По определению ВОЗ, бесплодие — неспособность сексуально активной, не использующей контрацепцию пары добиться беременности в течение одного года [1]. Бесплодие является важной медицинской, социальной, демографической и экономической проблемой современности. От бесплодия страдают 15% всех пар репродуктивного возраста в мире и даже после проведенной терапии 5% пар все еще не могут завести желанного ребенка [2]. Именно поэтому данная проблема является весьма актуальной.

Несмотря на то что зачастую стигматизации подвергаются именно женщины, вклад мужского и женского факторов в структуру бесплодного брака примерно равноценен [3].

Бесплодие обычно проявляется тогда, когда оба партнера субфертильны. Это объясняет тот факт, почему у бесплодной пары часто имеется сосуществование мужских и женских факторов. В случае же наличия только одного патологического фактора другой партнер может компенсировать этот недостаток своего менее фертильного партнера [4].

Причинами мужского бесплодия могут быть врожденные и приобретенные аномалии органов мочеполовой системы, варикоцеле, эндокринные нарушения, инфекции мочевых и половых путей, генетические аномалии и иммунологические факторы, прием лекарственных препаратов, ранее перенесенные заболевания, нарушение эрекции и/или эякуляции.

В свою очередь, по некоторым данным [5], генетические факторы обусловливают до 50% случаев тяжелого нарушения сперматогенеза. Около 15% из них занимают микроделеции в локусе фактора азооспермии (AZF).

Этот локус расположен в длинном плече хромосомы Y, разделяется на три субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc и включает гены, принимающие непосредственное участие в процессе развития, созревания и формирования сперматозоидов (см. рисунок).

Делеции AZF могут быть как полными, затрагивающими один, два или все три AZF субрегиона, так и частичными, когда отсутствует какой-либо участок AZF субрегиона. Клинические проявления делеций варьируют в зависимости от длины участка и его локализации.

После нескольких лет клинических исследований были установлены некоторые особенности AZF делеций.

Делеции наиболее часто возникают в субрегионе AZFc (приблизительно 65—70%), далее — в субрегионах AZFb и AZFb+c или AZFa+b+c (25—30%), в то время как делеции в субрегионе AZFa встречаются значительно реже (5%) [2].

Полная делеция субрегионов AZFa ассоциируется с азооспермией и синдромом «только клеток Сертоли». Делеции, охватывающие весь регион AZFb, связаны с азооспермией, возникшей в результате прекращения мейоза и созревания сперматозоидов на стадии сперматоцитов. В случаях полной утраты субрегионов AZFa и AZFb биопсия яичка, как правило, не позволяет получить зрелые сперматозоиды.

Полная делеция субрегиона AZFc приводит к различному фенотипу, от азооспермии до олигозооспермии [6]. При этом у пациентов с делециями в локусе AZFc и азооспермией при биопсии яичка довольно часто могут быть получены и успешно использованы в циклах ИКСИ тестикулярные сперматозоиды [7, 8].

Также не менее важным фактом является возможность передачи потомству мужского пола делеций AZF. Помимо этого, частичные делеции субрегиона AZFc располагают к появлению полных делеций в последующих поколениях. Мальчики, рожденные после применения ИКСИ у отцов с микроделециями в хромосоме-Y, подлежат диспансерному наблюдению для оценки их фертильного статуса [2].

Для определения микроделеций в регионах используются STS-маркеры (Sequence-Tagged-Sites), которые маркируют соответствующие участки локуса AZF. Как следует из рекомендации Европейского общества андрологов, анализа только одного не полиморфного STS в каждом из субрегионов AZF достаточно для определения существования делеций в AZFa, AZFb или же AZFc. Однако исследование двух маркеров усиливает диагностическую точность. На основании опыта многих лабораторий рекомендуется следующий набор из шести STS-праймеров, делеции которых жестко ассоциированы с нарушением сперматогенеза:

— для AZFa: sY84, sY86;

— для AZFb: sY127, sY134;

— для AZFc: sY254, sY255 [9].

При всем этом использование такого ограниченного количества специфичных маркеров не может в полной мере отразить всю диагностическую картину и до ¼ случаев мужского бесплодия остаются идиопатическими [10]. Как видно на рисунке, более целесообразно исследование целых блоков, а не только единичных маркеров.

Именно поэтому в настоящее время обсуждается возможность расширения числа изучаемых маркеров локуса AZF для уточнения причины бесплодия.

Цель настоящего исследования — определение клинической значимости расширенного спектра STS-маркеров.

Всего были комплексно обследованы 218 мужчин из бесплодных супружеских пар. По результатам кариотипирования из исследования были исключены 13 мужчин в связи с выявленными у них нарушениями кариотипа, такими как синдром Кляйнфельтера, де ля Шапеля (синдром ХХ-male), и различными деривациями и инверсиями хромосом.

Остальные 205 человек были разделены на две группы в зависимости от состояния сперматогенеза: 143 пациента с азооспермией и тяжелой формой олигозооспермии (концентрация сперматозоидов менее 5 млн в 1 мл) составили основную группу и 62 пациента с нормозооспермией — контрольную. Анализ эякулята проводился двукратно, согласно рекомендациям ВОЗ 2010 г. [11].

Медиана возрастного состава в основной группе — 32 года (интерквартильный интервал 21—52 года), в группе контроля — 35 лет (25—52 года).

Кроме того, по результатам физикального обследования и данным анамнеза в основной группе были выявлены 66 человек с гипогонадизмом, 36 — с варикоцеле, 19 — с обструкцией семявыносящего протока, 14 — с крипторхизмом в анамнезе. В контрольной группе 10 — c гипогонадизмом, 6 — с варикоцеле, 2 — с крипторхизмом в анамнезе.

Всем мужчинам, участвующим в исследовании, был проведен молекулярно-генетический анализ для выявления делеций AZF по наличию следующих STS-маркеров: AZFa: sY86, sY84, sY615; AZFb: sY127, sY134, sY142; AZFc: sY242, sY254, sY1291, sY255, sY1192, sY1197, sY1206, sY1125 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени коммерческим набором ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия).

Для выявления делеций в локусе AZF хромосомы Y всем мужчинам проводился молекулярно-генетический анализ.

Забор крови у обследуемых осуществлялся в стандартные пробирки с ЭДТА. ДНК для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) выделяли из лейкоцитов периферической крови, используя коммерческие наборы ДНК-Технология, Проба-Рапид-Генетика. Полученные образцы ДНК использовали для типирования сразу либо хранили при –20 °С. ПЦР проводили с помощью наборов производства ДНК-Технология.

Амплификацию и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 производства НПФ ДНК-Технология. Температурный режим амплификаци: денатурация при 94 °C в течение 5 с, отжиг, элонгация и детекция флуоресценции при 64 °C — 15 с (50 циклов). Типирование проводилось по 14 STS-маркерам: sY84, sY86, sY615, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1192, sY1291, sY242, sY1125, sY1197, sY1206 и sY142.

Использовали 8 мультиплексных систем для ПЦР со следующими парами праймеров и зондов: система 1 (sY134, sY242), система 2 (sY142, sY255), система 3 (sY615, sY254), система 4 (sY1125, sY84), система 5 (sY1197, sY86), система 6 (sY1206, sY127), система 7 (sY1291). В систему 8 были включены праймеры и зонды для амплификации ДНК гена половой принадлежности (SRY), а также зонды для амплификации ДНК гена рецептора гормона роста в качестве дополнительного контроля амплификации. Для внешнего контроля были использованы образцы крови женщин.

При отсутствии амплификации какого-либо из фрагментов ПЦР проводили еще раз и при повторении результата определяли у пациента делецию. Положительный (образец ДНК мужчины-донора) и отрицательные (образец ДНК женщины, отсутствие ДНК) контроли ставили в каждом ПЦР-эксперименте.

При анализе качественных признаков (данные по наличию или отсутствию мутаций) оценивали частоту встречаемости в процентах. Количественные данные представлены в виде медианы и интерквартильного интервала. Для оценки значимости различий в распределении соответствующих признаков между группами использовали χ². При p<0,05 различие двух групп полагали статистически значимым.

Средний возраст пациентов основной группы составил 33 (21; 52) года, в контрольной группе — 35,4 года (25 лет; 52 года). Медиана возрастного состава в основной группе — 32 (21; 52) года, в группе контроля — 35 лет (25 лет; 52 года).

Среди мужчин с азооспермией и олигозооспермией (основная группа) делеции AZF: sY127, sY134, sY142, sY242, sY254, sY1291, sY255, sY1192 были выявлены у 32 (22%) мужчин, sY1197, sY1206, sY1125. Наибольшая частота делеций в основной группе наблюдалась для двух маркеров: sY1192 — 20,98% случаев (изолированно данная делеция встречалась в 11% случаев) и маркера sY1291 — в 9,79% (изолированно делеция встретилась только у одного пациента). Изолированные делеции этих участков также встречаются и у пациентов с нормозооспермией: sY1192 — у 8,06%, sY1291 — у 3,23%. Различия между группами по маркерам sY1192 и sY1291 не достигают статистической достоверности.

При этом следует отметить, что у мужчин с изолированно встречающимся маркером sY1192 у 10 из 14 были обнаружены такие патологии и их сочетания, как варикоцеле, крипторхизм в анамнезе, обструкция семявыносящего протока и гипогонадизм. Возможно, бесплодие в данном случае может объясняться этими причинами. У мужчины с изолированно встречающимся sY1291 сочетались гипогонадизм и варикоцеле.

Обращает на себя внимание уровень ФСГ у пациентов с делециями AZF. В основной группе доля мужчин с повышенным уровнем ФСГ (при норме 0,95—11,95 мЕД/мл) составила 35,71%. Среди мужчин этой же группы, но только с делециями процент был намного выше — 43,75%, что может указывать на увеличение риска секреторного бесплодия у пациентов с делециями.

По другим маркерам частоты микроделеций в группе с нарушением сперматогенеза были следующими: sY127, sY134 и sY142 у 5 (3,50%) человек; sY242, sY254, sY255, sY1206 — у 10 (6,99%); sY1197 — у 7 (4,90%); sY1125 — у 1 (0,70%). В группе с нормозооспермией данных делеций выявлено не было. Наглядно результаты представлены в таблице.

В пользу применения расширенного набора маркеров свидетельствует тот факт, что у 4 мужчин с азооспермией из основной группы были выявлены всего 2 маркера из классической панели, что требует дальнейших диагностических исследований. Наряду с этим в расширенной панели у них наблюдалось до 6 делеций. Так, в классическом варианте были выявлены делеции субрегиона AZFb sY127 и sY134, но отсутствовали остальные маркеры из классической панели. Использование панели из 14 маркеров показало, что имеется также и частичная делеция субрегиона AZFс. При этом сопутствующие патологии, которые могли бы повлиять на фертильность, у мужчин отсутствовали.

Делеции sY1197 совместно с делецией sY1192, без включения «классических» маркеров региона AZFc (sY254, sY255) встретились у 2 мужчин с азооспермией. В группе мужчин с сохраненным сперматогенезом подобных делеций не выявлено. Делеции маркеров sY1192 и sY1291 встречались как у мужчин с нарушением сперматогенеза, так и в группе с нормозооспермией. Причем делеция sY1192 изолированно встречается в обеих группах практически с одинаковой частотой — 11 и 8,06% соответственно. Исходя из полученных результатов исследования [12, 13], диагностическая значимость изолированной делеции маркера sY1192 не представляет интереса, что подтверждает результаты прошлых исследований. Делеция маркера sY1291, так называемая «gr/gr»-делеция, встречалась в 3 раза чаще в группе исследования, однако разница была статистически незначимой, что может быть следствием малого числа наблюдений. Требуются дополнительные исследования по ассоциации «неклассических» AZF-делеций с тяжестью нарушений сперматогенеза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.