Несмотря на активное изучение, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) остается одной из основных проблем современной реаниматологии. С 1990-х годов выделяют его раннюю стадию — острое повреждение легких (ОПЛ). В связи с большим количеством и гетерогенностью причин механизмы перехода обратимого ОПЛ в последующие фазы процесса исследованы недостаточно [1, 2], что делает фундаментальные изыскания в этом направлении особенно актуальными.

Основным звеном патогенеза ОПЛ/ОРДС является повреждение альвеолярно-капиллярной мембраны с развитием некардиогенного отека легких. Принимая во внимание, что в состав аэрогематического барьера входит общая базальная мембрана эпителия альвеол и эндотелия капилляров, возникло предположение об участии матриксных металлопротеиназ (ММР) в патогенезе синдрома. ММР — семейство протеолитических ферментов, расщепляющих основные компоненты внеклеточного матрикса. Они играют важную роль как в физиологических процессах (рост плаценты, эмбриогенез, репарация тканей), так и при патологии (опухолевая инвазия, фиброз легких, атеросклероз и др.) [3—5]. Одним из механизмов динамического сдерживания избыточной активности металлопротеиназ является синтез специфических тканевых ингибиторов — TIMP 1—4 [5—7].

Роль ММР в развитии ОПЛ/ОРДС изучали путем определения концентрации ферментов в крови и/или бронхоальвеолярной лаважной жидкости [1], что не всегда отражает истинную картину локального процесса.

В связи с этим целью настоящей работы стало исследование экспрессии ММР-2 и ее ингибитора TIMP-2 разными клетками в легких в зависимости от стадии развития экспериментального ОПЛ/ОРДС.

ОПЛ/ОРДС воспроизводили по оригинальной методике на половозрелых нелинейных крысах-самцах. Под местной анестезией 0,25% раствором новокаина проводили тонкоигольную пункцию трахеи с одновременным однократным введением лизата 45—55 тыс. крысиных нейтрофилов в 0,15—0,20 мл 0,9% раствора NaCl [8]. В контрольной группе в эквивалентном объеме инъецировали стерильный 0,9% раствор NaCl. Животных выводили из эксперимента путем передозировки кетамина на 1-е (по 25 крыс в опыте и контроле), 3-и (по 24 особи) и 6-е (по 21 животному) сутки. Развитие ОПЛ/ОРДС во всех случаях подтверждали морфологически.

Отобранный аутопсийный материал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина (рН 7,1—7,2) в течение 12 ч, после чего фрагменты заливали в парафин. Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах легочной паренхимы биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом. Срезы толщиной 3—4 мкм депарафинизировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили двукратную обработку срезов в микроволновом режиме (мощность 650 Вт) в течение 15 мин с интервалом 5 мин между процедурами для охлаждения в цитратном буфере с pH 6,0 («Dako», Дания). В качестве первичных использовали видоспецифичные мышиные антитела к ММР-2 (8B4) и TIMP-2 (3А4) («Santa Cruz biotechnology», США) в рабочих разведениях 1:250 и 1:200 соответственно, инкубацию с которыми проводили при 36 °С в течение 30 мин. В качестве вторичных применяли биотинилированные антимышиные антитела в составе рекомендованной производителем системы визуализации ABS Staining System («Santa Cruz biotechnology», США), использующей в качестве хромогена 3,3-диаминобензидина тетрахлорид. Срезы, в частности клеточные ядра, дополнительно докрашивали водным раствором гематоксилина Гаррисона. Использовали рекомендованные производителем контрольные срезы: без первичных антител для исключения неспецифического окрашивания, в качестве положительного контроля — фрагменты тканей плаценты.

Величину экспрессии ферментов в срезе определяли для всех продуцирующих клеток раздельно: при 400-кратном увеличении подсчитывали не менее 100 целевых клеточных элементов в 10 случайно выбранных полях зрения. В каждом поле количественную оценку экспрессии антигена проводили в баллах по следующей шкале: отрицательный уровень — позитивных клеток менее 10% в поле зрения; 1 балл — наличие 10—25% клеток; 2 балла — 25—50% клеток; 3 балла — 50—75% клеток; 4 балла — окрашивание более 75% клеток [9].

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Biostat 3.03. При сравнении групп использовали критерий χ². Различия считали значимыми при р≤0,05. Результаты представлены в виде процента полей зрения с соответствующим уровнем экспрессии антигена к исследованному числу полей в срезе.

Как при развитии экспериментального ОПЛ/ОРДС, так и в контрольной группе MMP-2 в разной степени экспрессировали нейтрофилы, макрофаги, фибробласты, эндотелиоциты, альвеолоциты 1-го и 2-го типов.

В опытной группе через 24 ч определялась острая (экссудативная) стадия развития синдрома — морфологический эквивалент непосредственно ОПЛ [1, 10], которая характеризовалась проявлениями «острого неинфекционного диффузного альвеолита», с накоплением в просвете альвеол нейтрофилов, мононуклеарных клеток, десквамированных эпителиоцитов, отечной жидкости, эритроцитов. В просвете сосудов отмечались множественные агрегаты нейтрофилов (рис. 1).

У особей контрольной группы, независимо от временных промежутков эксперимента, при морфологическом исследовании в единичных случаях отмечались девиации, преимущественно в виде острых нарушений микроциркуляторного кровотока (полнокровие, агрегаты форменных элементов крови), частота встречаемости которых не имела статистической значимости. Зафиксированные спорадические отклонения в контроле мы связываем с особенностями танатогенеза подопытных животных. Через 24 ч после введения 0,9% раствора NaCl наибольшая экспрессия ММР-2 зафиксирована в эндотелии — 1—2 балла в 52% полей зрения, что было значительно меньше количества фермента в эндотелиоцитах на 1-е сутки развития экспериментального ОПЛ/ОРДС (р=0,000). Фибробласты, макрофаги, нейтрофилы и альвеолоциты 2-го типа экспрессировали металлопротеиназу в одинаковой степени (1—2 балла в 18—24%), но значительно меньше, чем в 1-е сутки ОПЛ/ОРДС (при всех сопоставлениях р=0,000). Исключение составили альвеолоциты 1-го типа: уровень экспрессии ими ММР-2 был одинаковым и в опыте, и в контроле (р=0,48).

На 3-и сутки эксперимента в легких животных опытной группы отмечались разрешение от отека, формирование множественных мелкоочаговых ателектазов, миграция мононуклеарных лейкоцитов, признаки пролиферации фибробластов и синтеза коллагена (рис. 2),

Через 6 сут после введения лизата фиксировались морфологические маркеры фибротической фазы ОПЛ/ОРДС [1, 10]: увеличение объема соединительной ткани в интерстиции легких, утолщение стенок альвеол, в том числе и за счет реэпителизации и пролиферации альвеолоцитов. Кроме того, определялись изменения в интиме артериол в виде гипертрофии мышечного слоя, в единичных случаях вплоть до их полной облитерации. В этой стадии синдрома экспрессия фермента эндотелием и фибробластами оставалась на уровне II фазы ОПЛ/ОРДС (р>0,05), а в нейтрофилах (р=0,002 по сравнению с I фазой), макрофагах (р=0,03) и альвеолоцитах 2-го типа (р=0,02) уменьшалась. Различий в уровне экспрессии энзима альвеолоцитами 1-го типа во всех фазах ОПЛ/ОРДС не было (табл. 3).

При развитии ОПЛ/ОРДС, как и в контрольной группе, TIMP-2 синтезировали те же клетки, что и ММР-2, однако динамика экспрессии ингибитора отличалась. Макрофаги в контроле экспрессировали TIMP-2 на уровне 1—2 баллов в 8—12% полей зрения неизменно во все временные периоды эксперимента (р=0,09). При развитии ОПЛ/ОРДС синтез ингибитора в них не менялся (р=0,46). Экспрессия ингибитора нейтрофилами в контрольной группе была крайне низкой — 1—2 балла в 4%, не меняясь во всех временных точках эксперимента, а при развитии ОПЛ/ОРДС повышалась и достигала уровня 1—2 балла в 20% полей зрения (р=0,031), но также не зависела от фазы синдрома (р=0,06). Альвеолоциты 1-го типа в контроле не экспрессировали TIMP-2, при развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия фермента фиксировалась на уровне 1 балла в 4—8% полей зрения, значимо не отличаясь от контроля (р=0,066).

Фибробласты в контрольной группе, напротив, экспрессировали ингибитор достаточно активно: 1—2 балла — в 16—30% и 3—4 балла — в 4% исследуемых полей зрения. При ОПЛ/ОРДС экспрессия нарастала до 1—2 баллов в 45—60% полей и до 3—4 баллов — в 12—16% полей зрения (р=0,05), но от фазы синдрома не зависела (р=0,2). Эндотелиоциты экспрессировали TIMP-2 достаточно активно (1—2 балла в 30—32%), но парадоксально отвечали на введение 0,9% раствора NaCl: происходило значимое угнетение экспрессии ингибитора до 1—2 баллов в 16—20% полей зрения в течение 72 ч (р=0,04). При развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия эндотелием TIMP-2 значительно повышалась и достигала уровня 1—2 балла в 46—52% и 3—4 балла — в 12—16% полей зрения (р=0,000), но от фазы синдрома также не зависела (р=0,61). Альвеолоциты 2-го типа, экспрессируя TIMP-2 в контроле на уровне 1—2 баллов в 22% и 3—4 баллов — в 6%, также реагировали угнетением синтеза энзима в ответ на введение 0,9% раствора NaCl в течение 72 ч до 1—2 баллов в 8—10% полей зрения (р=0,02 при сопоставлении с базовой экспрессией). При развитии ОПЛ/ОРДС экспрессия TIMP-2 в альвеолоцитах 2-го типа оставалась на уровне контроля во всех фазах (р=0,68).

Основная функция ММР-2 — расщепление нефибриллярного коллагена базальных мембран (коллагена IV типа), эластина, фибронектина [7]. TIMP-2 способен как непосредственно ингибировать ММР-2, так и через инактивацию мембранной ММР-14, которая переводит ММР-2 в активную форму [5]. Баланс между этими ферментами необходим для адекватной пролиферации и дифференцировки клеток при репарации.

Полученные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о следующих процессах. В контроле ММР-2 одинаково экспрессировали все описанные клетки. TIMP-2 синтезировался неравномерно: интенсивнее в эндотелии и фибробластах. Такое соотношение синтеза ферментов, по-видимому, поддерживает равновесие в системе ММР-2/TIMP-2. В ответ на минимальное воздействие (эндотрахеальное введение 0,9% раствор NaCl) через 24 ч эндотелиоциты и альвеолоциты 2-го типа реагировали повышением экспрессии ММР-2 более чем в 2 раза, на фоне угнетения в них синтеза TIMP-2. Повреждения в итоге не наступило, следовательно, такие колебания не нарушают равновесия в системе, а эндотелиоциты и альвеолоциты 2-го типа наиболее чутко реагируют на воздействие повреждающих факторов смещением в системе ММР-2/TIMP-2 в сторону повышения протеолитической активности.

Резкий (в 3—4 раза) прирост экспрессии ММР-2 в экссудативной фазе ОПЛ/ОРДС на фоне менее выраженного синтеза TIMP-2, вероятно, смещает равновесие в сторону избыточного протеолиза, что вносит свой вклад в повреждение аэрогематического барьера. Менее значимый перевес металлопротеиназы в системе ММР-2/TIMP-2 в пролиферативной стадии синдрома, возможно, поддерживает необходимое в этот момент умеренное повышение уровня протеазы в локусе воспаления. Есть данные, что ММР-2 при умеренном повышении концентрации активирует трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и параллельно разрушает важнейший провоспалительный цитокин интерлейкин-1β (ИЛ-1β) [5, 7]. Следовательно, в этой стадии синдрома ММР-2 препятствует адгезии нейтрофилов к эндотелию и их гиперактивации (нивелируются свойства ИЛ-1β, разрушается фибронектин), а также опосредованно участвует в привлечении в очаг моноцитов крови (TGF-β является их хемоаттрактантом). В III фазе ОПЛ/ОРДС наблюдался сдвиг в системе в сторону TIMP-2 (экспрессия ММР-2 уменьшалась, а ингибитора оставалась неизменной), что, безусловно, влияет на развитие фибротических изменений в легких.

Таким образом, в каждой стадии развития ОПЛ/ОРДС соотношение в системе ММР-2/TIMP-2 имеет свои особенности и вносит вклад как в повреждение альвеолярно-капиллярной мембраны, так и в развитие фиброза в исходе процесса.