Введение
Хитозан является природным полимером, который обладает антибактериальными, фунгицидными и противоопухолевыми свойствами [1, 2]. При добавлении в гидрогели из хитозана β-глицерофосфата получают композиции, способные к термоотверждению при температуре 37 °C [3]. Благодаря этим свойствам хитозановые гидрогели являются перспективной основой для костно-пластических материалов, так как позволяют получать моделируемые композиции с уникальным набором свойств, которые способны к отверждению при внесении в рану. Это теоретически должно избавить врача от необходимости использования армирующих конструкций типа титановых сеток и костных блоков при замещении дефектов сложной формы и большой протяженности [4]. Существуют исследования, в которых как сами хитозаны, так и гели на их основе характеризуют как биосовместимые, способные к биодеградации с образованием безопасных метаболитов [5]. Однако при исследовании композиций на основе хитозановых гидрогелей мы сталкивались с их низкой биосовместимостью, критическая оценка которой в литературе представлена скудно и не имеет систематических подходов к решению. При этом особого внимания требует феномен воздействия положительного заряда аминогрупп хитозана на клеточную адгезию и его способность стимулировать таксис лейкоцитов [6, 7]. Количество свободных положительно заряженных аминогрупп зависит от степени деацетилирования хитозана, pH среды и наличия сшивающих агентов, таких как β-глицерофосфат, глутаровый альдегид и полиэтиленгликоля диакрилат (PEGDA) [8—10]. Продолжительность существования заряда хитозана в геле может зависеть от наличия высокопористого наполнителя, увеличивающего площадь поверхности хитозана, которая влияет на скорость адгезии белков тканевой жидкости или плазмы крови [11].
Цель исследования — определить биосовместимость хитозановых материалов в зависимости от заряда и количества свободных аминогрупп.
Материал и методы
Хитозановые диски
Для исключения влияния на биологическую совместимость материалов растворителей и сшивающих агентов были сделаны хитозановые диски методом прессования. Для этого мелкодисперсный порошок хитозана (Sigma Aldrich, cat. 43040), стерилизованный в 70% этаноле в течение суток, помещали в пресс-форму диаметром 5 мм. С помощью лабораторного гидравлического пресса в стерильных условиях с нагрузкой порядка 14 700 кПа получали диски толщиной 2—3 мм.
Хитозановые гидрогели
Получение хитозановых гелей проводили в стерильных условиях в ламинарном боксе. Для этого хитозан (Sigma Aldrich, cat. 43040) растворяли в 0,1 М уксусной кислоте с получением 2,2% раствора в течение 3 сут. При температуре 4 °C в раствор хитозана по каплям добавляли стерильный охлажденный 50% водный раствор β-глицерофосфата (Sigma Aldrich cat. 50020) при постоянном помешивании до конечной концентрации 20%.
Высокопористые полилактидные (PLA) гранулы
Высокопористые полилактидные гранулы использовались как биосовместимый наполнитель, увеличивающий площадь контакта хитозана с тканевой жидкостью и плазмой крови. Пористые гранулы из полилактида получали с применением сублимационной сушки замороженных эмульсий полимера марки Nature Works PLLA (4032D), первично растворенных в 1,4-диоксане, полученных распылением. Полилактидные гранулы отличались размерами и пористостью: 1) малые PLA-гранулы пористостью 98,5%, диаметром 0,1—0,4 мм; 2) крупные PLA-гранулы пористостью 98%, диаметром 1—2 мм. Частицы стерилизовали лучевым методом. Поглощенная доза ионизирующего излучения составила 15 кГр.
Хитозановые гидрогели, наполненные полилактидными частицами
К полученному раствору хитозана прибавляли стерильные высокопористые частицы на основе полилактида. Масса частиц составляла 0, 4, 8, 16% масс.
Методика очистки хитозановых гелей и губок методом диализа
Полученные гидрогели обрабатывали растворами (0,1 М NaOH, 0,1 M NaHCO3). Диализ проводили против воды в течение 3 сут, заменяя воду в диализном стакане, раз в 12 ч.
Хитозановые гидрогели на основе диализованного хитозана
Для уменьшения концентрации уксусной кислоты и β-глицерофосфата в системе 2,2% раствор хитозана в 0,1 М кислоте диализовали против дистиллированной воды. Полученный раствор имел pH=6,2.
Реацетилирование хитозана
Реакцию реацетилирования хитозана проводили в водно-спиртовой среде по стандартной методике [12]. 1 г переосажденного хитозана со степенью деацетилирования 65 DD% растворяли в растворе 1% уксусной кислоты и метанола 37% об. при перемешивании в течение 30 мин. В качестве ацетилирующего агента использовали уксусный ангидрид. Реакцию проводили в две стадии: 1) половину от рассчитанной концентрации уксусного ангидрида приливали в колбу и проводили реакции в течение 30 мин при 22 °C, затем раствор хитозана титровали NaOH до pH 7,0; 2) приливали оставшееся количество ангидрида в метаноле и проводили реакцию в течение 3 ч. После pH раствора доводили до 8,0 и раствор диализовали против дистиллированной воды с целью получения хитозана со степенью деацетилирования DD% 19,5, 39,0, 48,8, 55,3. Губчатые материалы на основе полученных реацетилированных хитозанов и хитозана с исходной степенью деацетилирования 65% изготавливали методом лиофилизации замороженных стерильных растворов в 2% уксусной кислоте, при массовой концентрации вещества 2,2%.
Сшитые глутаровым альдегидом хитозаны
В охлажденный раствор хитозана добавляли водный раствор 0,1% глутарового альдегида («Panreac», Испания) до получения общей концентрации глутарового альдегида 0,002% масс. Далее промывали в физрастворе с целью очистки от остаточных реагентов по описанной ранее методике.
УФ-сшиваемый хитозановый гидрогель
Для улучшения манипуляционных характеристик костно-пластического материала нами была апробирована методика получения УФ-отверждаемого гидрогеля на основе хитозана. В литературе описаны несколько способов синтеза in situ сшиваемых структур. Одна из наиболее перспективных методик, предложенная авторами [13], предлагает использовать в качестве исходного материала N, O-малеиновый хитозан, а в качестве сшивающего агента полиэтиленгликоль диакрилат (PEGDA). Реакция между реактивами протекает по радикальному механизму. Инициатором реакции выступает 4-(2-гидроксиэтокси)фенил-(2-гидрокси-2-пропил)кетон, который под действием УФ-излучения образует свободные радикалы.
В 100 мл химически чистого диметилсульфоксида (ДМСО) добавляли 1,0 г хитозана (Sigma Aldrich, cat. 43040) и прибавляли пара-толуолсульфоновую кислоту (п-ТСК) массой 1,1 г. Полученную смесь перемешивали в круглодонной колбе на масляной бане при 60 °C до образования гомогенного раствора. К раствору хитозана добавляли малеиновый ангидрид (Sigma Aldrich, CAS № 108−31−6) массой 3,52 г и продували аргоном. Реакцию проводили в инертной атмосфере при перемешивании в течение 24 ч при 60 °C. Полученный малеиновый хитозан высаживали в ацетон, отфильтровывали на воронке Шотта и промывали большим количеством ацетона. п-ТСК нейтрализовали реакцией с 0,1 М раствором NaHCO3. Раствор диализовали против деионизированной воды для удаления низкомолекулярных соединений. Модифицированный хитозан лиофилизовали для удаления растворителей. Получение целевого продукта в результате реакции было подтверждено при помощи ИК-спектроскопии. Полученный малеиновый хитозан растворяли в 0,01 М растворе NaOH. Массовая концентрация хитозана составляла 4,0% по масс. К полученному раствору добавляли полиэтиленгликоль диакрилат из расчета по массе растворенного вещества 1:5 (Mn=700 Да, Sigma Aldrich cat. 455008) и фотоинициатор Irgacure 2959 (4-(2-гидроксиэтокси) фенил-(2-гидрокси-2-пропил) кетон) c массовой концентрацией 0,1%. Раствор перемешивали до полного растворения компонентов. Перед УФ-отверждением раствор продували аргоном для удаления растворенного кислорода. Длина волны УФ-лампы составляла 365 нм, время отверждения 5 мин. Полученный гидрогель был исследован на сжатие на испытательной машине Instron 5965. Прочность для гидрогеля составила 215 кПа при 17% деформации.
Имплантация материалов
В эксперименте участвовали самцы крыс линии Wistar массой 250—350 г общим количеством 90 особей по 5 крыс в каждой группе. Эксперимент соответствовал рекомендациям локального биоэтического комитета, при его постановке руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 24.07.78 и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» от 2003 г. Для наркотизации лабораторных животных использовали внутрибрюшинное введение Золетила («Virbac», Франция) и Ксилазина (Interchemie Werken «de Adelaar» BV, Нидерланды) в дозировке 30 и5 мг/кг соответственно.
Крысам сбривали шерсть в области холки, проводили антисептическую обработку, в стерильных условиях выполняли продольный разрез кожи и имплантировали исследуемые материалы после формирования тупым путем подкожных карманов. Аналогичные материалы после диализа и без диализа имплантировали в одну крысу в симметрично выполненные кожные карманы справа и слева относительно позвоночника. После рану ушивали узловыми швами материалом Vicryl 5/0 («Ethicon», США).
Животные были выведены из эксперимента путем передозировки Золетила на 14-е сутки эксперимента с целью анализа воспалительных реакций. При плановой эвтаназии экспериментальных животных был произведен забор тканей области имплантации исследуемых материалов и передан на гистологическое исследование.
Гистологическое исследование и морфометрия
Материал фиксировали 10% раствором нейтрального формалина, не менее 1 сут обезвоживали в градиенте спиртов и ксилола и заключали в парафин. Далее изготавливали срезы толщиной 5—7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике. Срезы изучали на световом микроскопе Axioimager M.1 («Carl Zeiss», Германия). Экспресс-определение острой воспалительной реакции на имплантацию исследуемых материалов проводилось с помощью балльной оценки гистологических срезов, где:
0 баллов — полное отсутствие лейкоцитов;
1 балл — единичные лейкоциты;
2 балла — незначительное скопление лейкоцитов;
3 балла — множество лейкоцитов по периферии материала;
4 балла — лейкоцитарный детрит внутри материала;
5 баллов — перифокальная лейкоцитарная инфильтрация.
Статистическая обработка
Построение графиков и статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism 7.0 (США). Межгрупповые различия выраженности лейкоцитарной инфильтрации оценивали с помощью теста Данна. Сравнение групп с диализом и без выполняли с использованием критерия Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы или уровне статистической значимости ниже 5% (p<0,05).
Результаты
Подкожная имплантация спрессованных дисков из порошка хитозана показала, что он стимулирует развитие острого экссудативного воспаления. Хитозан был окружен многочисленными лейкоцитами. При этом было замечено, что концентрация лейкоцитов возрастала к центру имплантированного хитозана и в местах наибольшей сегментации материала, т. е. с высокой площадью его поверхности (рис. 1; рис. 2, а).
Хитозановый гидрогель также стимулировал обильную лейкоцитарную инфильтрацию (см. рис. 2, б; рис. 3).
Поскольку стимулирование хитозаном лейкоцитарной инфильтрации все еще оставалось до конца нерешенной задачей, было сделано предположение, что причиной такого исхода могут быть остаточные реагенты, применяемые для получения термотропного геля. Для этого применяли диализ против дистиллированной воды, который оказался эффективным и статистически значимо уменьшал уровень лейкоцитарной инфильтрации, которая, однако, по-прежнему оставалась высокой. Погашение кислотности геля от остатка уксусной кислоты при добавлении избытка щелочи и гидрокарбонатного буфера с последующим диализом против воды скорее усиливала миграцию лейкоцитов, чем давала положительный эффект (см. рис. 2, а; рис. 4).
Для исключения воздействия свободных аминогрупп исходный хитозан был реацетилирован с разным шагом от 65,0 до 19,5 DD%. Снижение степени деацетилирования до 39,0% приводило к статистически значимому снижению лейкоцитарной инфильтрации (см. рис. 2, а; рис. 5).
Фотоотвержденный хитозановый гидрогель имел плотную резинообразную консистенцию и сохранял свою фому спустя 14 сут после подкожной имплантации. Это видно по четким контурам в области имплантации материала, которые были окружены капсулой из грануляционной ткани. Лейкоциты даже в отдельных полях зрения встречались крайне редко. Однако гигантские многоядерные клетки инородного тела были представлены обширно и фагоцитировали материал по периферии. В отдельных полях зрения встречались незначительные скопления лейкоцитов и плазматических клеток на фоне отдельных полнокровных сосудов, что свидетельствует об активной резорбции материала и, по-видимому, иллюстрирует слабую иммунную реакцию на остаточные реагенты после полимеризации геля.
Обсуждение
Материалы на основе хитозана в экспериментах in vivo показали низкую биологическую совместимость, в связи с этим нами был проведен ряд экспериментов, в которых за счет изменения химических свойств хитозана и состава композиции удалось улучшить биологические свойства гидрогелей.
На первом этапе нами было сделано предположение о возможности влияния химических характеристик хитозана на его биосовместимость. В мировой литературе существуют противоречивые данные относительно воздействия степени деацетилирования хитозана на адгезию и пролиферацию клеток. В нескольких исследованиях in vitro было показано, что хитозаны с высокой степенью деацетилирования способствуют повышению гидрофильности материалов и прикреплению клеток к их поверхности [16, 17]. V. Hamilton и соавт. [8] в экспериментах на клеточной линии фибробластов in vitro получили данные об отсутствии влияния степени деацетилирования на биосовместимость хитозановых пленок. На наш взгляд, данный результат был связан с тем, что в исследовании были использованы хитозаны различных марок, с отличающимися химическими характеристиками, в том числе длиной полимерной цепи.
Для исключения многофакторного воздействия в нашем исследовании был выбран один образец хитозана и проведено его реацетилирование. Полученные нами данные в эксперименте in vivo позволили выявить строгую зависимость токсических свойств хитозана от степени его деацетилирования: чем выше была степень деацетилирования, тем большая лейкоцитарная инфильтрация отмечалась в области имплантации материала. В литературе нами были найдены данные исследований in vitro и in vivo других авторов, подтверждающие наши результаты. Так, на клеточных линиях карциномы легкого и мочевого пузыря человека in vitro было показано, что образцы хитозана с высокой степенью деацетилирования характеризуются выраженным цитотоксическим эффектом [18, 19]. В эксперименте in vivo воспалительные явления чаще наблюдались у крыс, которым подкожно были введены пленки хитозана с высокой DD% [20].
Еще одним способом снижения поверхностного заряда является использование сшивающих агентов. Так, нами был применен глутаровый альдегид, который, с одной стороны, за счет образования сшивок с хитозаном должен был снизить положительный заряд материала, а с другой стороны, повысить его прочность. Однако при подкожной имплантации нами был обнаружен выраженный воспалительный ответ на введение такого материала, что могло быть связано с тем, что даже в малых концентрациях остаток сшивателя обладает выраженными токсическими свойствами, что подтверждается результатами множества экспериментов [21, 22].
Другим сшивающим агентом был выбран полиэтиленгликоль диакрилат, который обладает биосовместимостью, вызывает минимальный иммунный ответ и подвергается биодеградации [23, 24]. Связывание компонентов протекает за счет реакции Михаэля и приводит к образованию композиции, отверждаемой под действием ультрафиолетового излучения. Полученный материал тактильно напоминал плотную резину и сохранял свою форму на протяжении всего эксперимента. Нами не были выявлены признаки острого экссудативного воспаления после подкожной имплантации крысам in vivo. Исследования других авторов также показали отсутствие цитотоксического влияния при культивировании клеток на поверхности фотоотверждаемых материалов на основе хитозана in vitro [13, 25].
Для получения моделируемого материала необходимо использование агентов, способствующих гелезации растворов хитозана. Так, для формирования отверждаемого гидрогеля нами был использован β-глицерофосфат. Подкожная имплантация такого гидрогеля приводила к выраженной лейкоцитарной инфильтрации. Для удаления остаточных реагентов, которые могли стимулировать воспаление, был выполнен диализ полученных композиций против воды. Данный метод позволил очистить поверхность материала от несвязавшихся остатков β-глицерофосфата, что привело к заметному снижению уровня лейкоцитарной инфильтрации.
При обработке гелей хитозана щелочью и щелочным буфером гидрокарбоната натрия их имплантация ожидаемо сопровождалась выраженным воспалительным ответом в связи с тем, что данные вещества усиливают заряд хитозана. Так, для его погашения обычно применяются кислые буферы, содержащие ацетат натрия [26]. Однако нами было проверено обратное, что подтверждает негативное влияние аминогрупп на биосовместимость хитозанового гидрогеля.
Еще одним способом, улучшающим биосовместимость хитозановых гидрогелей, было наполнение их высокопористыми PLA-гранулами, которые обладают высокой биологической совместимостью и подвергаются биодеградации с образованием безопасных метаболитов. Так, в нашем эксперименте in vivo была отмечена зависимость уровня лейкоцитарной инфильтрации от наполненности материала PLA-гранулами. Использование гидрогеля с 16% наполненностью по массе PLA-гранулами позволило ощутимо снизить воспалительный ответ при подкожной имплантации. Данный эффект мог быть связан с тем, что при добавлении большого количества высокопористого наполнителя площадь поверхности материала увеличивается, что способствует взаимодействию его с белками плазмы и форменными элементами крови, обладающими поверхностным отрицательным зарядом и нейтрализующими положительно заряженные группы хитозана [27, 28]. Наиболее выраженными биосовместимыми свойствами обладали композиции на основе деацетилированного до 39 DD% хитозана, наполненные PLA-гранулами до 16% по масс. То есть, комбинация методов, позволяющих уменьшить положительный заряд хитозана, обеспечивает наиболее выраженное снижение токсических свойств композиционного материала.
Заключение
Таким образом, нами было показано, что снижение лейкоцитарной инфильтрации при имплантации хитозановых материалов напрямую зависит от степени положительного заряда хитозана, который стимулирует таксис лейкоцитов. Снижение степени деацетилирования хитозана ниже 39,0% и увеличение скорости подавления заряда за счет увеличения площади контакта с белками тканевой жидкости и плазмы крови при добавлении высокопористых PLA-частиц способствует существенному повышению биосовместимости хитозанов, что позволяет рассматривать их в качестве основы для моделируемых матриц костно-пластических материалов.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ № 16−15−00298.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Сведения об авторах
Васильев А.В. — https://orcid.org/0000-000207169-2724
Кузнецова В.С. — https://orcid.org/0000-0001-8643-1642
Бухарова Т.Б. — https://orcid.org/0000-0003-0481-256X
Загоскин Ю.Д. — https://orcid.org/0000-0002-5825-8333
Леонов Г.Е. — https://orcid.org/0000-0002-5632-7040
Григорьев Т.Е. — https://orcid.org/0000-0001-8197-0188
Чвалун С.Н. — https://orcid.org/0000-0001-9405-4509
Гольдштейн Д.В. — https://orcid.org/0000-0003-2438-1605
Кулаков А.А. — https://orcid.org/0000-0001-7214-2129
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Васильев А.В., Кузнецова В.С., Бухарова Т.Б., Загоскин Ю.Д., Леонов Г.Е., Григорьев Т.Е., Чвалун С.Н., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Повышение биосовместимости хитозановых гидрогелей с перспективой их использования в качестве основы для костно-пластических материалов в стоматологии. Стоматология. 2019;98(6 вып. 2):12-18. https://doi.org/10.17116/stomat20199806212
Автор, ответственный за переписку: Васильев Андрей Вячеславович — e-mail: vav-stom@yandex.ru