Хронический дефицит сна — крайне актуальная проблема современного общества. Нарушения сна в виде инсомнии сопутствуют различным неврологическим и психическим расстройствам, включая нейродегенеративные заболевания, депрессию, эпилепсию и др. [1, 2]. При этом все больше людей ведут малоспящий образ жизни в связи с особенностями рабочего графика, бессонницей или иными причинами. Придерживаясь такого образа жизни на постоянной основе, люди утрачивают работоспособность и подвергают себя повышенному риску развития сердечно-сосудистых, нервно-психических, метаболических и иммунных заболеваний [3, 4]. Несмотря на распространенность этих расстройств, механизмы, лежащие в основе взаимодействия между хроническим недосыпанием и его последствиями на физиологические функции, остаются малоизученными.

Сон регулируется двумя фундаментальными процессами — циркадным процессом, который вовлекается факторами окружающей среды, такими как свет или пища, и гомеостатическим процессом, который обеспечивает потребность во сне в ответ на предшествующее бодрствование, реализующееся увеличением продолжительности и/или глубины восстановительного сна и скорости его наступления [5]. Такая реакция призвана поддерживать гомеостаз сна и частично компенсирует потерянный сон. Общепринятой мерой глубины сна является амплитуда электроэнцефалографии (ЭЭГ) в дельта-диапазоне (0,5—4,5 Гц) или медленноволновая активность (МВА). В ответ на лишение сна уровень МВА повышается пропорционально времени потерянного сна [6]. У грызунов этот эффект наиболее заметен при кратковременном (6—16 ч) лишении сна [7]. Такую процедуру называют острой депривацией сна. При ограничении сна у грызунов до нескольких часов в сутки на протяжении 3—5 дней компенсаторная реакция медленноволнового сна (МВС) ослабевает со временем, что в первую очередь выражается в снижении МВА и уменьшении времени МВС [8—10], несмотря на продолжающийся недостаток сна. Компенсаторная реакция парадоксального сна (ПС), напротив, усиливается по ходу ограничения сна [11]. Такие изменения часто интерпретируют как нарушение гомеостатической регуляции МВС или адаптацию к дефициту сна [9, 10].

С целью проверки предположения о том, что хронический недостаток сна приводит к отставленному нарушению гомеостатической регуляции МВС, были проведены эксперименты по острому лишению сна грызунов [10, 12] и людей [13, 14] после периода хронического недосыпания, однако их результаты противоречивы.

В нашем предыдущем исследовании показано, что хроническое недосыпание у крыс в течение 5 дней вызывает ослабление МВА на протяжении 2 дней восстановительного периода [15].

Цель исследования — выявить особенности в проявлении компенсаторных механизмов регуляции сна в ответ на острую депривацию сна после хронического недосыпания у крыс.

Материал и методы

Исследование проведено на 14 самцах крыс популяции Вистар в возрасте 7—8 мес и массой тела 370—420 г. До эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (ИЭФБ РАН) по 5 особей в клетке. Во время экспериментов животные содержались в одиночных клетках внутри экспериментальной камеры, изолированной от световых и звуковых раздражителей, при температуре 23±1 °C, фотопериоде 12:12 ч (10:00—22:00 — свет) и неограниченном доступе к воде и пище. Манипуляции с животными проводились в соответствии с этическими стандартами, утвержденными правовыми актами РФ, принципами Базельской декларации и рекомендациями, утвержденными биоэтическим комитетом по охране животных ИЭФБ РАН.

Регистрацию полисомнограмм (ПСГ) проводили в условиях свободного поведения животных в клетке с использованием телеметрического оборудования Dataquest A.R.T. System («DSI», США). Под общим наркозом (Золетил100, tiletamine hydrochloride and zolazepam, 70 мг/кг в/м; «Virbac Sante Animale», Франция) крысам подкожно вживляли телеметрический модуль 4ET («DSI», США) для регистрации ЭЭГ, электроокулограммы глазных мышц (ЭОГ), электромиограммы (ЭМГ) шейной мышцы. ЭЭГ регистрировали биполярно из лобной (2 мм вперед от Брегмы, 2 мм латерально от средней линии) и теменной (5 мм назад от Брегмы, 2 мм латерально от средней линии) зон коры. Электроды устанавливали экстрадурально и фиксировали к поверхности черепа акродентом (АО «СТОМА», Украина). Частота дискретизации сигнала 250 Гц. Сигнал ЭЭГ фильтровали в диапазоне 0,5—100 Гц, а сигнал ЭМГ/ЭОГ — в диапазоне 10—100 Гц. Период послеоперационной реабилитации составлял не менее 2 нед.

Животные были разделены на две группы. Одну группу (n=7) подвергали ограничению сна в течение 5 дней по схеме: 3 ч депривации сна с интервалами в 1 ч, суммарно 18 ч депривации сна за каждые сутки. Депривация сна осуществлена качанием клетки с частотой 170—180 об/мин на орбитальном шейкере S-3.02L.A20 («ELMI», Латвия). Методика ограничения сна подробно описана ранее [15]. После этого животных подвергали однократной 6-часовой тотальной депривации сна в начале светлого времени суток на 3-й день после окончания хронического ограничения сна (рис. 1). Контрольную группу (n=7) подвергали острой депривации сна без предварительного ограничения сна. ПСГ регистрировали в течение суток до начала ограничения сна (базовый уровень), на 2-й день после хронического ограничения сна, а также на 3-й день, когда была применена острая депривации сна. Регистрация ПСГ контрольной группы проводилась до начала острой депривации сна (базовый уровень) и в течение 24 ч при проведении острой депривации сна.

Рис. 1. Схема ПСГ регистрации в условиях с ограничением сна.

ОД — острая депривация в первые 6 ч светлого времени суток; * — запись ПСГ.

Анализ ПСГ выполняли в программе Sleep_Pro (РИД №RU2018662279, ИЭФБ РАН, Россия). При анализе ПСГ выделяли 4 состояния: бодрствование; дремота; МВС и ПС. Стадии сна выделяли по тем же критериям, что и при анализе сна во время его ограничения [15]. Все показатели усреднялись по 6-часовым интервалам. МВА определяли с помощью быстрого преобразования Фурье для каждой эпохи МВС как спектральную плотность ЭЭГ в диапазоне 0,5—4,5 Гц, нормированную к среднесуточному значению базового уровня для каждого животного.

Статистическую обработку результатов выполняли в программе Prism — GraphPad 8. Нормальность распределения проверяли с помощью теста Колмогорова—Смирнова. Различия во временных характеристиках сна и уровне МВА между группами животных определяли с помощью смешанной модели для двухфакторного дисперсионного анализа (Two-way ANOVA: фактор «острая депривация сна» — зависимая группа; фактор «ограничение сна» — независимая группа) в каждом 6-часовом интервале времени с последующим тестом Сидак по каждому фактору. Изменение, вызванное ограничением сна, оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа для зависимых выборок (Two-way ANOVA: воздействие ограничения сна; время суток) с последующим тестом Сидак. Изменения, вызванные острой депривацией сна в контрольной группе, оценивали с помощью парного t-теста для зависимых выборок. Величину прироста МВА в ответ на острую депривацию сна и динамику базового уровня МВА в светлое время суток оценивали с помощью парного t-теста для независимых выборок. Полученные различия считали статистически значимыми при p<0,05. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Результаты

Для оценки компенсаторной реакции в ответ на острое лишение сна нами проведена 6-часовая депривация сна в начале светлого времени суток. В контрольных условиях непосредственно в период депривации общее время оставшегося сна составило 4,3±2,8%. Причем большая часть этого времени приходилась на дремоту, тогда как время МВС в среднем составляло <1%, а ПС отсутствовал (рис. 2, а). Компенсаторная реакция в течение 18 ч после острой депривации проявлялась в виде возросшей потребности во сне. Общее время сна за 18 ч после депривации увеличилось на 16±4,2% по сравнению с базовым уровнем (t-тест: t=4,5; p<0,01). В первые 6 ч после окончания депривации сна продолжительность дремоты сократилась на 40% по сравнению с базовым уровнем (t-тест: t=5; p<0,01; рис. 2, б). Общее время МВС, напротив, в первые 6 ч после депривации возросло на 22% (t-тест: t=5,3; p<0,01; рис. 2, в) и сохранялось повышенным в начале темного времени суток. В отличие от МВС увеличение времени ПС происходило отставленно в темное время суток (рис. 2, г).

Рис. 2. Изменение архитектуры сна в ответ на острую депривацию в контроле и после хронического недосыпания у крыс.

а — общее время всего сна; б — общее время дремоты; в — общее время МВС; г — общее время ПС. ОД — период 6-часовой депривации сна.

Здесь и на рис. 3: значения на сером фоне соответствуют темному времени суток. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. * — достоверность отличий; p<0,05; двухфакторный тест ANOVA; post-hoc Sidak’s test.

Для оценки последствий 5-дневного ограничения сна на цикл «бодрствование—сон» нами проведена регистрация ПСГ в течение 2-го дня восстановительного периода. В целом показатели общего времени состояний сна в этот период слабо отличались от базового уровня: лишь в начале светлого времени суток наблюдался небольшой прирост количества ПС (13,4±1,1% по сравнению с 11,3±0,8% в базовом уровне, p<0,05).

В группе крыс с ограничением сна 6-часовая депривация была проведена на 3-й день восстановления. Время сна непосредственно в период острой депривации составляло 8,4±2,7% и не отличалось от контрольной группы (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=1553; p<0,01; фактор ограничение сна: F (1, 12)=1,8: p=0,2; взаимодействие факторов: F (1, 12)=0,15; p=0,7; см. рис. 2, а). Как и в контрольной группе, бóльшая часть этого времени приходилась на дремоту, а ПС отсутствовал. После окончания острой депривации сна в первые 6 ч светлого времени суток в группе крыс с хроническим недосыпанием, как и в контрольной группе, время дремоты сократилось на 35% (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=45,3; p<0,01; фактор ограничение сна: F (1, 12)=0,004: p=0,95; взаимодействие факторов: F (1, 12)=1,15; p=0,3; см. рис. 2, б). Время МВС увеличилось на 13% и не отличалось от контрольной группы (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=30; p<0,01; фактор ограничение сна: F (1, 12)=0,04; p=0,85; взаимодействие факторов: F (1, 12)=1,5; p=0,24; см. рис. 2, в). Однако отличительной особенностью было то, что в последующие 6 ч темного времени суток увеличение времени МВС уже отсутствовало (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=6,3; p=0,03; фактор ограничение сна: F (1, 12)=9,1; p=0,01; взаимодействие факторов: F (1, 12)=7; p=0,02; см. рис. 2, в). Это может указывать на более короткий период компенсаторного увеличения МВС после острой депривации у животных, испытывавших хроническое недосыпание. При анализе временных характеристик ПС нами обнаружено, что увеличение представленности ПС у животных, подвергнутых ограничению сна, наблюдалось в первые 6 ч после депривации сна и отсутствовало в последующие часы темного времени суток, тогда как в контрольной группе компенсаторное увеличение ПС наблюдалось только спустя 6 ч в темное время суток (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=18,4; p<0,01; фактор ограничение сна: F (1, 12)=0,5; p=0,5; взаимодействие факторов: F (1, 12)=20; p<0,01, см. рис. 2, г). Такие различия свидетельствуют об изменении динамики в компенсаторных реакциях ПС, вызванном последствиями хронического ограничения сна. Компенсаторное увеличение общего времени сна за 18 ч после острой депривации у животных, подвергнутых хроническому недосыпанию, было значительно меньше, чем у контрольных, и составило лишь 5±1,4% (t-тест: t=2,5; p=0,03).

Несмотря на одинаковую потерю сна за время острой депривации, в целом можно сказать, что у животных, подвергавшихся хроническому ограничению сна, продолжительность компенсаторных процессов сократилась по сравнению с контрольной группой. Это может быть результатом адаптации животных к условиям постоянно повторяющегося недостатка сна.

Помимо времени сна, нами также регистрировался показатель МВА, т.е. спектральная мощность ЭЭГ в диапазоне 0,5—4,5 Гц в состоянии МВС, что позволяет оценивать глубину МВС. В контрольных условиях в светлую фазу суток уровень МВА в первые 6 ч после острой депривации сна повысился на 29% (t-тест: t=13,8; p<0,01), в темное время суток изменений МВА не наблюдалось (рис. 3, а).

Рис. 3. Подавление медленноволновой активности (МВА) после хронического ограничения сна.

а — изменение МВА в течение суток с острой депривацией сна (ОД); б — изменение МВА между базовым уровнем до ограничения сна и 2-м днем восстановления после ограничения сна.

На 2-й день восстановительного периода после хронического ограничения сна уровень МВА в светлое время суток снизился на 6—7% по сравнению с базовым уровнем до ограничения сна (ANOVA, фактор ограничение сна: F (1, 6)=3,25; p=0,12; фактор время суток: F (3, 18)=23,1; p<0,01; взаимодействие факторов: F (3, 18)=3,23; p=0,04, рис. 3, б).

В ответ на острую депривацию сна на 3-й день после ограничения сна уровень МВА в первые 6 ч также повышался на 22% по сравнению с предыдущим днем, но это увеличение оказалось слабее, чем в контрольных условиях (ANOVA, фактор острой депривации сна: F (1, 12)=267; p<0,001; фактор ограничение сна: F (1, 12)=11,7; p=0,005; взаимодействие факторов: F (1, 12)=6,8; p=0,02, см. рис. 3, а). Так как более низкий уровень МВА в группе с ограничением сна может быть следствием как ослабленной компенсаторной реакции в ответ на острую депривацию, так и более низкого фонового уровня МВА, нами сделана попытка разделить эти два эффекта. В записи базового уровня наблюдается снижение МВА от начала к концу светлого времени суток. В контрольных условиях оно составляет 14±2%. Такое снижение МВА, по всей видимости, является результатом рассеивания МВА в течение неактивного времени суток из-за большого количества МВС с высоким уровнем МВА. На 2-й день после ограничения сна такое рассеивание было выражено слабее (8±1,1%; t-тест: t=2,7; p=0,02), скорее всего, из-за пониженного уровня МВА в начале светлого времени суток после хронического ограничения сна. Нами сопоставлен прирост МВА после острой депривации сна в начале светлого времени суток предыдущего дня, когда рассеивание МВА еще слабо выражено. Такой прирост МВА не различался между животными после ограничения сна (11,6±1,9%) и контрольными животными (13,5±1,5%), (t-тест: t=0,8; p=0,44; рис. 3, а). Таким образом, несмотря на то, что МВА после ограничения сна в ответ на острую депривацию оказывается ниже, чем в контрольных условиях, это снижение, скорее, вызвано снижением базового уровня после ограничения сна, нежели ослаблением реакции МВА в ответ на острое лишение сна.

Обсуждение

Согласно данным нашего предыдущего исследования [15], основным последствием хронического ограничения сна у крыс является снижение МВА в светлое время суток, присутствующее до 2 дней после ограничения сна. Этот эффект был описан в работах других авторов [8, 9] и воспроизводился в настоящем исследовании. Предполагалось, что снижение МВА свидетельствует о нарушении гомеостатической регуляции МВС. Для проверки этого предположения нами проведена острая тотальная депривация сна на 3-й день после хронического ограничения сна и обнаружены признаки сохранения гомеостатической регуляции: увеличение МВА и общего времени МВС в первые 6 ч после депривации. И хотя прирост МВА после хронического ограничения сна был меньше, чем в контроле, эта разница оказалась пропорциональна более низкому уровню МВА в начале светлого времени суток накануне острой депривации сна. Такие изменения могут быть результатом не столько ослабления гомеостатической регуляции, сколько снижения базового уровня МВА на 2-й и 3-й дни после ограничения сна. Причиной такого снижения может быть как более низкая потребность в МВС, так и нарушение циркадианной регуляции МВС.

Более ранние эксперименты по острому лишению сна грызунов после хронического ограничения сна демонстрируют противоречивые результаты. Так, у мышей на 2-й день после 3 сут ограничения сна гомеостатическое увеличение МВА в ответ на 6-часовую депривацию сна отсутствовало, а через 2 нед оставалось сильно ослабленным [10], что может свидетельствовать о длительных последствиях для регуляции МВС, вызванных хроническим недосыпанием. В другом исследовании на крысах 6-часовую депривацию сна провели через 78 ч после 4 сут ограничения сна. Авторы не обнаружили различий реакции животных на острую депривацию сна до и после ограничения сна [12], несмотря на то, что на 3-й день после ограничения сна в светлое время суток у этих крыс наблюдалось снижение МВА. Стоит также отметить, что в данном исследовании острую депривацию сна проводили не в начале, а в конце светлого времени суток, таким образом, максимальный прирост МВА приходился на начало темного времени суток. А поскольку различий в фоновом уровне МВА в темное время суток не обнаружено ни в этом, ни в других исследованиях [9, 15], различия в уровне МВА в ответ на лишение сна в это время также могли отсутствовать. Другой причиной расхождения результатов этого исследования с нашими результатами мог быть меньший срок ограничения сна, а также большее время после него. В целом можно сказать, что наши результаты демонстрируют промежуточный эффект между двумя аналогичными исследованиями на грызунах.

В отличие от грызунов, при ограничении сна человека в течение 4—7 дней уровень МВА прогрессивно повышается [16, 17] или значительно не меняется во время ограничения сна, оставаясь стабильно повышенным по сравнению с контрольным уровнем [13, 14, 18], а после конца ограничения быстро возвращается к норме. Проведение острой депривации после ограничения сна приводит к повышению МВА в той же мере, что и в контрольных условиях [13, 14]. Таким образом, у людей в ответ на хроническое ограничение сна не наблюдается долговременных изменений в регуляции МВС, хотя нарушения когнитивных функций, вызванных острой депривацией, могут усиливаться [14].

Причиной различной реакции мышей, крыс и человека в ответ на хроническое ограничение сна может служить разница в общем уровне метаболизма их мозга [19]. Ряд исследований демонстрирует связь между характеристиками сна и уровнем метаболизма [20—22]. По сравнению с людьми у крыс и мышей выше скорость метаболизма, короче продолжительность жизни и короче цикл сна [23], из чего можно предположить, что эффекты, наблюдаемые у грызунов, будут наблюдаться у человека лишь при значительно большем объеме недостатка сна.

У грызунов при ограничении сна сроком 4—5 дней наблюдается повышение бета-ритма на ЭЭГ во время сна [9, 15]. У людей при той же длительности ограничения сна повышаются дельта и тета-ритм, однако бета-ритм не меняется [16, 17]. Но при хронической инсомнии, когда сон нарушен значительно дольше, бета-ритм во время сна у людей повышается [24, 25], как и у крыс в экспериментах с ограничением сна.

В данной работе нами отдельно проанализирована стадия дремоты, представляющая легкий поверхностный сон, аналогичный 1-й стадии сна у человека. Как и у людей [26], у крыс время этой стадии в первые часы после острой депривации сна сокращается (рис. 2, б), а время МВС (аналогично 3-й и 4-й стадиям у людей) увеличивается (рис. 2, в). В условиях после ограничения сна этот эффект также присутствует, что свидетельствует об относительной сохранности гомеостатической регуляции МВС. Тем не менее в контрольных условиях время МВС было повышено и в начале темного времени суток, тогда как после ограничения сна повышения уже не наблюдалось (рис. 2, в). Это не может быть связанно с изменением МВА, так как различия в уровне МВА между группами в эти часы уже отсутствовали. Такой результат может указывать на относительную независимость в регуляции времени МВС и представленности МВА, что было показано и в других работах [27, 28]. Меньшее суммарное время отдачи МВС в ответ на острую депривацию после ограничения сна может быть следствием снижения общей потребности во сне в результате адаптации животных к условиям лишения сна.

Наиболее значимые различия в динамике компенсаторной реакции сна после острой депривации были связаны с фазой ПС. В контрольных условиях прирост ПС наблюдался не сразу, а отставленно в темное время суток (см. рис. 2, г). После ограничения сна прирост ПС, напротив, регистрировался только в первые 6 ч после депривации сна. На крысах было показано, что и фармакологическое стимулирование МВА [29], и повышение МВА в ответ на различные режимы депривации сна [7] могут подавлять ПС. Тогда можно предположить, что на динамику отдачи ПС влияет уровень МВА, который в нашей контрольной группе был выше, чем после ограничения сна. С другой стороны, в различных экспериментах на крысах наблюдается прогрессивное увеличение доли ПС от всего времени сна во время ограничения сна [9, 11, 15], и, хотя эти изменения возвращаются к базовому уровню уже через 1 сут после ограничения сна, в условиях повторного лишения сна они могут проявляться дольше. Помимо всего, данный эффект может также быть результатом адаптации к условиям ограничения сна.

Компенсаторное увеличение МВС и повышение уровня МВА в ответ на острую депривацию, скорее всего, являются защитным механизмом, предотвращающим негативные последствия продолжительного бодрствования для нервной системы, поскольку наблюдаются у большинства изученных животных. Можно предположить, что описанные здесь изменения негативно влияют на защиту организма от последствий острого лишения сна, так как в целом эти реакции ослабевают. Например, МВА во время МВС связывают с повышением интенсивности очистки мозга от продуктов метаболизма [30], тогда увеличение МВА после острой депривации может быть маркером более интенсивной работы этой системы, компенсирующей последствия продолжительного бодрствования. Вероятно, после хронического недостатка сна этот механизм работает менее эффективно. Изучение данных закономерностей может быть перспективным направлением исследований как с фундаментальной, так и прикладной точки зрения.

Заключение

Таким образом, результаты нашего исследования показывают, что после хронического ограничения сна у крыс наблюдаются изменения в компенсаторных реакциях в ответ на 6-часовое лишение сна даже после 2 дней неограниченного сна. Компенсаторное увеличение МВА после острой депривации сна ослабевает пропорционально ее базовому уровню в светлое время суток. Сокращается время компенсаторного увеличения МВС до первых 6 ч после депривации сна. Компенсаторное увеличение ПС наступает сразу после депривации и совпадает по времени с увеличением времени МВС и МВА. В целом можно резюмировать, что компенсаторные реакции организма в ответ на острый недостаток сна оказываются ослаблены, так как сокращается время и амплитуда реакции. Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять, насколько данные изменения влияют на защитную функцию сна в ответ на острую депривацию сна.

Работа выполнена в рамках государственного задания (№АААА-А18-118012290427-7) при финансовой поддержке Минобрнауки России.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.