Непрерывное мониторирование гликемии (НМГ) — метод регистрации изменений концентрации глюкозы в крови, при котором результаты фиксируются с очень небольшими промежутками (не более 5 мин) на протяжении длительного времени (более суток).

Согласно результатам DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) и других крупных исследований, интенсифицированная инсулинотерапия, включающая регулярный частый самоконтроль гликемии (СКГК), позволяет снизить выраженность осложнений сахарного диабета (СД) и предотвратить их формирование [1]. В связи с этим международные и отечественные рекомендации постулируют частый регулярный самоконтроль как неотъемлемую часть лечения СД [2, 3].

Наиболее распространенный способ самоконтроля гликемии среди людей с СД состоит в проведении экспресс-анализов образцов крови (как правило, капиллярной, взятой из пальца) с применением тест-полосок и персональных анализаторов (глюкометров) [4]. У этого способа есть объективные недостатки и ограничения. НМГ имеет объективные преимущества перед традиционным СКГК [5], в том числе:

— позволяет получать информацию о концентрации глюкозы в крови в непрерывном режиме;

— дает представление о тенденции изменений гликемии, а не только о ее фактическом уровне;

— позволяет предупреждать пользователя о выходе гликемии из целевой зоны (как в момент выхода, так и заблаговременно – учитывая динамику показателей);

— позволяет оценить истинную картину изменений гликемии в течение больших промежутков времени, а не предположительную, составленную на основе единичных измерений.

Более того, НМГ считают неотъемлемым компонентом «искусственной поджелудочной железы» — инсулиновой помпы, самостоятельно управляющей введением инсулина с учетом изменений гликемии в режиме реального времени по принципу «замкнутого контура». В целом, НМГ является одним из наиболее перспективных направлений развития технологий лечения СД [6]. В то же время у применяющихся сегодня в клинической практике приборов имеется множество недостатков, которые ограничивают использование НМГ. Наиболее существенные недостатки касаются трех аспектов — точности результатов, удобства ношения сенсора глюкозы на теле пациента и срока службы сенсора.

Технологии непрерывного мониторирования гликемии

С клинической точки зрения, применяющиеся устройства для НМГ принято делить на два типа: в «слепом» режиме (или «профессиональное» мониторирование) и в режиме «реального времени» (иногда его называют «пользовательским» мониторированием) [5]. Устройства для НМГ разделяют также на инвазивные, малоинвазивные и неинвазивные (рис. 1), а также (в зависимости от метода определения концентрации глюкозы) — на электрохимические, оптические и пьезоэлектрические.

Инвазивность устройства для НМГ определяется способом размещения сенсора глюкозы, а также способом связи с блоком электронной обработки. Способ размещения сенсора в свою очередь определяется реализованными в устройстве механизмами преобразования сигнала и определения глюкозы.

Инвазивные устройства имеют полностью имплантируемые (подкожно или внутривенно) сенсоры с модулем беспроводного подключения к внешнему контроллеру. Принцип действия большинства имплантируемых сенсоров основывается на ферментативном окислении глюкозы с последующим электрохимическим или оптическим анализом продуктов реакции [7, 8]; реже используется принцип микродиализа (см. ниже). Инвазивные сенсоры могут быть полностью имплантируемыми или трансдермальными (наиболее часто встречающийся вариант) [9, 10].

Малоинвазивные сенсоры глюкозы обычно размещаются на поверхности тела совместно с блоками обработки результатов и вывода информации. Сенсоры в данном случае либо не проникают в кожу вообще, либо их проникновение незначительно по времени и по глубине (компоненты системы не проникают за пределы эпидермиса). Предложено несколько сенсоров для НМГ, которые можно отнести к малоинвазивным, в том числе следующие.

1. Ионофорез. Через кожу сенсор пропускает слабый электрический ток (в конструкцию сенсора входят два близко расположенных друг к другу электрода, между которыми создается напряжение). Электрический ток провоцирует направленное движение поляризованных молекул (а также под действием индукции и других межмолекулярных взаимодействий – и незаряженных молекул) по кожным порам через дерму. Это стимулирует выведение на поверхности кожи микрокапель интерстициальной жидкости (ИСЖ), в которой и происходит определение концентрации глюкозы. Как правило, детекция глюкозы осуществляется путем электрохимического окисления глюкозы на поверхности сенсора [11].

2. Сонофорез. Низкочастотный ультразвук способен расширять и сжимать газообразные включения в роговом слое коже, увеличивая таким образом его проницаемость и стимулируя выход ИСЖ на поверхность. Как и в предыдущем случае, детекция глюкозы происходит в этой ИСЖ путем электрохимического окисления или спектроскопического анализа [12].

3. Вакуумизация. Локальное краткосрочноое воздействие вакуума стимулирует пропотевание ИСЖ на поверхность кожи. Детекция глюкозы опять-таки осуществляется путем электрохимического окисления [13].

4. Микропористая лазерная аблация или лазерная десорбция. Лазерное излучение малой мощности испаряет ИСЖ из микропор рогового слоя кожи; ИСЖ конденсируется (с помощью небольшого вакуума) и анализируется (электрохимическое окисление) [14].

5. Микропроколы. Технология основана на применении кремниевых микроигл (диаметр <0,1 мм), с помощью которых осуществляется забор ИСЖ. Микроиглы прокалывают кожу с высокой частотой, обеспечивая непрерывное поступление образцов ИСЖ к анализатору. Детекция глюкозы, как и в предыдущих случаях, осуществляется путем электрохимического окисления [6].

Все эти методы не нарушают целостность кожи (в сравнении с инвазивными технологиями), однако в силу длительного физического воздействия (механического, электрического и др.) могут вызывать ее изменение и/или повреждение.

Предложено множество способов неинвазивного определения гликемии, включая спектроскопию биологических жидкостей различных отделов тела и органов (жидкость передней камеры глаза, слезная жидкость, слюна, пот, ушная сера, ИСЖ кожи и др.) и анализ газового состава выдыхаемого воздуха [10]. Наибольшее развитие получили следующие направления в области неинвазивного контроля гликемии:

1. Трансдермальные сенсоры, передающие ближний инфракрасный (БИК) свет через роговой слой, с детекцией концентрации глюкозы с помощью оптических методов [13].

2. Экстракорпоральный анализ проб (например, слюны, слез, выдыхаемого воздуха) с помощью различных оптических и электрохимических методов детекции [13, 15].

Способ определения концентрации глюкозы в крови может быть прямым и непрямым.

— При прямом определении гликемии устройство должно использовать в качестве среды для измерения именно кровь (цельную или плазму).

— При непрямом определении концентрация глюкозы в крови определяется по ее уровню в других тканях и жидкостях тела или даже по концентрации не самой глюкозы.

Количественное определение концентрации глюкозы можно проводить с помощью ферментативных и неферментативных электрохимических реакций (рис. 2). Для ферментативных реакций чаще всего применяют специфичный к β-D-глюкозе фермент глюкозооксидазу (GOx), катализирующую окисление глюкозы до глюконолактона. В ходе реакции кофермент (флавинаденинмононуклеотид) переходит в восстановленную форму (флавинадениндинуклеотид) (см. рис. 2: реакция 1). В зависимости от дальнейшей переконвертации фермента обратно в окисленную форму сенсоры относятся к одному из трех поколений.

1. В сенсорах первого поколения восстановленная форма фермента окисляется кислородом внешней среды. В результате образуется перекись водорода Н2О2 (см. рис. 2, а: реакция 2). Концентрация глюкозы рассчитывается, исходя из напряжения, зафиксированного либо при электрохимическом окислении образовавшейся Н2О2 (см. рис. 2, а: реакция 3), либо при электрохимическом восстановлении О2 на рабочем электроде (см. рис. 2, а: реакция 4).

2. В биосенсорах второго поколения окисление восстановленной формы фермента осуществляется медиаторами электронного транспорта (см. рис. 2, б: реакция 5), конкурирующими с кислородом (естественным субстратом реакции). Концентрация глюкозы может быть соотнесена с силой амперометрического сигнала, зафиксированного при электрохимическом окислении восстановленного медиатора (см. рис. 2, б: реакция 6) [16].

3. В биосенсорах третьего поколения окислительно-восстановительный кофермент ковалентно или электрохимически связан с рабочим электродом, что способствует протеканию обратного восстановления (или обратного окисления) путем прямого переноса электронов с рабочего электрода (или на него). Зарегистрированный при этом амперометрический сигнал может быть соотнесен с концентрацией глюкозы (см. рис. 2, в: реакция 7) [7].

Помимо оксидаз, при ферментативной детекции глюкозы применяются глюкозодегидрогеназы [6] и хинопротеин глюкозодегидрогеназы [18]. Для окисления восстановленных форм этих ферментов используются такие типичные для биологических систем медиаторы электронного транспорта, как никотинамидадениндинуклеотид (NAD⁺) и хиноны.

Безферментный метод представляет собой прямое электрокаталитическое окисление глюкозы до глюконовой кислоты на наноструктурных электродах, обладающих большой поверхностью и электрокаталитической активностью (платиновые «массивы нанодендритов»; сетки нанонитей из платиново-свинцового сплава; наночастицы золота и композитные наноструктуры, содержащие платину, золото, свинец, паладий или родий) (см. рис. 2, в: реакция 8) [19, 20].

Детекция глюкозы, основанная на оптических принципах, включает два основных подхода:

1. Применение флуорофоров.

2. Непосредственное оптическое определение.

Применение флуорофоров основано на принципах стереохимического сродства, согласно которым глюкоза и флуорофор конкурируют за взаимодействие с сайт-специфическим для обоих лигандов рецептором [13, 21]. В качестве рецепторной молекулы может применяться, к примеру, конкавалин, А (Кон А), что обусловлено наличием у него четырех сайтов связывания глюкозы. Оценка активности связывания в конкурентных условиях может быть проведена при введении других лигандов, таких как меченный флюоресцеином декстран, α-метилманнозид и гликированный белок [22, 23]. Измерение концентрации глюкозы обеспечивается различными спектроскопическими методами, в том числе приведенными ниже.

1. Присоединение меченного флюоресцеином декстрана к Кон, А вызывает перенос электрического заряда молекулы с последующим падением интенсивности флюоресценции связанного лиганда. Сродство Кон, А к глюкозе выше, чем к декстрану. Поэтому в присутствии глюкозы возрастает количество свободного (несвязанного) декстрана, что проявляется увеличением интенсивности флюоресцентного излучения (рис. 3, а). Концентрация глюкозы прямо пропорциональна интенсивности флюоресценции меченого декстрана.

2. В результате Ферстеровского резонансного переноса энергии (ФРПЭ) между меченным аллофикоцианином Кон, А (донор) и меченным флюоресцеином декстраном (акцептор), который протекает при их сближении на расстояния атомарного масштаба (Ферстеровского радиуса), возникает флюоресцентное излучение [13, 22]. Любая имеющаяся молекула глюкозы присоединяется к Кон А, тем самым увеличивая дистанцию между донором и акцептором данного взаимодействия (с превышением Ферстеровского радиуса), что приводит к падению интенсивности ФРПЭ-индуцированного флюоресцентного излучения (см. рис. 3, б). Таким образом, о концентрации глюкозы можно судить по изменениям интенсивности испускания меченного флюоресцеином декстрана, вызванных ФРПЭ [24, 25].

3. ФРПЭ между молекулами донора и молекулами акцептора сопровождается сокращением времени жизни донора. Кроме того, присутствие глюкозы снижает вероятность осуществления ФРПЭ (см. рис. 3, б). Отсюда следует, что возрастание времени жизни донора может наблюдаться на фоне увеличения концентрации глюкозы. Таким образом, содержание глюкозы может быть определено путем регистрации времени жизни молекулы донора, расположенной в непосредственной близости от молекулы акцептора [13, 22].

4. Можно также регистрировать интенсивность флюоресценции тканей, если в качестве флуорофора используется сама глюкоза. При облучении тканей светом с длиной волны 308 нм молекулы глюкозы переходят в возбужденное состояние и испускают флюоресцентное излучение, которое может быть зафиксировано на 340, 380 или 400 нм. Таким образом, определение концентрации глюкозы может осуществляться с помощью непосредственного облучения тканей волнами длиной 308 нм с последующей регистрацией интенсивности излучения на 380 нм (данной длине волны соответствует максимальная интенсивность испускания глюкозой флюоресцентного излучения).

5. При спектроскопическом анализе секрета слезных желез применяются включенные в полимерный носитель синтетические производные бороновой кислоты, которые обратимо связываются с глюкозой. К этим молекулам присоединяют флюоресцентные группы, что обусловливает возможность их спектроскопического определения. При взаимодействии с глюкозой группа бороновой кислоты, имеющая sp2-гибридизованную тригональную конфигурацию, принимает более насыщенную электронами sp3-гибридизованную тетраэдрическую форму, что вызывает изменение эмиссионного спектра флюоресцентного фрагмента [26].

При непосредственном оптическом определении глюкозы применяется свет переменной частоты и регистрируются изменения характеристик абсорбции, отражения или преломления (рассеивания) для тканей, содержащих различные концентрации глюкозы [13, 21]. В частности, установлено, что световые волны БИК-диапазона проникают через роговой слой эпидермиса с минимальным поглощением в тканях. Более того, светопоглощающие свойства воды таковы, что в БИК-области имеется интервал (0,8—1,4 мкм), в пределах которого отсутствует абсорбция тканями, что обусловливает глубокое проникновение такого света в эпидермис и подкожную жировую клетчатку независимо от пигментации кожи. Благодаря этому свет БИК-диапазона рассматривается как потенциальное средство регистрации изменений оптических свойств, происходящих под влиянием глюкозы в подкожной жировой клетчатке. К примеру, колебания концентрации глюкозы влекут за собой изменения электрической прочности, поляризуемости и диэлектрической проницаемости подкожной жировой клетчатки, что позволяет регистрировать сдвиги абсорбции, отражения и преломления БИК-излучения соответственно. Ниже приводится ряд методов оптического анализа, основанных на регистрации подобных сдвигов и не требующих введения флуорофоров.

1. Оптическая когерентная томография позволяет измерить концентрацию глюкозы путем определения интенсивности отраженного/рассеянного и пропускаемого света сразу после взаимодействия подкожной жировой клетчатки с глюкозой в определенной концентрации [27].

2. Поляриметрический анализ основывается на способности глюкозы к вращению плоскополяризованных световых волн и возможности последующей количественной оценки ее концентрации, опираясь на величину оптического вращения [28].

3. Тепловая И.К. спектроскопия основана на локальном нагревании ткани при действии света, что приводит к изменениям микроциркуляции, в свою очередь влияющей на показатель оптического преломления ткани. Степень изменения оптического преломления в данном случае непосредственно зависит от концентрации в ткани глюкозы [29].

4. Применение фотоакустической спектроскопии основывается на адсорбции света, проявляющейся локальным нагревом тканей с последующим распространением ультразвуковых волн в результате объемного расширения. Детекция глюкозы с помощью фотоакустической спектроскопии подразумевает облучение тканей светом БИК-спектра с дальнейшей регистрацией скорости распространения ультразвуковых волн. Последняя зависит от удельной теплоемкости облучаемой ткани, которая в свою очередь определяется концентрацией глюкозы [30, 31].

5. В основе Рамановской спектроскопии лежит явление неупругого рассеяния фотонов. При взаимодействии глюкозы с монохроматическим светом возникает обусловленный эффектом Рамана сдвиг энергетического состояния фотонов, пропорциональный колебательной или вращательной энергии молекул глюкозы [30, 32]. Рамановский спектр характеризует специфическую для глюкозы внутримолекулярную (колебательную или вращательную) подвижность связей, поэтому он может использоваться в качестве селективного индикатора ее концентрации. Так, с помощью Рамановской спектроскопии можно дифференцировать галактозу и глюкозу — два эпимера с одинаковым химическим составом, но с разным положением одного атома [21].

6. В сенсорах глюкозы на базе фотонных кристаллов использован эффект смещения длины волны света, подвергшегося дифракции на кристаллическом коллоидном массиве с гидрогелевой основой. Сенсор состоит из полиакриламид-полиэтиленгликолевой сетки с включенными в нее кристаллическим коллоидным массивом и распознающим элементом (например, производным бороновой кислоты), который специфически связывается с глюкозой. В результате взаимодействия глюкозы с распознающим элементом формируются поперечные связи (например, бис-бедентатные), что сокращает объем гидрогеля. Его сжатие инициирует пропорциональное количеству связанной глюкозы смещение дифракции от кристаллического коллоидного массива в коротковолновую часть спектра. Изменения цвета могут быть восприняты визуально (без использования специального оборудования) в пределах видимой части спектра (от красного до фиолетового), что отвечает физиологически значимому диапазону концентраций глюкозы [33]. Поскольку данный механизм реализуется посредством химически индуцированного набухания, проявляющегося механической деформацией и изменением оптических свойств фотонного кристалла, такая технология может быть отнесена к хемо-механо-оптическим преобразованиям.

Помимо электрохимических и оптических подходов, известна также детекция глюкозы, основанная на электрических или электромагнитных преобразованиях. Повышение концентрации глюкозы вызывает снижение концентрации натрия и увеличение концентрации калия в плазме, что изменяет ее диэлектрические свойства и электропроводность. Это позволяет определять глюкозу методом импедансной спектроскопии: путем пропускания переменного тока через ткани для регистрации изменений электропроводности плазмы крови, обусловленных изменениями концентрации глюкозы [34].

С помощью электромагнитной спектроскопии можно определить концентрацию глюкозы, измеряя силу электромагнитного взаимодействия двух индукторов, которая зависит от диэлектрической проницаемости среды, а последняя в свою очередь — от локальной концентрации глюкозы [35].

В данном разделе каждая из технологий НМГ рассматривается с позиции проблем и недостатков, препятствующих дальнейшему развитию и более широкому использованию НМГ в клинической практике. Также обсуждаются возможные подходы для преодоления данных сложностей. Изложение материала соответствует содержанию табл. 1 и 2.

Как и для любого аналитического медицинского оборудования, из всех требований, предъявляемых к устройству НМГ, наиболее важным является точность показаний. И это обусловлено не только перспективами перехода от отдельно стоящего прибора, непрерывно проводящего измерения, к устроенной по принципу замкнутого контура искусственной поджелудочной железе, но и необходимостью подтверждения достоверности показаний для врачей и пациентов.

В соответствии с критериями, разработанными Международной организацией по стандартизации (ISO 15197:2013), сенсор считается точным, если при определении концентрации глюкозы в крови во время гипогликемического эпизода, когда фактическая концентрация глюкозы <4,2 ммоль/л, его погрешность укладывается в величину 0,63 ммоль/л. При фактической концентрации глюкозы >4,2 ммоль/л максимально допустимая погрешность составляет 15% [36].

Однако данные стандарты распространяются исключительно на глюкометры, метрологические стандарты точности для приборов НМГ не утверждены [37]. В то же время разработан нормативный документ РОСТ05-А (подготовленный Институтом клинических и лабораторных стандартов совместно с Диабетическим технологическим обществом), в котором собраны некоторые контрольные показатели точности измерений, а также нормативы, утвержденные для НМГ глюкозы в межтканевой жидкости [38].

Большинство методов оценки точности НМГ состоит в сопоставлении показателей прибора НМГ с соответствующими референсными значениями при помощи методов линейного регрессионного анализа, анализа погрешностей с использованием зон различной клинической достоверности, остаточной суммы квадратов отклонений и среднего абсолютного отклонения [13, 39]. В качестве ориентира для оценки точности сенсора предпочитают применять анализ погрешностей с использованием зон различной клинической достоверности по Кларку, который выражает относительные различия измерений НМГ и клинического анализатора (последние принимаются за «фактическую» гликемию) [40]. Типичная решетка Кларка представляет собой график с нанесением «фактических» значений гликемии по оси х, а показателей тестируемого сенсора – по оси y (рис. 4, а). В случае идеальной корреляции между двумя группами измерений все наносимые на график точки будут лежать на прямой линии, выходящей из начала координат под углом 45°. В случае неидеальной корреляции точки будут разбросаны от линии 45° тем дальше, чем больше ошибка, что, несомненно, следует учитывать при интерпретации результатов. Все поле возможных значений разделено на зоны, расположенные по обе стороны линии 45°, которые отражают не столько математическую разность между полученным и референсным значением, сколько клиническую значимость ошибки [40]:

— Зона А: принятые на основе этих показателей клинические решения приведут и идентичным результатам с решениями, принятыми на основе значений, полученных референсным методом.

— Зона В: показатели не приведут к ошибке в назначении лечения или ошибка будет незначительной и не повлияет на состояние пациента.

— Зона C: использование полученного показателя приведет к серьезной ошибке, которая, скорее всего, ухудшит состояние пациента.

— Зона D: показатель приведет к очень серьезной ошибке, которая сильно ухудшит состояние пациента.

— Зона E: использование такого показателя приведет к фатальной ошибке, которая может оказаться опасной для жизни пациента.

При количественной оценке частоты попадания экспериментальных точек в зоны, А и В обычно учитываются два параметра: линейный коэффициент корреляции между «фактическим» значением гликемии и показателями тестируемого сенсора; доля принадлежащих зонам, А и В экспериментальных точек, выраженная в процентном отношении.

Основным недостатком решетки Кларка является непоследовательность перехода от одной зоны к другой. Это означает, что минимальное изменение зафиксированной сенсором концентрации глюкозы может сдвинуть результат из зоны корректных значений, А в зону критических ошибок D и наоборот. С учетом этого была разработана решетка Паркса (см. рис. 4, б), в которой соблюдена последовательность расположения зон, что предотвращает возможность ошибочного отнесения результата к несоответствующей ему зоне [41]. Тем не менее решетка Паркса строится индивидуально для каждого пациента и не обладает универсальностью, необходимой для оценки точности метода НМГ независимо от его технологии. Стоит заметить, что сведения о преимуществах и недостатках каждого из методов постоянно пересматриваются и актуализируются, и тем не менее процентные доли экспериментальных точек, расположенных в зоне А, полученные для одного и того же устройства НМГ с помощью решеток Кларка и Паркса, не совпадают. Например, точность конкретного устройства НМГ оценивалась в 98,6% на основании анализа с помощью решетки Паркса, тогда как при применении решетки Кларка был получен результат 95% [13].

Как сетка Кларка, так и решетка Паркса были изначально разработаны для оценки клинической безопасности получаемых при самоконтроле тем или иным прибором единичных значений гликемии с учетом погрешности измерений. В чистом виде для оценки клинической значимости погрешности измерений при НМГ данные методы не подходят, так как не учитывают самостоятельное значение континуума получаемых показателей. Для решения этой задачи была разработана модификация сетки Кларка [39]. Модифицированная версия учитывает временны́е характеристики НМГ, а также период задержки, имеющийся между концентрацией глюкозы в крови (референсные значения) и ИСЖ [39]. Модифицированная сетка Кларка может изменяться в зависимости от способа определения концентрации глюкозы и учитывает, что время выравнивания концентрации глюкозы в крови и ИСЖ всегда равно 7 мин (на самом деле, это время может существенно изменяться) [13].

Каждый из компонентов устройства для НМГ является потенциальным источником ошибки измерения. Наиболее значимые погрешности связаны преимущественно с процессом калибровки и с точностью (в том числе с селективностью) самих сенсоров глюкозы.

Калибровка необходима для конвертации первичных данных (например, интенсивности электрического или оптического сигнала), получаемых в результате реакции детекции глюкозы, в информативные для пользователя показатели (значение концентрации глюкозы). Калибровка приборов для НМГ в большинстве случаев не может быть проведена заранее до начала использования пациентом сенсора или устройства (как это происходит при применении тест-полосок глюкометров). Процедура калибровки и ее минимально допустимая частота различаются и сильно зависят от способа детекции глюкозы, степени инвазивности сенсора и т. д. Более того, полученный единожды in vivo калибровочный шаблон не может использоваться на протяжении всего срока эксплуатации прибора НМГ (или сенсора) ввиду ряда причин [42], в том числе:

1. Из-за изменений свойств среды (ткани или жидкости), в которой происходит детекция глюкозы, оказывающих прямое или косвенное влияние на процесс, например:

— реакции тканей на инородное тело при применении инвазивных и малоинвазивных методов, вследствие чего непрерывно изменяются параметры диффузии глюкозы к детекторному элементу сенсора НМГ;

— высокой динамичности физиологического статуса пациента (физическая нагрузка, питание, прием лекарственных препаратов, гипоксия и др.) или места установки сенсора НМГ;

2. Из-за изменений свойств самого прибора или сенсора глюкозы в ходе работы (например, денатурация фермента, расход катализатора, биодеградация детекторных элементов и т. д.).

В связи с указанными факторами все современные устройства НМГ (в особенности, инвазивные и малоинвазивные) требуют регулярной калибровки [43]. Калибровка абсолютного большинства устройств НМГ проводится с помощью внешних приспособлений для измерения гликемии (как правило, глюкометров). При этом калибровка — процесс, направленный на повышение точности показателей НМГ, сама и может быть источником и причиной снижения точности результатов мониторирования. Для каждого способа детекции и вида устройства НМГ причины снижения точности в процессе калибровки будут отличаться. Общим же для всех фактором является низкая точность (большая погрешность) референсного прибора, по которому проводится калибровка [44]: в абсолютном большинстве случаев этим прибором становится персональный глюкометр (допустимая погрешность по ISO 15197:2013±15%).

1. Несоответствие между концентрацией глюкозы в крови и в исследуемой среде (например, в подкожной жировой клетчатке) как во временном, так и в количественном аспекте. Как правило, выявить закономерность таких несоответствий непросто, так как они зависят от физического состояния пациента (физической активности, гипервентиляции, гипоксии, приема лекарственных препаратов и др.) [45]. Например, фактическое время выравнивания концентрации глюкозы в крови и ИСЖ обычно составляет от 12 до 20 мин (или несколько выше для малоинвазивных и микродиализных устройств НМГ, которые требуют переноса ИСЖ из подкожной жировой клетчатки на расположенный экстракорпорально сенсор).

2. Собственное время отклика сенсора (обычно занимает от нескольких секунд до нескольких минут) может суммироваться с фактическим временем выравнивания концентрации глюкозы в крови и исследуемой жидкости, что еще больше усложняет калибровку. В особенности это относится к инвазивным сенсорам, у которых собственное время отклика может варьировать вследствие эффекта обрастания детекторного элемента биологическим материалом и образования тканевых препятствий (например, сгусток крови в месте введения) [4, 46].

Селективность устройства НМГ означает его способность реагировать исключительно на глюкозу из всего спектра циркулирующих в организме метаболитов. Однако существует множество молекул, аналогичных D-глюкозе по электрохимическим и оптическим свойствам, что позволяет говорить о селективности сенсора как об основном препятствии на пути развития технологий НМГ.

В устройствах НМГ, осуществляющих ферментативное окисление глюкозы, селективность сенсора определяется свойствами конкретного фермента, задействованного в устройстве. Оксидазы (наиболее широко применяемые для детекции ферменты) демонстрируют высокую селективность по отношению к глюкозе. Однако такая селективность зачастую нивелируется за счет потребности в высокой концентрации кислорода как косубстрата реакции, без чего не может быть обеспечена линейная кинетика продукции Н2О2 [7]. Снизить зависимость от кислорода можно с помощью внешних мембран, которые значимо сокращают диффузию анализируемого вещества, тогда как возможность пропускания кислорода в тех или иных количествах сохраняется ввиду меньшего размера его молекул. Высокий электрический потенциал, необходимый для корректной работы электрохимических сенсоров на основе оксидаз, делает их восприимчивыми к сторонним сигналам, возникающим в результате взаимодействия с другими эндогенными молекулами, такими как аскорбиновая кислота, мочевая кислота, дофамин и оксид азота. Минимизация такого рода помех достигается нанесением избирательно проницаемых мембран (например, Nafion, а также мембран на основе полиэфирсульфоновой кислоты и ацетата целлюлозы) на поверхность рабочего электрода. Однако применение мембран снижает чувствительность сенсора и увеличивает время отклика. Кроме того, возможен износ имплантированной мембраны вследствие ее кальцификации или биообрастания. Одним из решений является использование вместе с основным рабочим электродом еще одного контрольного, осуществляющего регистрацию фонового тока для корректировки показаний основного электрода [47]. Другой подход заключается в подаче на один и тот же рабочий электрод двух разных потенциалов, один из которых соответствует по значению фоновому току.

Для электрохимических биосенсоров II поколения, задействующих медиаторы электронного транспорта, селективность не является столь значимой проблемой. Такие сенсоры не требуют высокого напряжения, поскольку медиаторы, осуществляющие перенос Н2О2, выполняют свои функции при низком потенциале (0,2—0,3 В относительно хлорсеребряного электрода сравнения; см. рис. 2, в: реакция 6). Известны медиаторы электронного транспорта на основе комплексов осмия и ферроцена, углеродных нанотрубок [48], токопроводящих полимеров [49], а также их комбинаций. Однако доступные для клинической практики устройства НМГ (разрешенные FDA) содержат только комплексы осмия. Электрохимические сенсоры глюкозы III поколения, выполненные на основе наноматериалов, также высокоселективны, однако их биосовместимость окончательно не изучена.

Биосенсоры на основе дегидрогеназ и хинопротеин-глюкозодегидрогеназы не восприимчивы к сторонним сигналам от кислорода и других эндогенных молекул. Однако вопрос об их специфичности по отношению к другим медиаторам электронного транспорта еще не разрешен. Известно их взаимодействие с другими сахарами (например, с лактозой, галактозой, мальтозой, целлобиозой и ксилозой) и наиболее распространенными спиртами [50]. Биосенсоры, осуществляющие прямое электроокисление глюкозы также не очень специфичны и склонны к взаимодействию с другими сахарами.

Для оптических методов детекции глюкозы вопрос селективности более важен ввиду существования множества метаболитов с аналогичными оптическими свойствами. Более того, оптические помехи могут быть значимо выше, чем сами изменения оптического сигнала, отражающие динамику концентрации глюкозы. Наиболее очевидные причины низкой селективности оптических методов перечислены ниже [51].

1. Схожесть БИК-спектра испускания глюкозы с таковым других сахаров (в особенности фруктозы).

2. Частичное наложение БИК-обертона глюкозы на некоторые другие обертоны (например, воды, жиров или гемоглобина). Данное явление значимо затрудняет детекцию глюкозы методами, основанными на поглощении, отражении и рассеянии излучения.

3. Зависимость интенсивности полосы поглощения воды в тканях от концентрации растворенных веществ (т.е. глюкозы и других метаболитов) и температуры. Обычно по мере роста концентрации растворенных веществ интенсивность полосы поглощения воды снижается. Данный эффект, зачастую именуемый «вытеснением воды», не проявляет специфики в отношении анализируемого вещества и может быть потенциальной причиной неспецифичности абсорбционных методов детекции глюкозы. Изменения оптического сигнала могут быть с большей вероятностью вызваны количественными колебаниями других метаболитов.

4. Характеризующие ткань коэффициенты преломления и ослабления также испытывают влияние эффекта вытеснения воды. Вследствие этого детекция глюкозы, основанная на изменении коэффициента преломления ткани в соответствии с изменением ее концентрации, может быть неспецифической (например, при изменении концентрации таких веществ, как креатинин или альбумин).

5. Чрезвычайная зависимость БИК-спектров от различных физиологических параметров (пигментация, гидратация, интенсивность кровотока, рН и др.), а также аппаратных факторов (размещение зонда и его ориентация).

Некоторые из проблем могут быть решены использованием более чувствительных и воспроизводимых способов определения. В качестве альтернативы абсорбционным методам детекции исследуется потенциал Рамановской спектроскопии. Данная методика проявляет высокую специфичность в отношении глюкозы, поскольку детекция основана на отслеживании фундаментальных молекулярных вибраций.

Оптические методы детекции глюкозы с применением флюоресцентных молекул, связанных с распознающими фрагментами, также демонстрируют высокую специфичность в отношении глюкозы. Однако, как уже было сказано, данные методы характеризуются чувствительностью к изменениям концентрации кислорода. К тому же при длительной эксплуатации таких сенсоров проявляются неточности, возникающие в результате денатурации ферментов и фотообесцвечивания флуорофоров [22, 52].

Как правило, отказ устройства обусловлен деградацией ферментов, износом электрода, биообрастанием, отслоением мембраны, неисправностью элемента питания, узла дистанционной передачи сигнала и блока электронной аппаратуры [53]. Однако основную проблему все же представляет стабильность работы in vivo самого сенсора.

Биообрастание препятствует контакту анализируемого вещества с детекторным элементом. Реакция на инородное тело может вызывать колебания показателей концентрации глюкозы вследствие отека и миграции фагоцитов (острая фаза воспаления), а также нарушать доступ сенсора к требуемому уровню определяемого вещества (глюкозы и таких коферментов, как О2 и NAD⁺) при образовании фиброзной капсулы (хроническая фаза воспаления) [54]. В воспалительных процессах, локально протекающих в тканях после имплантации, можно выделить три фазы.

1. Наступающая сразу вслед за имплантацией сенсора острая фаза воспаления, в ходе которой инициируется миграция воспалительных клеток и белков плазмы по направлению к имплантату.

2. Подострая фаза воспаления, включающая адсорбцию фагоцитов на поверхности имплантата в попытке его уничтожить, выброс молекул кислорода и секрецию протеолитических ферментов, предназначенных для расщепления инородного тела, а также отложение фибриногена в зоне повреждения и неоваскуляризацию.

3. Хроническая фаза воспаления протекает с формированием гигантских многоядерных клеток и отложением фибриногена, что приводит к образованию фиброзной капсулы вокруг имплантата (рубцевание), и продолжается от нескольких дней до нескольких лет.

Ранее реакции на инородное тело пытались предотвратить, покрывая сенсор биосовместимыми материалами — Nafion [55], гиалуроновой кислотой [56] и гуминовой кислотой [46]. Однако иммунный ответ организма развивался даже при использовании биосовместимых материалов, т. е. являлся реакцией на саму процедуру имплантации [42]. Исходя из этого, а также учитывая, что реакция на инородное тело определяется в основном спецификой имплантата (его форма, размер, физические и химические свойства, площадь области имплантации), начали разрабатываться более совершенные покрытия для сенсоров: резистентные к биообрастанию и/или высвобождающие лекарственные соединения, активно противодействующие развитию воспалительного процесса в тканях.

Основной задачей и того и другого подхода являлась ассимиляция сенсора окружающими тканями. Покрытия, резистентные к биообрастанию, препятствовали адсорбции белков за счет создания гидрофильного слоя между поверхностью сенсора и тканевыми жидкостями. Биосовместимые покрытия с высвобождением лекарственных веществ предельно ограничивали развитие воспаления, обусловленное травматизацией ткани и кровоизлиянием, а также предотвращали ишемию за счет повышения васкуляризации; в результате необходимый доступ к анализируемому веществу непрерывно сохранялся в течение продолжительного времени [57].

Среди покрытий, резистентных к биообрастанию, известны такие гидрофильные полимеры, как фосфорилхолин, полиуретаны с полярными фосфолипидными группами и насыщенные водой гидрогели. Они предназначены для снижения белковой адсорбции на поверхности сенсора, за счет чего притупляется реакция на инородное тело. С другой стороны, покрытия, способные высвобождать модуляторы тканевой реакции в месте имплантации, редуцируют локальное воспаление и повышают местную васкуляризацию ткани. В частности, в покрытие сенсора вводят лекарственные вещества с противовоспалительной активностью (дексаметазон); факторы роста, стимулирующие неоваскуляризацию (фактор роста сосудистого эндотелия и тромбоцитарный фактор роста); вазодилататоры (оксид азота) и антикоагулянты (гепарин) [42, 58, 59]. Однако благоприятное действие таких модуляторов сохраняется лишь временно.

Установлено, что нанотекстурные поверхности способствуют васкуляризации вокруг имплантата. К таким поверхностям относится нанопористый диоксид титана, нанопористый кремний и нанопористый углерод [60, 61]. Предполагается, что высокие значения аспектного отношения, характерные для поверхностей на основе этих наноматериалов, позволяют воздействовать на процессы клеточной пролиферации и дифференцировки. Однако применение наноструктурных поверхностей сдерживается их иммуногенностью. Имеется ряд данных, ставящих под вопрос биосовместимость и возможную токсичность наноматериалов [7, 62].

Ферменты являются важным функциональным элементом многих устройств НМГ, поскольку определяют специфичность прибора в отношении глюкозы. Тем не менее ограниченная во времени стабильность и активность иммобилизованных ферментов значительно сокращает длительность эксплуатации устройств НМГ. При длительном использовании происходит естественная денатурация иммобилизованных белковых ферментов в сенсорах. Для снижения скорости естественной денатурации ферментов используют различные подходы, в том числе на базе нанотехнологий [63]. К примеру, каталитическая активность фермента сохраняется при иммобилизации на таких наноструктурных основах, как цеолиты и фосфаты.

Неисправность сенсора вследствие полной потери ферментативной активности встречается редко [53], однако ионы переходных металлов (Zn²⁺ и Fe²⁺), низкомолекулярные сывороточные компоненты [64] и H2O2 могут ингибировать каталитическую активность ферментов. Последнее может вызывать наибольшие проблемы, учитывая, что для электрохимических сенсоров глюкозы первого поколения H2O2 также является сигнальной молекулой. Избыточное введение GOx в структуру сенсора может продлить срок его службы [65], однако какой-либо избыток свободной (т.е. не имеющей поперечных связей) GOx, изначально размещенной под слоем фермента, поперечно сшитого с глутаральдегидом, будет медленно вымываться из-под него. Такие потери постепенно снижают чувствительность сенсора.

Интенсивность сигнала от сенсора зависит от концентрации флуорофора, которая в свою очередь определяется его стабильностью. Однако большинство применяемых флуорофоров подвержено быстрому фотообесцвечиванию, которое радикально сокращает срок службы соответствующих устройств НМГ. Скорость фотообесцвечивания и возможная продолжительность эксплуатации сенсора находятся в обратно пропорциональной зависимости. Например, сенсор глюкозы на основе однослойных углеродных нанотрубок (IR-Fye-78-CA) со скоростью фотообесцвечивания 250 ч^–1 имеет номинальный срок службы 3,2 с, что в 3000 раз меньше такового для сенсора, в котором применен флуорофор на базе квантовых точек с характерной скоростью фотообесцвечивания 0,082  ч^–1 [52]. При этом флуорофоры, работающие по принципу квантовых точек и обладающие высокой устойчивостью к фотообесцвечиванию, до сих пор не могут применяться в составе имплантируемых сенсоров из-за потенциальной токсичности. То же справедливо для флуорофоров на основе углеродных нанотрубок, которые не подвержены фотообесцвечиванию и уже применяются в лабораторных условиях для оптической детекции глюкозы.

Немаловажную роль играют размеры устройств НМГ. Среди одинаковых по производительности устройств (мобильные телефоны, ноутбуки или медиа-плееры) наиболее компактные в своем классе, как правило, наиболее привлекательны для потребителя. Предполагается, что потребительские предпочтения в отношении устройств НМГ также будут подчиняться этой общей закономерности. Кроме того, размер имплантата определяет степень травматизации при имплантации устройства, от чего в свою очередь зависит выраженность реакции на инородное тело. Вопрос размера наиболее актуален для двух классов устройств НМГ:

1) частично имплантируемых устройств на основе микродиализных или чрезкожных имплантатов;

2) полностью имплантируемых моделей, предполагающих размещение всех элементов питания, детекции и беспроводного сообщения на максимально ограниченном участке в теле человека.

Микродиализные системы снабжены имплантируемым зондом для забора биологических жидкостей, а также закрепляемым на поверхности тела детекторным элементом с портативным элементом питания и модулем беспроводного соединения. Чрезкожные системы, напротив, оборудованы детекторным элементом, помещаемым во внутреннюю среду организма, который оснащен выводом на поверхность кожи для подключения к блокам питания и беспроводного соединения. Главное различие между полностью и частично имплантируемыми сенсорами состоит в присутствии открытой раневой поверхности во втором случае, которая потенциально служит входными воротами инфекции, что неизбежно сводит к нулю преимущества компактного размещения сенсора. К тому же для частично имплантируемых устройств характерен менее продолжительный период корректной работы in vivo.

Ожидается, что миниатюризация имплантируемых электрохимических устройств НМГ значительно продвинется в грядущие годы в рамках новой отрасли микро- и наноиндустрии. Аналогичная тенденция предвидится в отношении имплантируемых оптических устройств НМГ, однако синхронизация оптических компонентов может оказаться более проблематичной. По мере дальнейшего развития нанотехнологической концепции в индустрии полупроводниковых и оптических коммуникаций также ожидаются существенные сдвиги, которые могут способствовать постепенной миниатюризации управляющего электронного звена, узла контроля энергообеспечения, оптических элементов и модуля беспроводной передачи сигнала. В настоящее время основная проблема миниатюризации состоит в энергетическом обеспечении микросхем сенсора и блока беспроводного соединения, т. е. в размере элементов питания [66, 67].

Инвазивные устройства НМГ должны обладать детекторным элементом, размер которого обеспечит его легкую имплантацию, а также извлечение. Необходимо, чтобы имплантируемое устройство имело чрезвычайно малые размеры, что предполагает высокую степень миниатюризации электродов, источников питания, узлов обработки сигнала и детекторных элементов. Более того, миниатюрные биосенсоры, имплантируемые с помощью ультратонких игл (аналогичные тем, что используются при иглоукалывании), меньше травмируют ткани, а следовательно, не вызывают выраженной реакции на инородное тело [68]. Детекторные элементы большинства известных инвазивных устройств получены путем иммобилизации ферментов на ультратонких платиновых проводах (диаметр менее 25 мкм) и углеродных нановолокнах [69] или заключения флуорофора в миниатюрную полимерную капсулу [52]. Активно развивается подход к получению микро-/наноматериалов путем разложения соответствующих макроструктур с помощью традиционных полупроводниковых процессов. Посредством микрообработки были получены кремниевые иглоподобные структуры для мониторирования концентрации глюкозы [70, 71]. Аналогичные принципы могут применяться и для оптической детекции. В частности, электроды могут быть заменены заполняющими каналы флуорофорами.

Критическая оценка различных технологий НМГ должна быть направлена не только на конкретные преимущества, свойственные тому или иному подходу, а скорее на целостное рассмотрение различных физико-химических и физиологических факторов, тесно связанных с функционированием устройства и образом жизни больного. К примеру, в отличие от инвазивных приборов неинвазивные устройства НМГ не требуют имплантации и не вызывают реакций на инородное тело, но при этом имеют недостатки, связанные с селективностью и точностью измерений. Хотя малоинвазивные устройства могут быть компромиссом между инвазивными и неинвазивными подходами, дискомфорт при использовании, наличие открытой раневой поверхности и короткий срок службы приборов обязательно должны приниматься во внимание. Инвазивные устройства более удобны в применении и практически не обременяют пациента, если не считать необходимости имплантации/извлечения сенсора. Еще одна альтернативная технология заключается в применении биоразлагаемых сенсорных систем, напоминающих татуировки [72]. К сожалению, данная технология не отличаются высокой селективностью, а также требует регулярной калибровки по глюкометру.

Электрохимические и оптические способы определения глюкозы с применением флуорофоров наиболее перспективны с точки зрения селективности и чувствительности. Технологии детекции, основанные на прямом оптическом определении глюкозы, более трудны в реализации ввиду высокой вариабельности результатов на фоне изменения таких параметров, как температура, рН, характер рассеяния излучения тканями, пигментация кожи и уровень гидратации. При этом калибровка и связанные с ней негативные последствия (погрешность) в равной степени остаются проблемой для всех устройств НМГ, независимо от технологии детекции и степени инвазивности. Возможно, параллельное измерение нескольких параметров или метаболитов сенсорными системами значительно повысит точность и надежность определения глюкозы.

На текущий момент не проведено детальных исследований связи между выраженностью реакции на инородное тело и размерами сенсора, а также его локализацией in vivo. Тот факт, что применение простых неиммуногенных материалов при производстве инвазивных сенсоров позволяет лишь незначительно снизить интенсивность реакции на инородное тело, привел к разработке более совершенных способов с использованием систем лекарственной доставки материалов с контролируемыми свойствами и биомиметических подходов. В качестве целей для будущих исследований можно предложить поиск корреляций размера имплантата и свойств оболочки сенсора с различными связанными между собой параметрами, в числе которых иммуногенность, цитотоксичность, генотоксичность, сенсибилизация и раздражение тканей, интрадермальная реактивность, гемосовместимость, хроническая токсичность и биоразложение. Однако разработка таких устройств требует скоординированной работы специалистов из разных научных отраслей, таких как химия, наука о материалах, инженерное дело, фармация и медицина. Вероятность создания совершенных устройств НМГ в относительно недалеком будущем представляется довольно высокой.

Работа проведена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 14−25−00181).

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов.