Продукция достаточного уровня оксида азота (NO) обеспечивает адекватный кровоток во всех органах и тканях. Дизрегуляция механизмов, участвующих в продукции NO и активных форм кислорода, может быть звеном патогенеза развития сердечно-сосудистых заболеваний, поэтому поддержание адекватного уровня NO может быть мишенью для терапии [1]. Инфаркт миокарда до сих пор остается основной глобальной причиной смертности и заболеваемости населения земли, что побуждает к поиску новых методов лечения. Ишемически-реперфузионное повреждение является центральным компонентом патогенеза острого инфаркта миокарда. Оно характеризуется митохондриальной дисфункцией, истощением энергетических запасов клетки, увеличением образования активных форм кислорода (АФК). NO и нитрит модулируют митохондриальные функции, опосредуют цитопротекцию при ишемически-реперфузионном повреждении и участвуют в передаче сигналов ишемического прекондиционирования (ПК) [2, 3].

Несмотря на значительные успехи в области анестезиологического обеспечения вмешательств на открытом сердце в условиях искусственного кровообращения (ИК), остается нерешенным ряд вопросов, в частности интраоперационная защита миокарда [4, 5]. Периоперационный инфаркт миокарда в коронарной хирургии является ведущей причиной осложнений и летальности [6]. Клинические проявления данного осложнения значительно варьируют от транзиторной миокардиальной дисфункции до синдрома малого сердечного выброса и шока. Несмотря на проведение кардиоплегической защиты миокарда, пережатие аорты во время проведения ИК ведет к ишемическому и реперфузионному повреждению. У 45% пациентов после кардиохирургических вмешательств развивается постишемическая сократительная дисфункция, известная как состояние «оглушенного» миокарда [7]. При этом около 25% пациентов, перенесших изолированное коронарное шунтирование, нуждаются в инотропной поддержке [8].

Молекула любого свободного радикала крайне реактогенна, поскольку стремится к состоянию энергетического равновесия, для чего необходимо либо отщепить, либо внести еще один электрон на ее внешнюю орбиту. NO продуцируют многоклеточные организмы, он востребован на самых ранних стадиях эволюционного развития для протекания как физиологических, так и патологических процессов. Прямо или опосредованно патология обмена NO вовлечена в инициацию и развитие таких состояний, как артериальная гипертензия, сахарный диабет, атеросклероз, эректильная дисфункция, коагулопатия и многих других.

В организме человека NO образуется только в присутствии специфической оксигеназы — синтазы оксида азота (NOS). Биологическим субстратом для синтеза служит аминокислота L-аргинин, окисление которой до L-цитруллина и NO катализируют NOS [9]. У человека идентифицированы 3 изоформы NOS: эндотелиальная NOS (е-NOS или NOS3) встречается преимущественно в эндотелии сосудов, нейрональная NOS (n-NOS или NOS1) встречается в нейронах (это конститутивные NOS) и индуцибельная NOS (i-NOS или NOS2) встречается в клетках иммунной системы. Все разновидности NOS могут встречаться в эндотелиальных и гладкомышечных клетках, а также в кардиомиоцитах [1, 10, 11].

В эндотелии кровеносных сосудов присутствует конститутивная е-NOS, уровень активности которой регулируется концентрацией ионов кальция c участием кальмодулина [12]. Таким образом, возрастание внутриклеточной концентрации кальция немедленно активирует синтез NO. Конечным эффектом увеличения внутриклеточной концентрации NO является активация растворимой гуанилатциклазы, что снижает уровень кальция в клетке и приводит к расслаблению гладких мышц стенки кровеносных сосудов [13].

Примечательно, что от концентрации кальция зависит активность только конститутивных NOS, в то время как на i-NOS изменение концентрации ионов кальция (Са²⁺) не влияет, и регуляция активности фермента осуществляется через генетические механизмы.

NO, являясь самой маленькой энзиматической молекулой, продуцируемой клетками млекопитающих, обладает колоссальной диффузионной способностью и филогенетически приспособлен для участия в сигнальных каскадах в качестве универсального трансмиттера [11, 14, 15]. Для молекулы NO практически не существует структурных барьеров не только на уровне клеток и тканей, но и на ультраструктурном уровне, что в совокупности с высокой реакционной способностью делает ее идеальным мессенджером межклеточных и межтканевых взаимодействий. Например, синтезируемый эндотелием микроциркуляторного русла NO реализует свои биологические эффекты сразу в нескольких направлениях: вызывает релаксацию гладкомышечного слоя сосудистой стенки, оказывает самостоятельное ингибирующее влияние на локальную агрегацию тромбоцитов и тормозит активацию, адгезию лейкоцитов и выделение ими воспалительных и активирующих тромбоциты хемокинов. Комплексное действие локально выделившейся порции NO проявляется в поддержании кровотока на данном участке микроциркуляторного русла. NO, выступая в качестве медиатора паракринной сигнализации, имеет период жизни 3—5 с, что способствует эффективному удалению избытка сигнального агента в биологических системах [16].

Интерес к механизмам ауторегуляции местного кровотока возник, когда было обнаружено, что клетки эндотелия кровеносных сосудов выделяют химический фактор, способный вызывать релаксацию кровеносных сосудов [17]. Данный фактор получил название endothelium-derived relaxing factor (EDRF) (эндотелиальный фактор релаксации). Показано, что EDRF реализует свои эффекты через активацию растворимой гуанилатциклазы в клетках гладких мышц [18], что приводит к увеличению уровня циклического гуанозин-3′, 5′-монофосфата (cGMP) [19]. Кроме того, обнаружена способность EDRF ингибировать агрегацию тромбоцитов [20]. При дальнейшем изучении установлено, что EDRF обладает фармакологическими, биохимическими и химическими свойствами NO [21, 22]. Непосредственное изучение сигнальной роли NO началось с установления в 70-х годах ХХ века cGMP-зависимого пути реализации сосудорасширяющего эффекта нитросоединений [23]. Нитросоединения и NO активируют гуанилатциклазу, что приводит к увеличению образования cGMP в гладких мышцах кровеносных сосудов [24]. Главным физиологическим эффектом увеличения концентрации cGMP является релаксация мышечного слоя коронарных артерий [25]. В 1992 г. журнал «Science» назвал NO молекулой года [26]. В 1998 г. за открытие роли NO как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе Роберту Ферчготту (Университет штата Нью-Йорк), Фериду Мьюрэду (Техасский университет в Хьюстоне) и Луису Игнарро (Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе) присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины. Стало понятно, что функция циклизации гуанозинмонофосфата является первичным эффекторным звеном сигнального каскада, управляемого NO.

Дисбаланс системы паракринной регуляции имеет отчетливые клинические последствия: так, у пациентов с артериальной гипертонией значительно снижен уровень кросс-метаболитов NO (нитраты и нитриты), более того, уровень артериального давления обратно пропорционален их концентрации [27].

Роль NO как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе влияет на гладкомышечную стенку сосудов и непосредственно на сердечную мышцу, в которой NO выступает как регулятор сократимости миокарда [28]. В кардиомиоцитах представлены все 3 известные изоформы NO-синтазы: n-NOS, i-NOS и e-NOS, при этом следует отметить их внутриклеточное распределение: n-NOS локализуется в саркоплазматической сети, в то время как e-NOS — на поверхности клеточной мембраны [29]. Конститутивные изоформы моделируют активность кардиомиоцитов при физиологических состояниях через усиление n-NOS реакции на β-адренергическую стимуляцию [30] или, наоборот, ее подавление через активацию e-NOS [31]. При этом i-NOS активизируется при патологических состояниях [32]. Физиологически низкие концентрации NO увеличивают сократимость миокарда, в то время как патологически высокие концентрации обладают отрицательным инотропным действием, нарушая функцию потенциалзависимых кальциевых каналов [27, 33].

Кардиохирургическое вмешательство представляет собой высокую степень хирургической агрессии. К хирургически индуцированным факторам относятся механическая и электрическая травма кардиомиоцитов при тракции и вертикализации сердца, рассечении тканей, изменения нервно-рефлекторной регуляции, гуморальной активности и метаболического статуса, проведение электроимпульсной терапии [4, 34].

При высокой интенсивности и продолжительности повреждающих воздействий возможно развитие синдрома «оглушенного» миокарда. «Оглушенность» миокарда — постишемическая дисфункция в виде нарушения процессов расслабления — сокращения, клинически выражающаяся в угнетении насосной функции сердца и сохраняющаяся после восстановления коронарного кровотока в течение нескольких минут или дней. «Оглушенный» миокард является причиной синдрома малого сердечного выброса даже при условии адекватной интраоперационной кардиоплегической защиты [35].

Молекулярным субстратом миокардиального повреждения при ишемии—реперфузии являются механизмы нарушения гомеостаза кальция, известные как «кальциевый парадокс» [36], избыточная продукция АФК с повреждением клеточных структур — окислительный стресс, или «кислородный парадокс» [37], а также снижение чувствительности миофибрилл к кальцию. В свою очередь кальциевая перегрузка миоплазмы может активировать кальпины — ферменты, вызывающие протеолиз миофибрилл. Необходимость ресинтеза новых миофиламентов является одним из факторов, определяющих длительность восстановления сократительной функции кардиомиоцитов. Поиск методов и технологий оптимальной кардиопротекции продолжается вместе с развитием кардиохирургии.

Клиническое использование органических нитратов и попытки интерпретации их биологического значения предпринимались с середины XIX века, когда была впервые выявлена эффективность препаратов этой группы у пациентов со стенокардией [38].

NO оказывает свое кардиопротективное действие через различные механизмы: 1) активация NO-чувствительной гуанилатциклазы; 2) ингибирование притока ионов кальция в митохондрии и активация митохондриального аденозинтрифосфатзависимого K⁺-канала (K⁺АТФ-канала); 3) активация cGMP; 4) усиление циклооксигеназы 2-го типа (COX-2); 5) угнетение пероксинитрит (ONOO^–) опосредованного перекисного окисления липидов. В условиях длительной ишемии миокарда активность NOS (прежде всего e-NOS и n-NOS) снижается одновременно с уменьшением подачи кислорода, который требуется для синтеза NO. Таким образом, снижение кислорода во время ишемии приводит к уменьшению образования NO. Следовательно, повышение активности NOS и биодоступности NO может быть одним из путей кардиопротекции. В эксперименте показано, что уменьшение e-NOS усугубляет постишемическое повреждение миокарда, а при избыточной экспрессии e-NOS улучшается постишемическое восстановление сердечной функции.

Повышение биодоступности NO при стимуляции экспрессии NOS и применение экзогенного L-аргинина смягчает микроциркуляторное повреждение, вызванное ишемией—реперфузией, и уменьшает размер постишемической зоны инфаркта. Однако высокая концентрация NO в присутствии повышенного уровня супероксидного аниона может быть вредной, поскольку ведет к увеличению образования ONOO^–, который усугубляет постишемическое повреждение миокарда. Поддержание физиологической концентрации NO важно для проявления кардиопротективного эффекта: в эксперименте на изолированной модели сердца крысы показано благотворное влияние лечения с использованием доноров NO в комбинации с антиоксидантами для уменьшения постишемического размера инфаркта миокарда и улучшения сократительной функции. Таким образом, кардиопротективный эффект NO зависит от его концентрации и скорости образования, субклеточной локализации и биодоступности [39].

В 2016 г. опубликован обзор большого количества экспериментальных и клинических исследований, проведенных в период 1990—2014 гг., в которых использовали ингаляционый NO, нитрит, нитрат или NO-доноры для уменьшения реперфузионного повреждения [40]. По данным 21 исследования на животных разных видов, от мышей до собак, все препараты, кроме нитроглицерина, обеспечивали защиту от реперфузионного повреждения, в том числе уменьшали размер инфаркта, высвобождение креатининкиназы, накопление нейтрофилов и сохраняли насосную функцию сердца. В 3 рандомизированных клинических исследованиях у пациентов с острым инфарктом миокарда не получены доказательства ограничения зоны инфаркта при применении препаратов, содержащих NO. При детальном анализе данных исследований можно отметить, что в экспериментальных работах препараты NO назначали ингаляционно, внутривенно и внутриартериально, но спустя 15—30 мин от начала этапа ишемии миокарда и в течение периода реперфузии. В рандомизированных клинических исследованиях Hildebrandt et al. (1992) и Моrris et al. (1995) вводили изосорбида динитрат в течение 24–48 ч, в то время как N. Siddiqi и соавт. в исследовании NIAMI (2014) вводили нитрит натрия в виде болюса. В первых двух исследованиях пациентам проводили тромболизис, а в последнем — первичное чрескожное коронарное вмешательство через 5 мин после введения нитрита натрия. Несмотря на то, что в ранних исследованиях степень повреждения миокарда оценивали по уровню МВ фракции креатинфосфокиназы (КФК-МВ), а в NIAMI пациентам проводили магнитно-резонансную томографию, статистически значимые свидетельства эффективности методик не получены в отличие от экспериментальных исследований, в которых результат оценивался с помощью гистологических и морфологических методов. Известно, что в экспериментальных моделях в условиях гиперлипидемии и гипергликемии прекондиционирующий эффект не развивается [40]. В данный метаанализ не вошли клинические исследования 2007 г., которые показали, что ингаляция NO уменьшала связанную с реперфузией воспалительную реакцию в ишемизированных конечностях и снижала повреждение печени после трансплантации [41, 42].

Метаболический синдром, атеросклероз, сахарный диабет у пациентов кардиохирургического профиля приводят к снижению биодоступности NO из-за снижения активности e-NOS или увеличения продукции АФК [1, 43]. В настоящее время агенты-доноры NO являются наиболее широко применяемыми лекарственными средствами для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. При этом на протяжении последних лет наблюдается активный интерес исследователей к проблеме опосредованной NO кардиопротекции. Особое внимание уделяется роли i-NOS, функция которой в сердечно-сосудистой системе до недавнего времени считалась связанной лишь с реализацией токсических эффектов, но ее экспрессия идентифицирована как основной защитный механизм миокарда от ишемии. Принципиально различна роль NO в модулирующих эффектах ишемически-реперфузионного повреждения в нативном сердце и прекондиционированном миокарде. Более того, феномен ПК (ишемического, фармакологического, дистантного, препаратами для ингаляционной анестезии) вне зависимости от вызвавшего его стимула включает 2 фазы протективных эффектов (ранняя и поздняя) с различными патофизиологическими механизмами их реализации и совершенно разными клиническими последствиями. В связи с этим роль NO в ранней и поздней фазах ПК необходимо рассматривать отдельно [39, 44].

Существует несколько эндогенных путей, которые обеспечивают превращение нитрита до NO с участием гемоглобина, миоглобина, нейроглобина, цитоглобина, ксантиноксидоредуктазы, e-NOS и митохондриальных ферментов [45, 46]. Степень вклада различных путей зависит от типа ткани, рН, кислородного напряжения и окислительно-восстановительного статуса [47]. При нормоксии оксигенированный гемоглобин быстро реагирует с NO с образованием метгемоглобина и нитрата. Гипоксемия приводит к изменению гемоглобина и его способности связывания с кислородом, что способствует повышению уровня нитрита [48]. Во время быстрой дезоксигенации активность нитрит-редуктазы увеличивается, достигая пика при насыщении гемоглобина кислородом 50% [49, 50]. Таким образом, эритроциты обладают своего рода кислородной чувствительностью, которая позволяет им модулировать микрососудистый поток, вызывая вазодилатацию в зонах недостаточной оксигенации [46, 51]. В то время как точная роль эритроцитов в регуляции сосудистого тонуса все еще обсуждается, в ходе экспериментального исследования (у мышей с дефицитом миоглобина) показано, что сосудистый миоглобин может быть ответственным, по крайней мере, частично, за регулирование гипоксической вазодилатации [52]. Однако при гипоксемии миоглобин меняет роль от поглотителя NO к производителю NO. Дезоксигемоглобин превращает нитрит в биоактивный NO, тем самым адаптируя миокард к гипоксическому и ишемическому состояниям [52, 53]. Показано, что образование NO с помощью миоглобина имеет цитопротективный эффект и улучшает функцию левого желудочка после инфаркта [24, 54]. Индукция кардиопротективного действия NO может происходить несколькими путями: 1-й путь — добавление в митохондрии неспецифических и специфических доноров NO; 2-й — введение «гипоксических доноров NO — нитрата и нитрита»; 3-й — усиление эндогенного образования NO, например, с помощью дистанционного ишемического ПК [55]. Механизм нитрит-цитопротективного действия заключается в следующем: нитрит (анион NO₂^–) модифицирует и ингибирует комплекс I путем S-нитрозации. В условиях ишемии, гипоксемии и ацидоза белковое S-нитрозирование усиливается. Сам NO₂^– анион не проникает в митохондрии. Предполагают, что ишемическая двуокись азота (NO₂) приводит к митохондриальной S-нитрозации и позволяет проникнуть через мембрану азотистой кислоте HNO₂. Это тормозит перенос электронов, уменьшает образование АФК. Все это предотвращает открытие митохондриальной неспецифической поры (Mitochondrial permeability transition pore, mPTP) и высвобождение цитохрома С [53, 56, 57].

В XXI веке проведено большое количество исследований, выполненных in vitro и in vivo, посвященных вопросу NO-опосредованной кардиопротекции в непрекондиционированном сердце. Большинство экспериментальных исследований принципиально базировалось на двух методологиях: 1) применение фармакологического ингибирования активности NOS для увеличения эндогенного пула оксида азота до, во время или после ишемического события; 2) увеличение концентрации и биодоступности NO во время ишемически-реперфузионного повреждения миокарда путем введения доноров (например, нитроглицерин) или прекурсоров (L-аргинин). Ранняя и поздняя фазы ПК имеют разные механизмы, но проявляются сходными эффектами. NO, по-видимому, вовлечен в оба механизма. NO, продуцируемый e-NOS в первые секунды ишемии, вызывает реактивную гиперемию. Предполагается, что реактивная гиперемия обеспечивает кратковременную защиту на ранней стадии ПК [58].

До недавнего времени противоречивые данные литературы поддерживали утверждение об отрицательном инотропном действии NO из-за его участия в генерации свободных радикалов и предполагаемого прооксидантного действия во время ишемии миокарда. Самый масштабный на настоящий момент анализ работ, посвященных влиянию NO на ишемически-реперфузионное повреждение миокарда, проведен R. Bolli [44]. Автором проанализировано более 100 исследований по этой проблеме, выполненных в последние 15 лет. По данным обзора, подавляющее большинство исследователей поддерживают вывод о том, что фармакологическое ингибирование или генетическая абляция эндогенной активности NOS усугубляют ишемическое и реперфузионное повреждение миокарда, при этом доставка экзогенного NO (введение доноров или предшественников) оказывает защитное действие. В качестве первичной конечной точки в исследованиях оценивали инфаркт либо состояние «оглушенного» миокарда.

Следует отметить роль NO в реализации эффектов ранней фазы феномена ПК. ПК является защитным механизмом адаптации органов и тканей после сублетальных импульсов. Ранняя фаза ПК развивается в течение нескольких минут после кратковременного повреждающего стимула любой модальности (ишемии, фармакологических агентов, гуморальных стимулов). Исследования, в которых рассматривалась роль NO как триггера развития ранней фазы ПК, базировались на тех же принципах ингибирования активности эндогенного NO либо его экзогенной доставки. Результаты ряда исследований, посвященных индуцированным ишемией эффектам ранней фазы ПК, показали, что ингибирование эндогенного синтеза NO антагонистами NOS не влияет на реализацию защитных эффектов ишемического ПК против клеточной смерти, постишемической дисфункции и аритмий как in vitro, так и in vivo [59, 60]. При этом имеются противоположные данные о том, что абляция NOS препятствует развитию раннего ПК. В частности, P. Ferdinandy и соавт. и A. Lochner и соавт. [61, 62] обнаружили, что применение L-NAME (L-Nitro Arginine Methyl Ester) и других ингибиторов NOS препятствует реализации антиаритмического и цитопротективного действия ишемического ПК на изолированное сердце крысы, однако постишемическая дисфункция может быть предотвращена предварительным введением нитропруссида. Расходятся данные исследований, в которых изучалось участие эндогенного NO в ранней фазе фармакологического ПК. Z. Yao и соавт. [63] и E. Bugge и соавт. [64] обнаружили, что реализация индуцированного ацетилхолином и брадикинином ПК не заблокирована ингибиторами NOS, что противоречит данным V. Richard и соавт. [65], которые выявили блокаду индуцированного ацетилхолином ПК абляцией эндогенного NO.

Несмотря на противоречивость данных о роли эндогенного NO в механизмах развития ранней фазы ПК, фармакологическое ПК донорами NO является перспективным направлением, что подкрепляется доказательствами моделирования экзогенным NO защитного действия на миокард, подобного ПК. В частности, эксперименты A. Nakano и соавт. [59], проведенные на изолированных сердцах кроликов, подвергнутых 30-минутной коронарной окклюзии с последующей 2-часовой реперфузией, продемонстрировали, что предварительное введение S-нитрозо-N-ацетилпеницилламина вызвало мощный инфарктлимитирующий эффект, сопоставимый с эффектами ишемического П.К. Примечательно, что кардиопротективные эффекты S-нитрозо-N-ацетилпеницилламина в этом исследовании не обусловлены прямым действием препарата во время ишемического периода, так как S-нитрозо-N-ацетилпеницилламин удаляли за 10 мин до коронарной окклюзии. Авторы [66, 67] сделали вывод о реализации кардиопротективного фенотипа при воздействии NO за счет активации протеинкиназы С (PKС) и генерации АФК. Активация соответствующих внутриклеточных сигнальных путей и каскадов мессенджеров аналогична таковым при NO-индуцированном позднем П.К. Аналогичные результаты получены в исследовании на кроликах. M. Hill и соавт. [68] обнаружили, что внутривенная инфузия нитроглицерина, предшествующая миокардиальной ишемии и завершенная за 1 ч до 30-минутной коронарной окклюзии, вызвала отчетливый инфарктлимитирующий эффект. Однако выраженность кардиопротективного эффекта ранней фазы ПК была меньше, чем у поздней фазы ПК, наблюдаемой через 24—72 ч после введения нитроглицерина. В исследовании модели ишемически-реперфузионного повреждения миокарда у мышей выявили, что отношение зоны инфаркта к области риска было ниже на 30% при ингаляции NO за 1 ч до эпизода ишемии, чем у животных контрольной группы. Гипоксическая газовая смесь (8% кислорода) усиливала способность NO повышать уровень NO-метаболитов в миокарде. Концентрации каждого NO-метаболита, кроме нитрата, быстро достигли плато и сохранялись до 60 мин [69]. В дальнейшем эта группа исследователей установила, что длительность нахождения метаболитов NO в плазме, которые могут стать донорами NO, сохраняется до 3 ч, и данный эффект выявляется и в других органах, кроме сердца [47].

Исследование эффективности применения NO в контур экстракорпоральной циркуляции при моделировании острого инфаркта миокарда в условиях нормотермического ИК в эксперименте у кроликов подтвердило кардиопротективные свойства NO в виде снижения соотношения зоны ишемии к зоне риска и антиаритмического действия [70]. Принципиальным отличием данного исследования от приведенных выше является использование нативной молекулы NO, а не ее предшественников.

Таким образом, реализация кардиопротективных эффектов ранней фазы ПК (по крайней мере, индуцированного ишемией) не обязательно проходит с вовлечением эндогенного NO. При этом отмечается феномен миокардиальной NO-защиты, аналогичный цитопротекции при П.К. Выводы о достаточности, но не о строгой необходимости NO логичны в свете современных представлений о механизмах П.К. Раннее П.К. является многофакторной адаптивной реакцией, которая может быть вызвана рядом различных физических, химических и метаболических сигналов. Триггеры П.К., высвобождающиеся во время эпизодов сублетального стресса, помимо NO, включают аденозин, брадикинин, опиоидные агонисты, АФК, катехоламины и др. Именно поэтому устранения NO из ряда сигналов, инициирующих раннее ПК, недостаточно для блокирования развития защитного фенотипа.

Поздняя фаза ПК проявляется через 12—24 ч после повреждающего стимула и обеспечивает защиту миокарда в течение 72 ч [71—74]. Учитывая большую продолжительность цитопротективного эффекта, а также антиаритмический потенциал и возможность поздней фазы ПК предотвращать развитие «оглушенного» миокарда, реализация феномена отсроченной кардиопротекции может иметь даже большее клиническое значение, чем ранняя фаза П.К. Поздняя фаза ПК может быть индуцирована не только ишемией, но и различными фармакологическими агентами, паракринными и нефармакологическими стимулами: активацией аденозиновых, опиоидных рецепторов, рецепторов брадикинина, воздействием цитокинов, эндотоксина и его производных, а также физических факторов [75, 76]. Несмотря на то что в качестве триггеров раннего и позднего ПК могут выступать одни и те же стимулы, механизмы реализации конечных эффектов принципиально различны. Развитие феномена раннего ПК является результатом быстрой, однако скоротечной, посттрансляционной модификации ранее существовавших белков, в то время как позднее ПК обусловлено синтезом белков de novo и вторичным генетическим репрограммированием кардиомиоцитов. Проведенные в этой области исследования указывают на ключевую роль NO в механизмах развития поздней фазы ПК вне зависимости от вида индуцировавших его стимулов [77]. Следует учитывать различие между «триггерами» позднего ПК (молекулярными агентами, которые инициируют адаптацию) и «медиаторами» позднего ПК (молекулярными агентами, которые непосредственно обеспечивают кардиопротекцию через 24—72 ч после стимуляции ПК). Кратко обобщить роль NO в контексте поздней фазы ПК можно следующим образом: усиление биосинтеза NO необходимо для реализации индуцированного ишемией [78, 79] и физической нагрузкой [80] позднего П.К. Данные факты указывают на важность присутствия NO в качестве химического сигнала, с помощью которого происходят модификация генетического материала и переход к протективному фенотипу сердца в ответ на ишемическое повреждение или интенсивный стресс от перенапряжения.

В качестве источника генерации NO как медиатора поздней фазы ПК c высокой долей вероятности выступает e-NOS. Эту гипотезу поддерживает тот факт, что реализацию феномена позднего ПК блокирует введение неселективного ингибитора NOS, но не предотвращает введение селективных ингибиторов i-NOS [81]. Резкий подъем активности кальцийзависимых NOS (e-NOS и/или n-NOS) наблюдается сразу после воздействия ишемического стимула, однако этот эффект нивелируется неселективными ингибиторами NOS в той же дозе, в которой они блокируют позднее ПК [82].

Выявлено, что изолированная подача доноров NO (S-нитрозо-N-ацетилпеницилламин, нитроглицерин) без моделирования ишемии вызывает эффект отсроченной кардиопротекции, аналогичный эффектам поздней фазы П.К. Инфарктлимитирующий эффект, а также положительное действие против развития «оглушенного» миокарда сопоставимы с эффектами сублетальных ишемических стимулов. Эти факты подтверждают не только необходимость, но и достаточность присутствия NO для индуцирования позднего ПК [67, 68, 83, 84].

Сигнальный путь NO-опосредованной индукции поздней фазы ПК (вне зависимости от того, эндогенный или экзогенный NO вовлечен в каскад реакций) включает генерацию АФК [85], активацию PKC [85—88], мобилизацию транскрипционного фактора NF-κB (ядерный фактор «каппа-би»; англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) [89] и активацию транскрипции гена i-NOS [90]. Примечательно, что активация этого же сигнального пути приводит к реализации протективных эффектов ишемического ПК [44].

Механизм, посредством которого NO активирует PKC, остается до конца не изученным [91]. NO может активировать фермент напрямую посредством S-нитрозилирования. Помимо этого, NO реагирует с радикалами кислорода (О^2–), которые генерируются в ответ на миокардиальную ишемию—реперфузию, с образованием ONOO⁻, который в свою очередь может активировать PKC напрямую либо через побочные метаболиты, такие как гидроксид (OH) [77], что подтверждается блокированием активации PKC донорами NO в присутствии поглотителей ONOO⁻ и·OH [92]. В любом случае накопленные данные свидетельствуют о том, что для развития позднего ПК необходимо наличие NO и О^2–.

NO играет важную роль в качестве медиатора кардиопротекции и через 24 ч после инициирующего события [83, 93, 94]. Как показали проведенные фундаментальные исследования, за генерацию NO в этом случае отвечает i-NOS. Исследования убедительно показали, что ишемическое ПК вызывает экспрессию белков i-NOS и провоцирует усиление ее активности в течение 24 ч после стимула, а ее специфическая абляция приводит к полному нивелированию кардиопротективных эффектов поздней фазы ПК [95]. Помимо индуцированного ишемией, i-NOS является обязательным медиатором нескольких форм фармакологического ПК, включая позднее ПК, вызванное аденозином, опиоидами, донорами NO и производными эндотоксина [31, 96—102].

В 1998 г. R. Bolli сформулирована NO-гипотеза позднего ПК [77], согласно которой NO выполняет 2 функции в механизме поздней фазы ПК, действуя первоначально в качестве триггера, а затем медиатора. Всплеск продукции NO во время прекондиционирующего стимула любой модальности играет самостоятельную протективную роль и вызывает повышенную экспрессию и активность i-NOS через 24 ч.

Исходя из современных представлений, i-NOS-зависимый биосинтез NO является конечным общим путем, по которому реализуется кардиопротективный фенотип в ответ на различные стрессорные воздействия. При этом стимулы ПК вызывают активацию i-NOS на порядок меньше, чем это наблюдается после инфузии липополисахарида [94, 95]. Этим объясняются парадокс кардиопротективного действия i-NOS при умеренной экспрессии, обусловленой ПК, и цитотоксические эффекты при ее гиперактивации в условиях воспаления. Механизм развития i-NOS-опосредованной цитопротекции через 24—72 ч после действия прекондиционирующего стимула, по всей видимости, связан с активацией гуанилатциклазы [103]. Таким образом, NO, генерируемый e-NOS, запускает позднюю фазу ПК в 1-е сутки [79—81], а дальнейшая продукция NO, активированная i-NOS, защищает от ишемии на протяжении последующих 24—72 ч [97, 102].

Активация e-NOS происходит почти мгновенно как кальцийзависимыми, так и кальцийнезависимыми механизмами, что применимо для немедленной, но кратковременной адаптивной реакции. Экспрессия i-NOS, напротив, является индуцибельной, т. е. активируется стрессом и не требует изменения уровня Ca²⁺ или клеточного гомеостаза [103], что подходит для отсроченной, но пролонгированной адаптивной реакции. При воздействии на непрекондиционированный миокард повреждающего стимула для немедленного взрыва биосинтеза NO мобилизируется постоянно присутствующая e-NOS, что помогает преодолевать острое состояние. Одновременно происходит реализация защитного фенотипа для противостояния возможным повторам агрессивных паттернов. Для этого необходим повышенный уровень миокардиального NO в течение достаточно продолжительного периода, что и поддерживается активацией i-NOS. Цитопротективная роль i-NOS подтверждается увеличением ее активности в ответ на гипоксию в кардиомиоцитах в общей популяции [104, 105], а также в биоптатах предсердной ткани у детей с цианотическими врожденными пороками сердца [106]. Предложено много гипотез, объясняющих кардиопротективный эффект NO при ишемически-реперфузионной травме, однако точный механизм остается до конца не изученным (см. таблицу).

На сегодняшний день основным путем реализации кардиопротективного фенотипа считают путь NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы с образованием cGMP, конечной точкой которого является активация протеинкиназы G (PKG). На последнем этапе цитозольной сигнализации PKG действует на митохондрии, что приводит к открытию митохондриальных K⁺АТФ-каналов и ингибированию mPTP, являющихся молекулярными эффекторами ПК и ведущих к защите митохондрий при ишемии. NO и активированный им cGMP-зависимый путь внутриклеточной сигнализации, помимо ингибирования притока кальция, проявляют антагонизм к эффектам β-адренергической стимуляции [107, 108], опосредуют снижение контрактильности миокарда [109—114], а следовательно и потребление им кислорода [115—120]. NO напрямую активирует сарколеммальные K⁺АТФ-каналы, что приводит к активации PKG вне cGMP-зависимого пути [3, 121]. NO через активацию PKG опосредует открытие митохондриальных K⁺АТФ-каналов, что подтверждает гипотезу о интрамитохондриальной сигнализации и единстве конечных эффекторов феномена ишемического и NO-зависимого ПК [122], однако полностью не объясняет всех механизмов терапевтического действия NO [123]. Активация митохондриальных K⁺АТФ-каналов приводит к нормализации водного баланса митохондрий.

Конечной целью механизма кардиопротекции посредством феномена ПК вне зависимости от индуцирующих стимулов является деактивация mPTP. Открытие mPTP приводит к уменьшению выработки АТФ посредством ослабления потенциала митохондриальной мембраны, что, в конечном счете, вызывает некротическую гибель клетки от энергетического дефицита [124]. NO-зависимый маршрут NO—cGMP—PKG, а также опосредованное NO увеличение количества АФК и формирование свободных радикалов через открытие митохондриальных K⁺АТФ-каналов обеспечивают ингибирование mPTP. Инактивация mPTP реализует цитопротективный фенотип благодаря ингибированию апоптотического сигнала из митохондрии. NO снижает интрацеллюлярную кальциевую перегрузку в ишемизированных кардиомиоцитах после реоксигенации [3, 39, 125—127]. Так как интрацеллюлярная кальциевая перегрузка может напрямую активировать открытие mPTP, снижение уровня Ca²⁺ способно напрямую обеспечивать защиту митохондрии в ишемически-реперфузионном состоянии [72]. Помимо этого, G. Heusch и соавт. [128] предположили, что выделение э?