Эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от проводимой стимуляции функции яичников, которая является ключевым этапом, во многом определяющим успех лечения бесплодия. Правильный выбор препаратов для стимуляции яичников в программах ЭКО является актуальной задачей современной репродуктивной медицины. На сегодняшний день в мире существуют протоколы лечения с различными дозами гонадотропинов, применяемые для улучшения ответа яичников и повышения частоты наступления беременности у пациенток различных групп [1, 2]. В соответствии с доминирующей в настоящее время «концепцией индивидуализации» программ ЭКО проведение контролируемой стимуляции яичников (КСЯ) подразумевает выбор такого протокола, типа гонадотропина и дозы, которые обеспечат максимальную эффективность и безопасность лечения [3, 4]. Оптимальным ответом яичников на стимуляцию является такой, который подразумевает получение 8—10 ооцитов. Это количество сопряжено с хорошим качеством ооцитов и эмбрионов, с отсутствием такого опасного осложнения, как синдром гиперстимуляции яичников [5, 6]. Также на сегодняшний день является важным вопрос о качестве ооцитов и эмбрионов, получаемых в результате стимуляции функции яичников. Исследование факторов, влияющих на качество ооцитов и эмбрионов, и, следовательно, на исход программ ВРТ у пациенток, может повысить уровень успешности лечения бесплодия.

Цель настоящего обзора — проанализировать результаты имеющихся публикаций, посвященных прогностической ценности морфологических особенностей ооцитов в метафазе (МII) человека. Оценка ооцитов, полученных в ходе проведения IVM (in vitro maturation), и/или криоконсервированных ооцитов в данном обзоре не проводилась вследствие различных методов, используемых для этих процессов.

Основная роль изучения качества полученных ооцитов принадлежит морфологической оценке, являющейся ключевым элементом лабораторной работы, проводимой в каждой лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), с использованием инвертированного микроскопа по международно-признанным критериям оценки гамет и эмбрионов. Однако некоторые из используемых параметров представляют сомнительную ценность при проведении качественной оценки гамет и эмбрионов [7]. Внедрение time-lapse технологий для анализа развития эмбрионов может дать более детальную информацию о цитоморфологических особенностях эмбриона и позволит получить более точную прогностическую оценку [8, 9], но данная технология из-за высокой стоимости оборудования все еще не распространена в клинической практике. В повседневной работе каждой лаборатории ВРТ, в особенности в случае проведения ИКСИ, качественная оценка ооцитов оказывается довольно поверхностной и часто ограничивается лишь регистрацией наличия грубых нарушений морфологии, что дает недостаточную информацию о стадии зрелости ооцита, а также о наличии дегенеративных признаков в цитоплазме. Впоследствии все ооциты, достигшие стадии MII, подвергаются оплодотворению, и с этого момента потенциал развития полученного эмбриона оценивается исключительно на основе морфологии собственно эмбриона, независимо от качества ооцита, из которого он был получен.

Традиционно в лаборатории ВРТ большое внимание уделяется цитоморфологической оценке сперматозоидов и эмбрионов. Следует признать, что морфологическая оценка ооцитов осуществляется условно, так как нет общепринятых понятных критериев для проведения оценки ооцитов. Несмотря на то что именно качество ооцитов является ключевым ограничивающим фактором в женской фертильности, который играет решающую роль в оплодотворении и развитии [10, 11].

Применение стимуляции яичников при лечении методами ВРТ еще больше усложняет ситуацию. В отличие от процесса в живом организме, где созревание ооцитов — результат длительного и многофакторного процесса отбора доминирующего фолликула [12], стимуляция яичников подавляет этот процесс и позволяет получить зрелые ооциты и из фолликулов, которые в естественном цикле были бы «обречены на провал» [13]. Качество ооцитов определяется не только ядерным и митохондриальным геномами, а также микроокружением, обеспечиваемым яичником и преовуляторным фолликулом, которые могут менять транскрипции и трансляции и, как следствие, цитоплазматическую зрелость ооцита [11]. Из-за сложной картины весьма маловероятно, что единственный фактор или механизм может адекватно показать компетентность развития ооцитов [7].

Ооциты, полученные в ходе проведения овариальной стимуляции, демонстрируют один или несколько морфологических критериев, описанных как идеальные [14—20]. Несколько других морфологически обнаруживаемых особенностей ооцитов на стадии MII указывают на высокий риск нарушений дальнейшего развития. Согласно данным рабочей группы по оценке эмбрионов, проходившей в Стамбуле [21], экстрацитоплазматические аномалии (морфология полярных телец, размер перивителлинового пространства, аномалии zona pellucida) являются фенотипическими вариациями, часто связанными с in vitro культивированием и/или возрастом ооцитов. С другой стороны, специфические отклонения в цитоплазматической структуре (интрацитоплазматические аномалии), такие как, например, агрегация эндоплазматического ретикулума (SER), характеризуют ооциты как некачественные, имеющие высокий риск последующих нарушений развития [22].

Морфология ооцитов также может отражать серьезные генетические аномалии: так, гигантские ооциты могут содержать дополнительный набор хромосом [7].

Наличие первого полярного тельца считается основным маркером зрелости ооцита. Однако в некоторых исследованиях с использованием поляризационной микроскопии было показано, что ооциты, имеющие полярное тельце, все еще оставались незрелыми [7, 23]. Дополнительная информация о стадии зрелости ядра ооцита может быть получена при использовании поляризационной микроскопии в сочетании с программным обеспечением для обработки изображений. Использование этого метода позволяет регистрировать состояние веретена MII у ооцитов с первым полярным тельцем. Так, было показано, что у 80% ооцитов, полученных спустя более 38 ч после введения хорионического гонадотропина человека (чХГ), обнаруживается веретено MII, т. е. наблюдается полная зрелость ооцита [24]. Кроме того, ооциты с хорошо различимым веретеном МII после оплодотворения развиваются в эмбрионы нормальной морфологии в достоверно большем числе случаев [25]. Следует отметить, что факторы внешней среды, такие как неоптимальные условия культивирования или колебания температуры во время манипуляций, могут приводить к разрушению веретена деления [24].

Ооциты с аномалией формы достаточно часто обнаруживаются в когорте ооцитов, полученных с помощью овариальной стимуляции. Однако, как было показано, такая морфология ооцитов не коррелирует ни с частотой оплодотворения, ни с качеством эмбрионов [26]. Только ооциты, имеющие выраженный дисморфизм, снижают имплантационный потенциал эмбриона [18].

Также современные методы поляризационной микроскопии позволяют количественно оценить толщину и структуру наружного, среднего и внутреннего слоев оболочки ооцита. Так, известно, что истонченная zona pellucida является следствием недостаточного уровня экспрессии белков зоны и может служить признаком снижения уровня жизнеспособности ооцита и его потенции к нормальному развитию [27].

Из экстрацитоплазматических аномалий ооцита также желательно учитывать состояние перивителлинового пространства. Некоторые авторы отмечают, что его увеличение, а также наличие грануляции в перивителлиновом пространстве соответствуют перезревшим ооцитам и отрицательно коррелируют с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов [15, 20].

Описано несколько морфологических изменений цитоплазматической структуры ооцита, которые снижают вероятность нормального развития и имплантационный потенциал эмбриона: вязкость цитоплазмы и резистентность клеточной мембраны во время ИКСИ; наличие вакуолей и цитоплазматических включений; наличие кластеров шероховатого эндоплазматического ретикулума (ШЭР); рефракционные (преломляющие) тельца/липофильные тельца; избыточная грануляция ооцитов [29—32].

Вязкость и резистентность цитоплазмы коррелируют с несколькими клиническими параметрами — это частота оплодотворения, качество эмбрионов, частота формирования бластоцисты [11, 29].

Вакуоли часто наблюдаются в ооцитах, их размер, количество могут варьировать в течение всего преимплантационного периода развития эмбриона. Кроме того, вакуоли могут появляться в результате проведения ИКСИ при внесении в цитоплазму ооцита избыточного объема поливинилпирролидона или культуральной среды. Наличие небольших вакуолей в ооците (5—10 мкм в диаметре) не влияет на частоту оплодотворения и качество эмбрионов [7, 30, 31]. Однако, по данным ряда авторов [7, 32, 33], наличие нескольких вакуолей или одной вакуоли размером более 14 мкм в диаметре является негативным прогностическим признаком, так как частота оплодотворения таких ооцитов существенно снижается. Кроме того, по данным J. Otsuki и соавт. [32], при наличии в ооците вакуолей увеличивалась частота биохимической беременности с последующим снижением частоты клинической беременности.

Одной из наиболее значимых цитоплазматических аномалий зрелых ооцитов является агрегация ШЭР в цитоплазме. Кластеры ШЭР идентифицируются как полупрозрачные вакуолеподобные структуры в цитоплазме ооцита. Агрегация ШЭР происходит в результате процесса старения ооцита и ассоциируется с риском серьезных неонатальных последствий [18, 19]. Согласно рекомендациям рабочей группы по оценке эмбрионов, проходившей в Стамбуле в 2011 г. [21], ооциты, имеющие выраженную агрегацию ШЭР, не должны оплодотворяться из-за высокого риска осложнений беременности. Ооциты, в цитоплазме которых наблюдалась агрегация ШЭР, в последующем имели низкую частоту имплантации [33]. Этой же группой исследователей ранее было показано, что при высоких концентрациях эстрадиола в крови пациентки в день введения триггера овуляции (чХГ) наблюдаются ооциты с агрегацией ШЭР. Кроме того, концентрация эстрадиола на аспированный ооцит в день введения чХГ была выше в тех случаях, где в ооцитах наблюдалась агрегация ШЭР [34].

Рефракционные (преломляющие) тельца/липофильные тельца также являются морфологической аномалией, достаточно часто встречаются в цитоплазме ооцита. Ооциты с большими рефракционными тельцами (более 5 мкм в диаметре) имеют значительно низкую частоту оплодотворения [33].

Степень грануляции цитоплазмы также является важным прогностическим критерием при оценке качества ооцита. Так, по данным, опубликованным группой эмбриологов Европейской ассоциации репродукции и эмбриологии человека (ESHRE) [21], слегка гетерогенная цитоплазма полученных ооцитов представляет нормальную вариабельность. Ооциты с гетерогенной гранулярной цитоплазмой имеют лучшие показатели развития по сравнению с ооцитами, у которых грануляция в цитоплазме отсутствует. При оценке качества ооцитов важно отличать морфологические различия гранулированной цитоплазмы (равномерно распределенная грануляция или центрально локализованная) [21, 30]. В научной литературе [16, 20, 30, 31] встречаются различные термины, описывающие грануляцию цитоплазмы: «темная цитоплазма», «темная цитоплазма-гранулированная цитоплазма», «темная цитоплазма с проявлениями грануляции, «диффузная цитоплазматическая грануляция». Различная терминология может быть причиной дискуссий о влиянии данной аномалии на развитие эмбрионов [11]. С темной цитоплазмой некоторые авторы [14, 16, 18, 35] связывают низкое качество эмбрионов. Диффузная периферическая грануляция ассоциируется с неравномерным формированием пронуклеусов. Однако любой тип грануляции цитоплазмы ооцитов коррелирует с высокой частотой оплодотворения по сравнению с ооцитами, у которых грануляция цитоплазмы полностью отсутствует [20]. В отличие от агрегации ШЭР, центрально локализованную агрегацию цитоплазмы ооцита связывают с незрелостью цитоплазмы ооцита [32, 36]. С данным видом аномалии связывают низкую частоту имплантации, высокую частоту прерывания беременности и высокую частоту анеуплоидии [32].

Традиционно КСЯ в программе ЭКО всегда приходилась на начало фолликулярной фазы менструального цикла. В настоящее время появляется все больше доказательств в пользу теории непрерывного (волнообразного) фолликулогенеза [37, 38]. Одним из них является стимуляция функции яичников в лютеиновую фазу менструального цикла [39—43].

Первоначально стимуляция функции яичников в лютеиновую фазу была предложена для получения зрелых яйцеклеток и эмбрионов с последующей их криоконсервацией при экстренном сохранении генетического материала у пациенток с онкологическими заболеваниями [39, 42].

В недавних исследованиях авторами [40, 43] было показано, что инициация стимуляции яичников как в поздней фолликулярной, так и лютеиновой фазах так же эффективна для сохранения фертильности, как и обычная стимуляция со стандартным стартом. Число полученных ооцитов, степень их зрелости и частота оплодотворения были идентичными во всех трех группах. Основным преимуществом «двойной стимуляции» является получение большего количества ооцитов и жизнеспособных эмбрионов, благодаря стимуляции яичников в один менструальный цикл, что крайне актуально в лечении пациенток со сниженными показателями овариального резерва.

Результаты исследований, проведенных у онкологических пациенток для сохранения генетического материала, свидетельствуют об удовлетворительном количестве и качестве получаемых ооцитов/эмбрионов [40, 42]; появились данные о высокой клинической эффективности программ ЭКО со стимуляцией, проведенной в лютеиновой фазе менструального цикла [43].

Так как отбор ооцитов перед оплодотворением может иметь важные преимущества в определенных ситуациях, необходимо в полной мере использовать интеллектуальный потенциал морфологической оценки. Из-за сложности механизмов, связанных с созреванием ооцитов, маловероятно, что один параметр (за исключением размера ооцита) может адекватно отображать качество ооцита. Чтобы получить информацию о потенциале ооцита, необходимо сочетать морфологическую оценку ооцита с другими методами исследования (электронная микроскопия, конфокальная микроскопия, time-lapse микроскопия, исследование на анеуплоидии и др.). Дальнейшее прогностическое значение может быть получено путем комбинированной морфологической оценки ооцитов, зигот и эмбрионов.

В связи с вышеперечисленным представляется актуальным, современным и перспективным исследование по изучению качества ооцитов и эмбрионов, получаемых при стимуляции яичников в различные фазы менструального цикла.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кодылева Татьяна Александровна — эмбриолог 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва, улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон:8(925)373-8314, e-mail: t_kodyleva@oparina4.ru

Шафеи Рамин Ахмедович — к.б.н., вед.н.с. каф. эмбриологии биологического факультета ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Ленинские горы 1, строение 12, 119991; телефон: 8 (916)832-9162, e-mail: shafei@list.ru

Лапина Вера Сергеевна —врач-акушер-гинеколог 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон: 8(909)920-2305, e-mail: vslapina89@gmail.com

Мишиева Нона Годовна — д.м.н., вед.с. 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» МинздраваРоссии; Москва, улицаАкадемикаОпарина, дом 4, 117997; телефон:8 (495) 438-2622, e-mail: nondoc555@mail.ru

Королькова Анна Игоревна— асп. 2 года обучения 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон: 8(915)322-0879, e-mail: zaikinaai@icloud.com

Семенова Мария Львовна — д.б.н., проф. каф. эмбриологии биологического факультета ФГБОУВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Москва, Ленинские горы 1, строение 12, 119991; телефон: 8 (917) 522-89-82, e-mail: mlsemenova@gmail.com

Абубакиров Айдар Назимович — к.м.н., рук. 1-го гинекологического отделения ФГБУ «Медицинский исследовательский научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: Москва, улица Академика Опарина, дом 4, 117997; телефон 8 (495)438-2622, e-mail: nondoc555@yahoo.com