С развитием таргетной терапии злокачественных новообразований важным разделом в работе патологоанатомов, специализирующихся в области онкоморфологии, стало предсказание чувствительности опухолей к новым лекарственным таргетным препаратам. Первым таким препаратом, определение чувствительности к которому стало проводиться на биопсийном и операционном материале, был трастузумаб (герцептин), применяющийся сейчас при лечении рака молочной железы и рака желудка только при наличии гиперэкспрессии белка или амплификации гена HER2. Для лечения рака молочной железы трастузумаб используется в виде монотерапии, после одной или более схем химиотерапии; в комбинации с паклитакселом или доцетакселом, в случае отсутствия предшествующей химиотерапии (первая линия); в комбинации с ингибиторами ароматазы при положительных гормональных рецепторах у женщин в постменопаузе; в адъювантной терапии после проведения хирургического вмешательства, завершения химиотерапии и лучевой терапии; в комбинации с адъювантной химиотерапией, состоящей из доцетаксела и карбоплатина; в комбинации с паклитакселом или доцетакселом после адъювантной химиотерапии доксорубицином и циклофосфамидом. Герцептин представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к рецептору человеческого эпидермального фактора роста 2-го типа (HER2). Ген рецептора HER2 амплифицирован у 18—20% больных раком молочной железы. HER2 — это гликопротеин с молекулярной массой 185 кД, обладающий тирозинкиназной активностью [1]. Амплификация гена приводит к гиперэкспрессии белка HER2 [5, 6]. Определение HER2-статуса важно в нескольких аспектах, поскольку наличие его гиперэкспрессии является фактором:

— ассоциированным с худшим прогнозом (высокий риск рецидива и смерти от заболевания);

— предиктором эффективности некоторых видов системной химиотерапии (относительная резистентность к гормонотерапии);

— определяющим чувствительность опухоли к таргетным препаратам трастузумаб и лапатиниб;

— предиктором ответа на лечение негормональными препаратами (хороший ответ на терапию антрациклинами в связи с коамплификацией гена TOPO2A) [7].

Результаты пяти международных рандомизированных клинических исследований показали, что адъювантная терапия трастузумабом снижает риск рецидива на 50% и риск смерти на 34% у пациенток при ранних стадиях рака молочной железы [7]. Герцептин активирует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, предотвращает образование белка р95, блокирует HER2-зависимую клеточную пролиферацию, ингибирует ангиогенез, регулируемый рецептором HER2. Все эти действия препарата подтверждают необходимость определения HER2-статуса для решения вопроса о проведении лекарственной терапии больным раком молочной железы и подчеркивают исключительную значимость корректной оценки экспрессии этого белка и/или амплификации гена.

Для определения HER2-статуса применяется несколько методов: иммуногистохимический (определение количества белка HER2 на клеточной поверхности) и гибридизация in situ в различных вариантах (определение количества копий гена HER2). Определять HER2-статус следует при первично установленном диагнозе всем больным раком молочной железы. Исследование проводится только в инвазивном компоненте опухоли на биопсийном и операционном материале, фиксированном нейтральным формалином в течение 6—24 ч (в зависимости от размера образца) и залитом в парафин [2, 3]. Для иммуногистохимического исследования (ИГХ) применяются антитела разных коммерческих фирм и разные клоны. Утвержденными для клинического морфологического использования Американской ассоциацией клинических онкологов и Коллегией американских патологов (ASCO/CAP) являются наборы Ventana CONFIRM HER2/Neu, 4В5 («Roche Tissue Diagnostics»), HercepTest, А0485 («Dako») [2—4]. Для подтверждения наличия амплификации гена используется метод гибридизации in situ (ГИС) — флюоресцентная in situ гибридизация с использованием наборов PathVysion («Abbott») или HER2 FISH pharm Dx («Dako») [2] — и гибридизация in situ, усиленная серебром INORM HER2 DNA probe — SISH dual color («Ventana») [4]. Оценку гиперэкспрессии белка или амплификации гена проводят по утвержденным критериям. Иммуногистохимические реакции оцениваются по балльной шкале: 0, 1+, 2+ и 3+, а при оценке амплификации гена определяют соотношение количества сигналов, соответствующих гену HER2 и центромерному участку хромосомы 17 (HER2/CEP17). В 2007 г. были изданы «Стандартные рекомендации ASCO/CAP по исследованию экспрессии HER2 при раке молочной железы» [7], в которых было изменено пограничное значение позитивно окрашенных клеток рака с 10 до 30% (табл. 1),

В соответствии с Рекомендациями ASCO/CAP, по которым работают подавляющее большинство патологов в разных странах, в настоящее время утверждены алгоритм (см. рисунок)

— положительный HER2-статус определяется как ИГХ 3+ (выраженное мембранное окрашивание более чем 30% опухолевых клеток) или при ГИС, когда среднее значение количества копий гена HER2 более 6 сигналов на ядро или соотношение HER2/CEP17 больше или равно 2,2;

— отрицательный HER2-статус определяется как ИГХ 0/1+ (отсутствие окрашивания или слабое неполное мембранное окрашивание в любом количестве клеток) или при ГИС, когда среднее значение количества копий гена HER2 менее 4 сигналов на ядро или соотношение HER2/CEP17 менее 1,8;

— неопределенный HER2-статус оценивается как ИГХ 2+ (неполное выраженное мембранное окрашивание или слабое по интенсивности равномерное мембранное окрашивание более 10% опухолевых клеток либо выраженное мембранное окрашивание менее 30% опухолевых клеток) или при ГИС, когда среднее значение количества копий гена HER2 4—6 сигналов на ядро или соотношение HER2/CEP17 1,8—2,2.

Неопределенный HER2-статус по ИГХ 2+ требует проведения дополнительного исследования методом ГИС для определения амплификации гена HER. Неопределенный HER2-статус по ГИС (HER2/CEP17 1,8—2,2) требует анализа дополнительного количества ядер опухолевых клеток (не менее 40) или повторения ИГХ- и ГИС-исследований.

По результатам ИГХ- и ГИС-исследований терапия герцептином показана пациенткам с инфильтративным раком молочной железы только в следующих случаях: при гиперэкспрессии HER2 (ИГХ 3+), неопределенной экспрессии HER2 (ИГХ 2+) и выявленной амплификации гена, наличии амплификации гена HER2 в случаях первичного тестирования методом ГИС.

В своих рекомендациях ведущие эксперты ASCO/CAP указывают, что лаборатория может проводить тестирование HER2-статуса, если методы, используемые в лаборатории, сопоставлены с уже стандартизованными, и их совпадение составило не менее 95% по положительным и отрицательным результатам, а в лаборатории ежегодно проводится не менее 250 тестирований методом ИГХ и не менее 100 — методом ГИС. Эти рекомендации являются значимыми и для тестирования, которое проводится в нашей стране.

В России HER2-тестирование рака молочной железы впервые начали проводить в 2000 г. в трех ведущих онкологических учреждениях — Российском онкологическом научном центре РАМН им. Н.Н. Блохина, Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена, Онкологическом институте им. Н.И. Петрова. Во всех этих клинических центрах в течение 2000—2004 гг. было проведено всего немногим более 100 диагностических исследований иммуногистохимическим методом, а ГИС-исследование проведено впервые в МНИОИ им. П.А. Герцена в 2004 г., и за два года было выполнено около 10 анализов. Для проведения ИГХ-исследований использовались поликлональные концентрированные антитела к с-erbB-2 (А0485, «Dako»).

С 2005 г. началось российское многоцентровое исследование «Эпидемиологическая программа скрининга HER2-статуса у пациенток с раком молочной железы». Уже в первый год действия программы с 2005 по 2006 г. было протестировано 1198 образцов рака молочной железы, а в 2007 г. все лаборатории, участвующие в программе, исследовали 25 756 образцов. В итоге с 2001 по 2011 г. в России было протестировано более 170 тыс. больных раком молочной железы. В настоящее время в России определение HER2-статуса рака молочной железы проводится в 89 лабораториях, включая 8 референсных центров по всей стране. В 2011 г. лаборатории и референсные центры, участвующие в скрининге, протестировали 43 322 пациенток, из них в Северо-Западном федеральном округе — 5293, Центральном федеральном округе — 15 589 (включая Москву — 6343), Уральском федеральном округе — 4544, Южном федеральном округе — 4628, Северо-Кавказском федеральном округе — 543, Приволжском федеральном округе — 7057, Сибирском федеральном округе — 4203, Дальневосточном федеральном округе — 1465 больных. Также весьма показательны данные, иллюстрирующие увеличение ГИС-исследований: в 2007 г. — 335 исследований, которые выполнялись в двух лабораториях, а в 2011 г. — 3862 исследования в 14 лабораториях. В 2009 г. ГИС-исследования провели в 26,26% случаев с неопределенным статусом по ИГХ 2+, в 2010 г. — в 52,82%, в 2011 — в 76,39%, что указывает на распространение ГИС-исследования в крупных клинических онкологических центрах России и повышение уровня квалификации патологоанатомов, использующих самые современные технологии. Для исследования амплификации гена HER2 в настоящее время в нашей стране в подавляющем большинстве случаев используется либо методика флюоресцентной, либо хромогенной усиленной серебром гибридизации in situ. Из 43 322 случаев, протестированных в 2011 г., положительный HER2-статус по ИГХ 3+ был выявлен в 6700 случаях, и в 1134 случаях (из 3662 образцов ИГХ 2+) была обнаружена амплификация гена HER2. Иными словами, положительный HER2-статус был определен в 18,08% всех наблюдений. Эти результаты практически полностью совпадают с результатами зарубежных клинических исследований [8] и показывают в целом удовлетворительное качество проведения тестирования. Однако следует отметить, что результаты региональных лабораторий и референсных центров различны, а совпадение варьирует от 60 до 95%.

Сравнение доли пациенток с положительным HER2-статусом (ИГХ 3+ и ИГХ 2+/ГИС+), выявленных в 2010 г. — 17,19% и в 2011 г. — 18,08% показало, что внедрение автоматизированного иммуногистохимического метода с помощью иммуногистостейнеров, которые за последний год появились во многих лабораториях, улучшает качество тестирования и позволяет исключить ряд ошибок, обусловленных человеческим фактором. На повышение уровня HER2-тестирования в регионах большое влияние оказывает и сама система референсных центров, созданная под эгидой Российского общества патологоанатомов. В соответствии с принятыми решениями все лаборатории, участвующие в программе, направляют свои материалы для проведения контрольных ИГХ- и ГИС-исследований в соответствующие референсные центры. В 2011 г. референсные центры вступили в международную систему контроля качества иммуногистохимических исследований, что позволяет соответствовать всем международным стандартам.

До 2010 г. лаборатории, проводящие тестирование, пользовались критериями оценки, утвержденными FDA, т.е. пограничным для ИГХ 3+ считалось значение в 10% клеток опухоли с выраженным полным мембранным окрашиванием. В 2010 г. на Форуме экспертов по раку молочной железы было принято решение о переходе всех лабораторий на критерии оценки, выработанные и рекомендованные ASCO/CAP, в которых пограничным значением для оценки ИГХ 3+ принято значение в 30% клеток опухоли с выраженным полным мембранным окрашиванием. Поэтому в 2011 г. стало возможным проанализировать изменение результатов референсных центров по HER2-тестированию в зависимости от используемых критериев оценки. Анализ этих данных показал, что при применении стандартизованных иммуногистохимических методов количество случаев, имеющих оценку ИГХ 3+ с критерием в 10%, составило 14,73%, а при 30% — 15,32%. Статистическая обработка этих результатов показала недостоверность различий в целом. Однако для групп с оценкой ИГХ 0, 1+ и 2+ выявленные различия являются достоверными (табл. 2).

Во всех лабораториях, проводящих HER2-тестирование, обязательным является также оценка рецепторного статуса рака молочной железы, т.е. всегда определяются наличие рецепторов эстрогенов, прогестерона и экспрессия HER2. В ряде лабораторий проводится также определение уровня экспрессии показателя пролиферативной активности белка Ki-67. Анализ экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона и HER2, по данным ряда референсных центров, показал, что опухоли с наличием рецепторов эстрогенов и прогестерона более чем в 1% опухолевых клеток и с гиперэкспрессией HER2 (ИГХ 3+) составляют около 9% всех исследованных случаев, а трижды негативные опухоли (экспрессия гормональных рецепторов и HER2-отрицательная) — 16%.

Таким образом, опыт десятилетнего тестирования HER2-статуса рака молочной железы в России показал, что повышение квалификации персонала, как врачей-патологоанатомов, так и лабораторных техников, внедрение стандартизованных методов работы и стандартных реагентов, автоматизация лабораторий, использование внешней системы контроля качества в референсных центрах приводят к улучшению качества тестирования чувствительности к таргетным лекарственным препаратам, снижению числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов, тем самым способствуя развитию индивидуализированной медицины и адекватному использованию экономических ресурсов.