В настоящее время в диагностике лимфопролиферативных заболеваний достигнуты большие успехи. В 2008 г. обновлена классификация ВОЗ, большинство нозологических единиц имеет свой отличительный иммунофенотип, выявлены специфические генетические транслокации, позволяющие надежно верифицировать диагноз. В большинстве случаев после тщательного гистологического и иммуногистохимического исследований, суммируя результаты проточной цитометрии и клинические данные, патолог может уверенно поставить диагноз. Однако в 5—10% случаев даже после интенсивного всестороннего анализа постановка диагноза затруднена. В такой ситуации целесообразно применение молекулярно-генетических методов.

В начале 80-х годов ХХ века японским ученым S. Tonegawa [17] были изучены механизмы генетических преобразований, происходящих при созревании В-лимфоцитов. В это же время аналогичные процессы описаны и для Т-лимфоцитов [3]. Перестройки генов иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов (TCR) — природный механизм, обеспечивающий многообразие антител и Т-клеточных рецепторов. Эти знания легли в основу разработки методов молекулярно-генетического анализа лимфом, а S. Tonegawa был удостоен за свою работу Нобелевской премии. Указанные генетические реаранжировки происходят в ранней стадии развития B- и Т-лимфоцитов и приводят к уникальной для каждой клетки перестройке, что позволяет ей экспрессировать уникальное антитело или Т-клеточный рецептор соответственно. Таким образом, каждый B-лимфоцит отличается от всех остальных строением генов Ig, а Т-лимфоцит несет уникальную перестройку генов TCR, отличающую его от других Т-клеток. Иными словами, как В-, так и Т-лимфоциты различаются на генетическом уровне.

Неходжкинская лимфома — злокачественное новообразование лимфоидной ткани, развивающееся из единственной клетки-предшественницы, которая, пролиферируя, образует опухоль. Все клетки, составляющие опухолевую ткань, — потомки одной клетки-предшественницы, абсолютно идентичные ей по своей генетической структуре, — являются ее клонами. В зависимости от этапа созревания, на котором находилась клетка-родоначальник опухоли, возникает все многообразие нозологических единиц лимфом [7]. Напротив, большинство реактивных состояний — процессы, в которых участвует множество различных B- и/или Т-лимфоцитов, т.е. эти заболевания поликлональны по своей природе. На этом принципе базируется молекулярно-генетическое разделение лимфом и реактивных состояний. Важно подчеркнуть, что исследование В- и Т-клональности — высокоэффективный и надежный диагностический инструмент. Однако это не самостоятельная процедура, позволяющая разделить злокачественный лимфопролиферативный процесс от доброкачественного, а метод комплексного анализа, дающий возможность врачу объективизировать диагноз.

При исследовании В- и Т-клеточной клональности в качестве анализируемых мишеней выступают гены тяжелых (IgH) и легких (IgK, IgL) цепей иммуноглобулинов и гены бета-(TCRB)- и/или гамма-(TCRG)-цепей Т-клеточного рецептора. Данные гены перестроены в каждом лимфоците уникальным образом, эта перестройка и является предметом анализа.

Для правильной интерпретации результатов молекулярных тестов крайне важно знать биологический и иммунологический смысл перестроек. Ген IgH состоит из множества V(variable)-, D(diversity)- и J(joining)-сегментов. Собственно процесс перестройки проходит в два условных этапа. Вначале один из D-сегментов присоединяется к определенному J-сегменту. Возникает неполная D-J-перестройка. На втором этапе к этому комплексу присоединяется один из многочисленных V-сегментов. Формируется полная V-D-J-перестройка. Все «промежуточные» участки генома, находящиеся между сегментами-участниками процесса, удаляются (рис. 1).

Аналогичным образом происходит перестройка генов каппа- и ламбда-цепей Ig. Они, однако, имеют более простое строение — не содержат D-сегменты, и V-J-реаранжировка происходит одноэтапно (см. рис. 1). Все процессы имеют строгую временнýю очередность: вначале перестраивается ген IgH, затем IgK. Если эти события приводят к образованию функциональной перестройки, т.е. сформированные последовательности ДНК несут информацию о белковой последовательности антитела, клетка продолжает развиваться далее. Такой B-лимфоцит будет экспрессировать антитела с легкой каппа-цепью. Если же сформированные реаранжировки несут стоп-кодоны или нечитаемую последовательность ДНК, это значит, что произошла нефункциональная перестройка, поэтому далее перестраивается уже ген IgL. Этому предшествует удаление части IgK-гена (B-лимфоцит не может одновременно экспрессировать каппа- и ламбда-цепи).

Гены Т-клеточного рецептора перестраиваются по аналогичному механизму, но со своими особенностями и в определенном порядке. Так, вначале происходит перестройка гена дельта-цепей (TCRD), затем TCRG, следом TCRB и в самом конце перестраивается ген альфа-цепей (TCRA), при этом делетируется TCRD (ТCR могут состоять или из альфа-бета, или из гамма-дельта-цепей).

Таким образом, благодаря только комбинаторной составляющей число различных вариантов перестроек для генов Ig равно примерно 2·10⁶, альфа-бета-TCR — около 3·10⁶, для гамма-дельта-TCR — около 5·10³. Однако при соединении V-D-J-сегментов в числе прочих работает фермент — терминальная дезоксинуклеотидил-трансфераза (TdT), которая прикрепляет к концам перестраивающихся сегментов некоторое количество нуклеотидов. В результате первичная структура ДНК изменяется, а количество возможных вариантов многократно увеличивается и превышает 10¹², что более чем достаточно для обеспечения иммунитета [18].

Долгое время «золотым стандартом» при анализе перестроек Ig- и TCR-генов был метод саузерн-блот-гибридизации. При этом обнаружение перестройки происходит после рестрикции ДНК различными рестриктазами с последующей гибридизацией со специфическим зондом [10]. Метод дает хорошие результаты для генов с высоким комбинаторным репертуаром — IgH, IgK и TCRB, сложнее обстоит дело с генами IgL и TCRA. В целом метод чрезвычайно эффективен и специфичен, однако имеет и недостатки: трудоемок, требует высокого качества анализируемой ДНК, длительного времени исполнения, обладает относительно невысокой чувствительностью.

Конец ХХ века стал настоящей эрой полимеразной цепной реакции (ПЦР). С 90-х годов начинается активное использование этого метода для определения клональности В- и Т-лимфоцитов [4, 16]. Действительно, применение метода ПЦР в этом случае имеет ряд существенных преимуществ:

— высокую скорость, относительно низкую трудоемкость и простоту исполнения;

— возможность анализировать образцы ДНК более низкого качества, мелкие биоптаты и материал парафиновых блоков;

— высокую чувствительность — 1—10% и более опухолевых клеток в образце.

В 90-х годах прошлого века выходит большое количество статей, посвященных опыту использования ПЦР для анализа клональности. Однако отсутствие единой стандартной методологии привело к широкому разбросу данных, получаемых в отдельных лабораториях. Среди причин расхождения результатов можно назвать две основные:

— ложноотрицательные результаты преимущественно ввиду технических причин: недостаточно хорошего качества праймеров, использования консенсусных праймеров вместо мультиплексной технологии, диагностики по одному локусу вместо использования комплементарных мишеней, отсутствия стандартных реакционных смесей и условий проведения ПЦР;

— ложноположительные результаты в основном из-за ошибок в интерпретации полученных результатов.

Ввиду ценности метода для диагностики лимфопролиферативных заболеваний стала очевидной необходимость стандартизации, разработки единого протокола. В связи с этим в Европе был инициирован проект BIOMED-2, призванный стандартизовать протокол определения клональности методом ПЦР. В работе участвовали 7 европейских стран, около 47 научных центров и учреждений — более 90 активных участников. С 1998 по 2002 г. шла активная работа по подбору и синтезу праймеров, их тестированию, весь материал анализировала команда экспертов-патологов. В результате были разработаны эффективные праймеры, протестированы и определены качество и концентрации Taq-полимеразы, создана стандартная программа ПЦР, подобраны оптимальные буферы для проведения реакции, а также утверждены 2 метода детекции полученных результатов. Итоги более чем 4-летней работы опубликованы в 2003 г. в журнале «Leukemia» как отчет BIOMED-2 Concerted Action [18]. Вскоре была продемонстрирована высокая эффективность метода ПЦР и его хорошая конкордантность с саузерн-блотом [13, 14]. Изучена ценность использования комплементарных мишеней при проведении молекулярных тестов. Так, при исследовании В-клеточной клональности недостаточно использовать лишь праймеры к FR3-региону, как это делалось в ранних работах. Анализируя полную перестройку, нужно использовать все три группы праймеров: FR1, FR2 и FR3 (рис. 2).

При проведении молекулярно-генетического анализа клональности B- или Т-лимфоцитов можно получить два основных типа результатов (см. рис. 2). Первый: на электрофореграмме видно большое число ПЦР-продуктов — пиков, образующих куполообразную кривую по типу гауссова распределения. Такой результат свидетельствует о том, что в исследуемом образце присутствуют поликлональные (несущие разные перестройки) лимфоциты. Подобная картина характерна для реактивных состояний. Второй результат: виден только единичный пик, свидетельствующий о клональной природе (генетической однородности) лимфоцитов образца, что характерно для опухолевых процессов.

При выполнении анализа на тканях, фиксированных формалином и заключенных в парафин, исследователь сталкивается с рядом трудностей. Выделенная ДНК обычно невысокого качества и концентрации, содержит примеси — ингибиторы ПЦР и большое число ковалентных сшивок, частично фрагментирована. Данный вопрос был детально изучен в ходе проекта BIOMED-2. С учетом имеющегося опыта была разработана мультиплексная ПЦР-смесь с праймерами к контрольным генам [2, 15]. Система создана таким образом, чтобы получаемые ПЦР-продукты имели длину 100, 200, 300, 400 и 600 п.н. Проведенные исследования показали, что выделенная из парафиновых блоков ДНК вполне пригодна для исследования клональности при условии, что размер амплифицируемых продуктов в контрольной реакции составляет не менее 300 п.н. Опыт использования метода в нашей лаборатории также подтверждает это. Помимо качества, не менее важна и концентрация исследуемой ДНК. Она должна составлять 50—200 нг на одну ПЦР объемом 50 мкл. В каждом случае вносимое в реакцию количество ДНК следует подбирать индивидуально для каждого образца в зависимости от качества материала, общего количества В- или Т-клеток, а главное — от содержания в нем предположительно опухолевых клеток.

В заключение необходимо рассмотреть преимущества и недостатки метода определения клональности. Основные преимущества:

— метод позволяет надежно дифференцировать злокачественный и доброкачественный лимфопролиферативный процесс. Анализ клональности может быть полезным в 30% случаев в лабораториях, не специализирующихся на диагностике лимфопролиферативных заболеваний, и в 10% случаев — в специализированных учреждениях [19]. В этой же работе показано, что при использовании стандартизованного протокола BIOMED-2 соответствующая клональность была обнаружена в 99% В-клеточных и в 94% случаев T-клеточных лимфом. Методом ПЦР были протестированы 369 гистологически установленных образцов В-клеточных лимфом [5]. В большинстве случаев была определена B-клеточная клональность, а также показана ценность использования комплементарных локусов (D-J и IgK);

— молекулярно-генетический анализ позволяет установить наличие или отсутствие взаимоотношений между двумя и более одновременно протекающими процессами, т.е. определить, являются ли поражения независимыми друг от друга или представляют собой одну патологию. Также можно дифференцировать рецидив опухоли и новообразование, возникшее de novo;

— метод обладает крайне высокой чувствительностью — от 1% опухолевых клеток в образце, но наиболее надежные результаты удается получить при чувствительности 5—10% и выше.

Для правильного применения метода необходимо знать и его ограничения.

— Обнаруженная клональность не является синонимом злокачественности и не всегда означает наличие лимфомы. Крайне важно интерпретировать результаты молекулярных тестов в контексте всех имеющихся гистологических, клинических и иммуногистохимических данных. Необходимо тесное сотрудничество патолога с молекулярным биологом. Например, в одной из крупных работ исследовали В- и Т-клеточную клональность в материале 106 гистологически подтвержденных реактивных процессов. Действительно, 75% случаев оказались истинно поликлональными, для 15% образцов был получен сомнительный результат, но после их тщательного всестороннего исследования они также были признаны поликлональными [9]. Однако 10% образцов (12 пациентов) имели явную клональную природу. После их гистологического пересмотра выяснилось, что среди них действительно оказались две пропущенные лимфомы. Остальные 10 пациентов имели клональность при гистологически верифицированном доброкачественном процессе. Очевидно, с иммунологической точки зрения большинство реактивных процессов протекает с вовлечением многочисленных поликлональных лимфоцитов. Вместе с тем есть инфекционные заболевания (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом Эпштейна—Барр, токсоплазмоз, туберкулез), а также особые воспалительные процессы (саркоидоз и др.), при которых организм может отвечать с помощью генетически ограниченного спектра клеток лимфоидного ряда. В настоящее время недостаточно выяснено, как эти активированные антигеном иммунные реакции проявляются на ДНК-уровне. Поэтому во всех случаях появления сомнительных и спорных результатов в первую очередь необходимо исключить технические ошибки и учесть патофизиологию протекающего процесса. Существуют также доброкачественные состояния с установленной клональной природой.

— Клональность нельзя расценивать как прямой маркер линейности. Хотя в большинстве В-лимфом обнаруживается В-клеточная клональность, а в Т-лимфомах — Т-клеточная, существуют исключения и ограничения. В первую очередь нужно помнить о «нелегитимных» (перекрестных) перестройках, главным образом это касается B- и Т-лимфобластных лейкозов/лимфом у детей. Однако в лимфомах из зрелых лимфоцитов также обнаружены такие перекресты, хотя и в значительно меньшем проценте случаев. Так, около 10—20% B-клеточных лимфом несут перестройки TCR-генов, в свою очередь около 5—10% Т-лимфом содержат перестройки генов Ig [19]. Такие находки иногда связывают с присутствием сопутствующих клонов противоположной линейности. Существуют также нозологии, при которых перекрестные перестройки особенно часты: около 27% ангиоиммунобластных Т-клеточных лимфом имеют как В- так и Т-клональность, а в 5% случаев данного заболевания выявляется только В-клональность, что при недостаточно всестороннем анализе может привести к ложному диагнозу. В 24% случаев ALK+ и 11% случаев ALK– Т-клеточных лимфом Т-клеточная клональность не выявляется [1]. Все вышеперечисленное безусловно необходимо учитывать при постановке диагноза.

— Псевдоклональность — обратная сторона высокой чувствительности ПЦР-методологии. При анализе мелких биоптатов с незначительным количеством лимфоцитов можно обнаружить ложную клональность. Следует избегать мелких тонкоигольных биоптатов или материала с незначительным количеством лимфоидных клеток. В этом случае возможно как обнаружение псевдоклональности, так и получение ложноотрицательного результата (отсутствие опухоли в образце). Другой пример появления псевдоклональных результатов — анализ реактивных лимфатических узлов с ограниченным репертуаром иммунного ответа, т.е. случаев, когда в узле идет выработка нескольких клонов клеток, например, в ответ на активно протекающую вирусную инфекцию. По этой же причине клональность можно обнаружить в материале, содержащем один крупный герминативный центр. Во всех случаях получения спорных результатов необходимо проводить повторные исследования в параллельных реакциях и консультацию с опытными коллегами, а не пытаться интерпретировать результат исходя из высоты пиков или площади, которую они занимают [19].

— Ложноположительные результаты — преимущественно следствие ошибок в интерпретации полученных данных. Эта проблема во многом решена благодаря использованию современных методов детекции — ГД-анализа и GeneScanning.

— Ложноотрицательные результаты возможны при высокой степени мутаций в месте отжига праймеров, что приводит к отсутствию ПЦР. Этот феномен хорошо известен для лимфом, прошедших соматическую гипермутацию. Фолликулярная, В-диффузная крупноклеточная лимфома, лимфома из клеток маргинальной зоны, множественная миелома — вот перечень лимфом, представляющих наибольшую трудность в выявлении В-клональности при недостаточном количестве исследуемых локусов. Решение этой проблемы — использование, кроме полной V-D-J-перестройки, анализа комплементарных локусов (D-J и IgK), что значительно уменьшит число ложноотрицательных результатов.

Разработанный стандартизованный протокол BIOMED-2 лег в основу создания диагностических тест-систем для определения клональности В- и Т- лимфоцитов. Сегодня эти наборы коммерчески доступны — www.invivoscribe.com, а сам протокол стал мировым стандартом при диагностике клональности [6, 11, 12]. Широкое распространение этой техники и относительная простота ее выполнения требуют контроля качества и обучения специалистов для правильного использования метода, снижения диагностических ошибок [8]. С этой целью ежегодно проводится обучающий семинар для всех, кто начал использовать метод или имеет какие-либо затруднения — www.euroclonality.org. На этом же сайте можно получить ответы на часто задаваемые вопросы, а также проконсультироваться при сложных диагностических случаях с опытными коллегами.

На сегодняшний день молекулярно-генетическое исследование клональности B- и Т-лимфоцитов — высоконадежный метод комплексного анализа, который в контексте гистологических, клинических и иммуногистохимических данных эффективно помогает патологу поставить или подтвердить диагноз.