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Тимофеева О.Г., Поликарпова С.В. Локальный микробиологический мониторинг штаммов Enterobacterales, продуцирующих карбапенемазы. Лабораторная служба. 2019;8(3):14-19. https://doi.org/10.17116/labs2019803114

Автор, ответственный за переписку: Тимофеева Ольга Геннадьевна — e-mail: olga.timofeeva15@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-3921-8870; тел.: +7(903)763-5963