Роль липополисахарида (ЛПС, эндотоксин) в биологии достаточно многогранна. Эндотоксин представляет собой липополисахарид, являющийся обязательным структурным элементом клеточной мембраны грамотрицательных бактерий. Для эволюции ЛПС представляется облигатным фактором филогенеза и обнаруживается у всех живых существ, начиная с сине-зеленых водорослей и заканчивая человеком [1]. ЛПС, попадая в кровоток из просвета кишечника, легких или после лизиса грамотрицательных бактерий, транспортируется в комплексе с белком-переносчиком и взаимодействует со специфическим Toll-рецептором (TLR4), в конечном итоге образует сигнальный комплекс, действуя в организме как экзогормон адаптации и как универсальный фактор патогенеза хронических и острых патологических состояний организма [2]. В физиологических условиях уровень эндотоксемии регулируется гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой [3].

Не всякое повышение уровня эндотоксина в крови требует коррекции. Мишенью для терапии являются пациенты с выраженной эндотоксемией, которая сопровождается клинической картиной генерализованного воспаления, органными дисфункциями и шоком, что, в свою очередь, приводит к риску развития неблагоприятных исходов. У пациентов с почечно-печеночной и кишечной дисфункциями лизис бактерий на фоне активного применения антибиотикотерапии и нарушения элиминации ЛПС приводят к прогрессированию эндотоксемии [4] (рис. 1).

Рис. 1. Патогенез развития эндотоксемии и место экстракорпоральной терапии в коррекции гиперпродукции липополисахарида.

На настоящий момент нет эффективной терапевтической стратегии по коррекции эндотоксемии. Попытка использования фармакологических препаратов моно- и поликлональных антител, конкурентных ингибиторов и средств, направленных на нейтрализацию эндотоксина, пока не привели к ожидаемым результатам [5].

Экстракорпоральные устройства позволяют быстро снизить концентрацию ЛПС лишь в сосудистом русле, но уровень эндотоксина может поддерживаться за счет поступления его из тканевого пространства по механизму уравновешивания концентраций [6]. В связи с этим применяемые адсорбционные устройства должны обладать высокими емкостными возможностями и надежно связывать эндотоксин на протяжении времени, достаточного для вовлечения в процесс всего системного эндотоксина. Раннее начало такой экстракорпоральной терапии может позволить значительно улучшить результаты лечения у пациентов с явлениями выраженной эндотоксемии [4].

Цель исследования — оценить сорбционные характеристики различных экстракорпоральных устройств при пропорционально возрастающей концентрации ЛПС в бычьей фетальной сыворотке в условиях стендовой экспериментальной модели.

В этой работе планируется проверить гипотезу о том, что все предлагаемые к использованию устройства способны адсорбировать ЛПС, но их емкостные характеристики различаются.

Материал и методы

В эксперименте использованы реактивы, оборудование и методические приемы, которые наиболее часто встречаются при описании тестирования емкостных возможностей картриджей, оценке контроля качества, а также в лабораторных и клинических исследованиях [7—12].

Оборудование, использованное в опыте, включало коническую стеклянную колбу объемом 2000 мл, насос перфузионный для крови BMM-10 (Gambro, Швеция), насос перфузионный для крови и растворов JHBP-2000 (Ji-Hua, КНР), насос инфузионный Infuzomat Space (B. Braun, Германия), водяную баню-термостат TW-2.03 (ELMI, Латвия), мешалку магнитную ММ-135 (ООО «Таглер», Россия), одноразовые артериовенозные кровопроводящие магистрали A316R-V814R (Nipro, Япония), одноразовые шприцы 50 мл (VOGT Medical, Германия), линии для инфузии (B. Braun, Германия).

В качестве адсорбционных устройств оценены универсальная колонка oXiris (Baxter, США), Alteco LPS Adsorber (Alteco, Швеция), Токсипак (ООО НПФ «Покард», Россия), Эфферон ЛПС (АО «Эфферон», Россия), Toraymyxin PMX-20R (Toray Industries, Япония). Характеристики исследуемых колонок представлены в таблице [13—15].

Характеристика исследуемых устройств [13—15]

Примечание. ЛПС — липополисахарид; ЕЭ — единицы эндотоксина.

В качестве среды использована фетальная бычья сыворотка FBS, F7524-500ML (Sigma Aldrich, США). Источником эндотоксина служил лиофилизированный липополисахарид LPS Escherichia coli O111:B4, L4391-1MG (Sigma Aldrich, США). Для оценки содержания эндотоксина турбидиметрическим методом использовали ЛАЛ-тест Pyrostar ES-F Multi Test, 0.03 EU/mL (Fujifilm Wako, Япония).

Измерение проводилось на аппарате для ЛАЛ-теста Toxinometer ET6000 с прилагаемым программным обеспечением Toximaster QC (Fujifilm Wako, Япония).

Сыворотка и реагенты готовились и разводились с использованием воды для анализов LRW-2030 (Fujifilm Wako, Япония). Для подготовки образцов и проведения анализа применялись апирогенные и стерильные пробирки Пиротест (ООО «НПО "ЛАЛ-Центр"», Россия) и Limulus Test Tube-S (Fujifilm Wako, Япония).

Для оценки адсорбции эндотоксина испытуемыми колонками использовали метод замкнутой циркуляции, ранее описанный в публикациях [5]. ЛПС E. coli вводили со скоростью 33 мкг/час в 1,5 л фетальной бычьей сыворотки при 37 °C на протяжении 4 часов. Раствор осторожно перемешивали с использованием магнитной мешалки, и он циркулировал в замкнутом контуре, включающем кровопроводящую магистраль и исследуемую колонку, как показано на рис. 2, 3. Каждую колонку предварительно промывали и заполняли стерильным апирогенным раствором 0,9% NaCl с помощью роликового насоса в соответствии с инструкциями производителя. Скорость циркуляции задавалась согласно инструкции производителя каждой колонки — 100 мл/мин для Toraymyxin РМХ-20R и «Токсипак», 150 мл/мин для Alteco LPS Adsorber, oXiris и «Эфферон ЛПС». Температуру сыворотки в колбе поддерживали при 37 °C с использованием водяной бани в течение всего периода циркуляции.

Рис. 2. Схема экспериментальной установки для исследования емкостных возможностей различных сорбционных устройств (система закрытого контура с постоянной подачей эндотоксина).

* — линия для забора ультрафильтрата только для опыта с oXiris.

Рис. 3. Фотография экспериментальной установки для исследования емкостных возможностей различных сорбционных устройств (система закрытого контура с постоянной подачей эндотоксина).

Исследование проводилось в течение 11 дней. В 1-й день оценивали возможное влияние кровопроводящей магистрали на изменение концентрации ЛПС при проведении перфузии. Оценку емкостных возможностей устройства Toraymyxin проводили на 4-й и 7-й день, «Токсипак» — на 9-й и 11-й дни, Alteco LPS Adsorber — на 8-й и 10-й дни, oXiris — на 2-й и 6-й дни и «Эфферон ЛПС» — на 3-й и 5-й дни. Для анализа результатов взяты средние значения после проведения 2 исследований на каждой колонке.

Образцы сыворотки собирали до начала инфузии ЛПС — точка отсчета, через 30, 60, 120 и 240 мин после начала циркуляции. Собранные образцы хранились при 4 °C.

Полученные образцы сыворотки в дальнейшем разбавляли водой для разведения LRW, не содержащей эндотоксинов, после чего измеряемый образец смешивали с ЛАЛ-реагентом в соотношении 1:1. Концентрация ЛПС для каждой временной точки взятия пробы получена в нг/мл.

Расчетные показатели

Расчет коэффициента адсорбции эндотоксина (КАЭ) к моменту взятия образца:

где I_{T(минута)} — общее количество ЛПС в микрограммах, введенное в контур перфузии к моменту времени T от начала перфузии; M_{T(минута)} — количество ЛПС в микрограммах, измеренное в контуре перфузии в момент времени T от начала перфузии.

Результаты

На рис. 4, 5 представлены полученные результаты адсорбции ЛПС кровяной магистралью (эксперимент №1) и исследуемыми устройствами (эксперимент №2) на фоне пропорционально увеличивающейся концентрации эндотоксина в бычьей сыворотке.

Рис. 4. Насыщение резервуара с бычьей сывороткой липополисахаридом (33 мкг/час), количество (мкг) адсорбированного липополисахарида кровяной магистралью (эксперимент №1) и различными сорбционными устройствами (эксперимент №2) в течение 240 минут.

Рис. 5. Коэффициент адсорбции различных устройств в исследуемых контрольных точках.

Светлый прямоугольник — коэффициент адсорбции в пределах 60—70%; темный прямоугольник — коэффициент адсорбции в пределах от 10 до 20% (изотерма адсорбции эндотоксина I. Langmuir) [10].

Эксперимент №1. На этом этапе работы оценивали влияние кровопроводящей магистрали на изменение концентрации ЛПС при проведении перфузии (см. рис. 4). Через 240 мин в отсутствие в контуре адсорбционного устройства количество ЛПС снизилось на 0,36 мкг, что составляло 0,3% от общего количества введенного за это время эндотоксина. Влияние кровяной магистрали на содержание ЛПС (КАЭ) снижалось в течение эксперимента.

Эксперимент №2. Полученные в результате опыта данные позволили оценить емкостные возможности адсорбционных устройств в течение 240 минут перфузии при пропорционально возрастающей концентрации ЛПС (см. рис. 5).

КАЭ при применении изделия Toraymyxin PMX-20R составил от 67,88 до 71,67%, что позволило связать в среднем 70,54% от введенного ЛПС за 240 мин.

Универсальный сет oXiris показал наилучший результат по КАЭ через час от старта (18,21%). В последующем КАЭ снижался на 44%, что позволило удалить менее 10,2% от всего введенного за 240 минут эндотоксина.

Через час от начала процедуры зарегистрированы самые высокие результаты по колонке Эфферон ЛПС (КАЭ — 10,55%). КАЭ уменьшался через час на 11% и еще через 3 ч на 36% по сравнению с отметкой 60 мин.

При испытании Alteco LPS Adsorber максимальный результат по КАЭ зафиксирован к 120-й минуте (12,55%), что позволило удалить менее 8,91% ЛПС к завершению эксперимента.

Колонка «Токсипак» показала наилучшую производительность к 4 часам работы с результатом КАЭ 10,63% от введенного эндотоксина.

Обсуждение

Исследование емкостных возможностей адсорбции ЛПС экстракорпоральными устройствами в условиях in vitro при нарастающей в течение 240 мин концентрации эндотоксина (33 мкг/час) в фетальной бычьей сыворотке проводилось впервые.

Результаты подтвердили гипотезу, что все испытуемые устройства (универсальная колонка oXiris, Alteco LPS Adsorber, колонка для ЛПС-сорбции «Токсипак», селективный ЛПС-адсорбер «Эфферон ЛПС», колонка для экстракорпоральной гемоперфузии Toraymyxin PMX-20R) обладали свойством связывать ЛПС, соответствовали модели изотермы Лэнгмюра, но показатели коэффициента адсорбции эндотоксина значительно различались у тестируемых устройств.

В реальных клинических условиях объемы эндотоксемии значительно превышают измеренные значения за счет ее распространенности во внесосудистом компартменте. Степень выраженности генерализованного ответа организма и тяжесть органных нарушений напрямую зависят от величины эндотоксиновой нагрузки, которую можно лишь косвенно оценивать в сосудистом русле. В работах A. Romaschin и соавт. [5] и других авторов [16, 17] приводятся данные о соответствии уровня эндотоксемии и результатов тестов ЕАА, рассчитанные на 13 л совокупного объема внутри- и внесосудистой жидкости при массе 70—80 кг. Значение теста ЕАА 0,6 соответствует уровню эндотоксемии 12,5 мкг. Значение ЕАА более 0,9 отражает экспоненциальный рост количества эндотоксина в организме и может значительно превосходить 50 мкг.

Для пациентов с выраженной эндотоксемией, прогрессирующей на фоне бактериального лизиса (последствия антибиотикотерапии) и бактериальной транслокации (осложнение гипоперфузии) важно, чтобы максимальный эффект от применяемой экстракорпоральной терапии наступал как можно раньше и позволял смягчить «ударную волну». С целью реализации преимуществ экстракорпоральной терапии необходимо пролонгированно и эффективно снижать концентрацию ЛПС в сосудистом русле [18]. Можно примерно рассчитать, что для уменьшения содержания эндотоксина в крови с уровня 50—52 мкг (соответствует ЕАА 0,9) до 10 мкг (ЕАА 0,59) необходимо использовать устройства с КАЭ не менее 75%.

В данной работе оценивались возможности картриджей в условиях, приближенных к состоянию выраженной эндотоксемии, когда концентрация ЛПС увеличивается, в эксперименте уже через 60 мин от начала инфузии количество введенного эндотоксина составило 33 мкг, через 120 мин — 66 мкг, а через 240 мин — 132 мкг. Проведенное стендовое испытание позволило измерить количество (мкг) адсорбированного на каждой из колонок эндотоксина за различные временные промежутки и рассчитать коэффициент адсорбции (%) по каждой временной точке (30, 60, 120, 240 мин).

Устройство Toraymyxin PMX-20R на настоящий момент может являться стандартом для выполнения высокоэффективной и пролонгированной адсорбции ЛПС, поскольку характеризуется максимальным КАЭ. Важно отметить, что, несмотря на указанную в рекомендациях к изделию длительность процедуры гемоперфузии 120 мин, в эксперименте даже к 240-й минуте емкость адсорбции не снижалась. Подобные результаты получены и другими авторами в лабораторных и клинических исследованиях, в которых максимальная продолжительность процедуры исчислялась 12 и 24 ч [19—21]. Колонку Toraymyxin целесообразно использовать при любых повышенных значениях эндотоксина в крови, принимая во внимание тяжесть состояния пациента. Кратность выполнения процедур можно определить, оценивая степень изменений значений теста ЕАА в течение 24—36 ч от момента окончания процедуры гемоперфузии.

Полученные в результате эксперимента по оценке емкостных характеристик данные позволяют предположить, что использование универсального сета oXiris, Alteco LPS Adsorber, устройства «Эфферон ЛПС» может быть целесообразно в течение 1—2 ч у пациентов с низким уровнем активности ЕАА. При высокой степени эндотоксемии (особенно при наличии острой почечной дисфункции) в литературе обсуждается вариант последовательной и/или параллельной процедуры экстракорпоральной терапии [4, 22], когда на фоне работы различных мембран для конвекционно-диффузионных методик очистки крови применяется полимиксиновая гемоперфузия, или это делается последовательно в обратном порядке.

Устройство «Токсипак» на основе полисахаридной гранулированной матрицы и химического лиганда, специфичного к грамотрицательным бактериям, показало, что по времени применения для достижения максимального эффекта относится к разряду «стайеров», а по емкостным возможностям не может быть использовано для пациентов с высокой степенью эндотоксемии.

Ограничения исследования. Испытание имело некоторые ограничения. Полученные результаты не могут быть напрямую перенесены для применения в клинических условиях, так как получены в стендовом эксперименте с использованием фетальной бычьей сыворотки, а не на цельной человеческой крови, и не дают возможности полноценно моделировать ответ организма.

Длительность испытания ограничена 240 мин, что не позволило оценить возможности устройств при более длительной гемоперфузии.

Содержание эндотоксина в экспериментальной модели и темпы его нарастания многократно превышали возможные варианты эндотоксемии в условиях организма. После проверки в клинических исследованиях полученные результаты могут помочь сберечь время и избежать неэффективного лечения при применении ранней экстракорпоральной терапии у пациентов с различной степенью эндотоксемии.

Выводы

1. Впервые оценены емкостные характеристики наиболее часто применяемых устройств для адсорбции эндотоксина при пропорционально нарастающей в течение 240 минут концентрации липополисахарида (33 мкг/час) в условиях in vitro в бычьей фетальной сыворотке.

2. Экстракорпоральные устройства для очистки крови oXiris, Alteco LPS Adsorber, «Эфферон ЛПС», «Токсипак» и Toraymyxin РМХ-20R характеризуются различными способностями адсорбировать эндотоксин. Для получения максимального эффекта от селективной экстракорпоральной терапии при выборе устройства необходимо ориентироваться на коэффициент адсорбции.

3. В этом опыте максимальный коэффициент адсорбции к 240-й минуте (70,54%) показал картридж Toraymyxin PMX-20R. Устройства с коэффициентом адсорбции в пределах 10—20% представлены универсальным сетом oXiris и колонкой «Токсипак» (не более 10,2 и 10,63% соответственно). Адсорбционная емкость колонок «Эфферон ЛПС» и Alteco LPS Adsorber в среднем не превышала 10% (6,77 и 8,91% соответственно).

Стендовое испытание выполнено в рамках фундаментальной научной темы ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» «Профилактика, ранняя диагностика и эффективное лечение критических состояний у хирургических больных».

ФНИ шифр 0510-2019-0013; №г/регистр. АААА-А19-119032890016-4.

Финансовую поддержку в проведении стендового испытания оказало Общество с ограниченной ответственностью «Медиторг» по договору с ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» о проведении научно-исследовательских работ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Бабаев М.А., Дымова О.В., Еременко А.А.

Сбор и обработка материала — Бабаев М.А., Дымова О.В., Матвеева Н.А.

Статистический анализ данных — Дымова О.В., Бабаев М.А.

Написание текста — Бабаев М.А.

Редактирование — Еременко А.А.

Авторы заявляют об отсутствии иных конфликта интересов.

The authors declare that they have no other conflicts of interest.

Комментарии

В представленной статье авторы попытались воспроизвести методику экспериментальной работы C. Yamashita и соавт. (2018, [20] по списку источников обсуждаемой статьи) с постоянным введением в модельную среду раствора эндотоксина.

При этом вместо колонки PMX-1R с объемом заполнения 8 мл использована колонка PMX-20R с объемом заполнения 135 мл, объем модельной среды увеличен в 10 раз (до 1500 мл), а суммарное количество введенного в модельную среду эндотоксина — в 11 раз (до 132 мкг). Такая модель не прошла валидацию, а авторы приводят данные всего двух экспериментов. Полученные результаты не совпадают с результатами C. Yamashita и соавт. (2018), у которых коэффициент адсорбции эндотоксина (КАЭ) достигает максимума (около 75%) на втором часе перфузии (в это время в модельную среду введено всего 2 мг эндотоксина) и в последующем, в результате насыщения сорбента, снижается до 40%. В представленных авторами результатах экспериментов КАЭ практически не меняется, оставаясь в диапазоне от 67 до 72%, несмотря на увеличивающееся количество вводимого эндотоксина, достигающее 132 мг на четвертом часе перфузии, т.е. насыщения сорбента не происходит. Такой результат противоречит теории монослойной адсорбции Ленгмюра, на которую ссылаются авторы, но никак ими не комментируется. Требуется тщательная проверка полученных данных в бóльшем количестве экспериментов.

Основным инструментом сравнения различных адсорбентов является построение изотерм адсорбции — зависимостей равновесной концентрации тестируемого вещества от его начальной концентрации. Построенные авторами кривые, однако, не являются изотермами адсорбции, исходя из методики проведения экспериментов.

Несомненным достоинством работы является сравнение различных гемосорбентов по их способности к удалению эндотоксина. Но условия экспериментов не стандартизованы: прежде всего различается скорость перфузии (100 и 150 мл/мин). При объеме модельной среды 1500 мл и скорости перфузии 150 мл/мин модельная среда в течение четырех часов пройдет через сорбционную колонку 24 раза, а при скорости перфузии 100 мл/мин — 16 раз. Различия, несомненно, значимы. При интерполяции в практическую плоскость такая ситуация соответствует пропусканию через колонку различного числа объемов циркулирующей крови. Ссылка на инструкции в данном случае неправомочна, так как инструкции касаются перфузии колонки цельной кровью. Рекомендуемые в инструкциях скорости перфузии связаны не с сорбционными, а с гидродинамическими характеристиками сорбционных колонок. Не учтены авторами и различные объемы заполнения сорбционных колонок. Между тем при исходном заполнении их 0,9% раствором NaCl и перфузии по замкнутому контуру разные объемы заполнения приведут к разной степени разведения модельной среды. При ограниченном количестве экспериментов (всего по два с каждым гемосорбентом!) ошибка может быть значимой.

Все перечисленное выше существенно снижает ценность обсуждения и обоснованность выводов. В итоге полученные результаты не могут быть интерполированы в клиническую практику и использоваться в рекламных целях производителями и дистрибьюторами сорбционных колонок.

Вместе с тем, сам факт появления подобного исследования является важным событием: он свидетельствует о росте интереса клиницистов к фундаментальным аспектам экстракорпоральных технологий, и потому представляется еще одним шагом на пути к их осмысленному применению на основе точных научных знаний в интересах пациента.

А.А. Соколов, д.м.н., Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

Главному редактору журнала «Анестезиология и реаниматология», профессору К.М. Лебединскому

Глубокоуважаемый Константин Михайлович!

Ознакомившись со статьей «Адсорбционные возможности различных экстракорпоральных устройств по очистке крови от липополисахарида в условиях его нарастающей концентрации (стендовый эксперимент in vitro на фетальной бычьей сыворотке)», поступившей в редакцию журнала «Анестезиология и реаниматология», считаем возможным сообщить Вам, главному редактору этого периодического издания, что, безусловно, авторы подготовили чрезвычайно интересную публикацию, которая будет важным пособием для врачей-реаниматологов, специалистов эфферентной терапии и клинических патофизиологов. Публикация результатов данного исследования является тем редким случаем, когда клиницисты на основании проведения стендового эксперимента представили обоснованные выводы, которые будут чрезвычайно полезными для повседневной работы специалистов реанимационных отделений Российской Федерации. Результаты данного фундаментального исследования позволят докторам, основываясь также на степени тяжести клинического состояния пациентов с эндотоксемией, обоснованно использовать разнообразные сорбционные устройства, многие из которых в последнее время широко представлены на Российском медицинском рынке. На основании динамично проведенного эксперимента с постоянно возрастающей концентрацией эндотоксина авторы оценили емкостные характеристики наиболее часто применяемых в стране сорбентов и показали, что изучаемые картриджи обладают различной способностью адсорбировать ЛПС. В результате проведенного настоящего фундаментального исследования были сделаны абсолютно обоснованные выводы, что для достижения максимального эффекта селективной сорбции специалистам эфферентной терапии необходимо ориентироваться на коэффициент адсорбции той или иной сорбционной колонки. Кроме того, стендовые испытания показали, что при максимальной концентрации эндотоксина к 4 часу эксперимента наивысший коэффициент адсорбции показало устройство Toraymyxin-20R (Toray, Япония), при существенно более низкими значениями этого показателя у других колонок, применяемых в РФ. Эти выводы подтверждаются фактами, изложенными в статье D.Klein с соавтрами Polymyxin B hemoperfusion in endotoxemic septic shock patients without extreme endotoxemia: a post hoc analysis of the EUPHRATES trial.Intensive Care Med 44, 2205—2212 (2018), в которой было показано, что статистически значимое снижение летальности в рандомизированном исследовании EUPHRATES trial, опубликованном в 2018 г., наблюдалось именно среди пациентов с чрезвычайно высокой концентрацией эндотоксина (ЕАА>0,8) у крайне тяжелой категории больных с сепсисом и септическим шоком, у которых применяли селективную сорбцию с помощью картриджей Toraymyxin-20R.

Безусловно, в статье «Адсорбционные возможности различных экстракорпоральных устройств по очистке крови от липополисахарида в условиях его нарастающей концентрации (стендовый эксперимент in vitro на фетальной бычьей сыворотке)» имеются мелкие «шероховатости» (например, в табл. 1 необходимо указать ссылки на авторов публикаций, данные из которых приводятся в таблице), но они нисколько не умаляют достоинства, одного из первых в стране экспериментального исследования, проведенного в рамках выполнения фундаментальной научной темы крупнейшего в РФ клинического учреждения «РНЦХ им.академика Б.В.Петровского».

По нашему глубокому убеждению, считаем, что данная статья должна быть опубликована на страницах ведущего в стране журнала анестезиологов-реаниматологов!

Член-корр. РАН, проф. М.Б. Ярустовский,

Главный анестезиолог-реаниматолог Кемеровской области, проф. Д.Л. Шукевич