Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), к которым традиционно относят болезнь Крона и язвенный колит, широко распространены среди населения [1, 2]. Возникновение ВЗК зависит от многих факторов (генотип, возраст, особенности питания, стрессы и др.), и их механизмы развития изучены недостаточно [3, 4]. Существующие методы лечения ВЗК не отличаются высокой эффективностью [3]. Большинство исследований, посвященных морфологическим изменениям толстой кишки при болезни Крона и язвенном колите, основано на изучении биопсийного материала, что не позволяет в полной мере оценить динамику развития воспалительного процесса и структурных изменений всех оболочек кишки.

Для изучения механизмов возникновения воспалительного процесса, оценки эффективности лекарственных препаратов широко используется адекватная и хорошо воспроизводимая экспериментальная модель язвенного колита, предложенная I. Okayasu и соавт. в 1990 г. - декстрансульфат натрия (ДСН), - индуцированный колит [5].

Механизм альтерирующего и провоспалительного действия ДСН на толстую кишку изучен недостаточно. Показано, что ДСН оказывает прямое цитотоксическое действие, вызывая нарушение проницаемости эпителиального барьера, транслокацию микрофлоры, воспалительный процесс с развитием эрозий и язв [6, 7]. ДСН фагоцитируется макрофагами слизистой оболочки толстой кишки, лимфатических узлов, печени и селезенки [8].

В ряде работ охарактеризованы некоторые морфологические изменения ободочной кишки при ДСН-индуцированном остром и хроническом колите у мышей [9-12]. Однако в указанных работах описаны изменения главным образом слизистой оболочки, а данные о морфологических изменениях стенки ободочной кишки при хроническом колите фрагментарны.

Цель настоящей работы - изучение морфологических изменений стенки ободочной кишки при хроническом колите, индуцированном ДСН у самцов мышей линии C57Bl/6.

Исследование проводили на половозрелых самцах мышей линии C57Bl/6 (возраст 8-9 нед) и массой тела 18-22 г (n=20; филиал «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН, Россия). Поступившие в виварий ФГБУ НИИМЧ РАМН экспериментальные животные были помещены на 2-недельный карантин. Мышей содержали в открытой системе при температуре 18-22 °С и при естественном освещении, они получали в свободном доступе воду и комбикорм ПК-120-1 (сертификат соответствия №POCC RU.nO81.B00113, ГОСТ P50258-92).

Колит моделировали с помощью замены в поилках питьевой воды на 2% раствор ДСН (Dextran sulfate sodium salt Mr ~40,000, «Sigma», США). Животных разделили на 2 группы. 1-я группа (8 мышей), контрольная, на протяжении всего исследования получала обычную питьевую воду, а 2-я группа (12 мышей), опытная, - в течение 6 дней 2% водный раствор ДСН, затем - питьевую воду. Животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом на 21-е сутки эксперимента.

В ходе исследования проводили оценку клинических признаков колита: определяли массу тела перед началом эксперимента и при выведении из него, ежедневно регистрировали характер стула. Ободочную кишку извлекали из брюшной полости, разрезали по брыжейке, промывали забуференным изотоническим раствором натрия хлорида, расправляли на миллипоровом фильтре и помещали в фиксатор Буэна. После гистологической проводки кусочки заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином, по трехцветному методу Массона и Нисслю [13].

В гистологических срезах продольно ориентированной ободочной кишки, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали количество лимфоидных узелков (абсолютное число на 1 см длины среза, ув. 100). В слизистой оболочке ободочной кишки оценивали клеточный состав инфильтрата (среднее число клеток на 1 мм длины среза, ув. 100).

Проводили статистическую обработку данных методами непараметрической статистики. Результаты представляли в виде медианы и межквартильного размаха (Me (0,25L;0,75U)). Сравнение результатов между группами проводили по U-критерию Манна-Уитни. Статистически значимыми считали значение при p<0,05. Для статистической обработки данных и построения диаграмм использовали пакеты Statistica 8.0 (StatSoft) и Excel MS Office 2010 (Microsoft).

Статистически значимых различий показателей массы тела у мышей 1-й и 2-й групп перед началом и в конце эксперимента выявлено не было (1-я группа - контрольная: в начале эксперимента 25 г (22,26), при выведении из эксперимента 26 г (24,26) соответственно; хронический колит: 25 г (23,27) и 24,5 г (23,25)). На 3-й день потребления раствора ДСН у 2 из 10 мышей был выявлен жидкий стул, к концу 2-й недели жидкий стул определялся у максимального числа животных (6 из 8), к концу эксперимента он был у 2 из 8 животных. На 9-й и 14-й день эксперимента 2 мыши умерли.

При гистологическом исследовании ободочной кишки у мышей контрольной группы (рис. 1, а)

Во 2-й группе (опытной) у животных на 21-е сутки эксперимента в ободочной кишке выявлялась морфологическая картина хронического колита (см. рис. 1, б-г). Отмечались ремоделирование слизистой оболочки, уменьшение числа крипт, деформация, расширение их просветов и заполнение слизью, была выражена воспалительная инфильтрация слизистой оболочки, представленная плазмоцитами, гистиоцитами и единичными нейтрофилами. По сравнению с контрольной группой у мышей с хроническим колитом в эпителиальной выстилке было снижено число бокаловидных клеток. Встречались участки с реэпителизацией язв, а также зоны, где слизистая оболочка имела ворсинчатый контур. В мышечном слое воспалительная инфильтрация из лимфоцитов и гистиоцитов была слабо выражена. По сравнению с контрольной группой мышей в опытной группе увеличилось число лимфоидных узелков, в части их выявлялись светлые центры (рис. 2).

По сравнению с мышами контрольной группы при хроническом колите выявлялось статистически значимое повышение показателей содержания плазмоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой основе ободочной кишки (см. таблицу).

В связи с тем что у больных язвенным колитом наблюдаются нарушения перистальтики кишечника [14], особый интерес представляет исследование состояния нервной системы, представленной в кишечнике двумя сплетениями: подслизистым и межмышечным. При хроническом колите у мышей в ганглиях как подслизистого, так и межмышечного сплетения выявлялись гиперхромные нейроны с явлениями кариолизиса, глиальные клетки были сохранены (рис. 3).

Таким образом, при хроническом колите, индуцированном ДСН, у мышей-самцов линии C57Bl/6 в ободочной кишке выявлены ремоделирование слизистой оболочки с уменьшением числа бокаловидных клеток, крипт и их глубины, воспалительная инфильтрация из лимфоцитов, плазмоцитов и гистиоцитов, гиперплазия лимфоидной ткани, диффузный и очаговый склероз, альтеративные изменения нейронов подслизистого и межмышечного сплетений.

Полученные нами данные в целом согласуются с описанными в ряде работ морфологическими изменениями слизистой оболочки ободочной кишки при хроническом ДСН-индуцированном колите. Так, согласно данным литературы, в слизистой оболочке при ДСН-индуцированном хроническом колите наблюдаются выраженная лимфоидно-плазмоцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистого слоя, изменения архитектоники крипт. Просветы крипт расширяются, становятся извилистыми. Базальные отделы крипт не достигают мышечной пластинки. Расстояние между криптами увеличивается, а их число уменьшается [10, 12].

При хроническом ДСН-индуцированном колите в зонах эрозий и язв собственная пластинка слизистой оболочки замещается грануляционной тканью, выстланной кубическим эпителием. По данным некоторых исследователей, эпителизирующиеся язвенные дефекты слизистой оболочки наблюдаются у мышей линии С57Bl/6, а у мышей Balb/С они отсутствуют [12].

При ВЗК развивается фиброз слизистой оболочки и мышечного слоя [15]. Он характерен и для ДСН-индуцированного хронического язвенного колита. S. Ding и соавт. [16] проводили исследования ДСН-индуцированного колита на мышах-самцах линии C57Bl/6 с встроенной репортерной конструкцией проколлагена α1 с белком GFP и выявили в зонах воспалительных изменений активацию генов проколлагена α1 в слизистой и мышечной оболочках ободочной кишки. На основании данных по двойному иммунофлюоресцентному окрашиванию исследователи заключают, что ген проколлагена активируется главным образом в фибробластах и миофибробластах слизистой и мышечной оболочек. Однако отмечается, что в процесс могут быть вовлечены миоциты и интерстициальные клетки мышечной оболочки [16].

Изменения нервной системы толстой кишки при хроническом ДСН-индуцированном колите не описаны. Однако в исследовании B. Gulbransen и соавт. [11] показана гибель пуринергических нейронов межмышечного сплетения на 3-и сутки после 5-дневного потребления 3% раствора ДСН. Исследователи полагают, что нейроны гибнут путем апоптоза, индуцированного паннексином-1 (Panx-1) - белковым каналом для АТФ. Избыток АТФ в участке воспаления приводит к сверхактивации P2X7-рецептора, связанного с паннексинами, и активации каспазного пути. Это приводит к гибели значительного числа нейронов, но не глиальных клеток, на которых ни паннексин-1, ни Р2Х7-рецептор не выявляется.

Отмеченные нами изменения в ободочной кишке у мышей в определенной мере соответствуют изменениям толстой кишки у больных язвенным колитом [17]. При язвенном колите у больных также наблюдается локализация поражения в толстой кишке, выражены воспалительная инфильтрация слизистой оболочки преимущественно из лимфоцитов и плазмоцитов с примесью нейтрофильных лейкоцитов, эпителизация язв, укорочение и деформация крипт, ворсинчатая деформация поверхности слизистой оболочки, склерозирование мышечной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы, увеличение числа лимфоидных узелков.

Таким образом, морфологические проявления хронического колита, индуцированного ДСН у самцов мышей линии C57Bl/6, во многом соответствуют язвенному колиту у человека. С помощью этой экспериментальной модели можно исследовать механизмы возникновения и развития данного заболевания, а также проводить доклиническую оценку эффективности лекарственных средств.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.В.М., С.О.К., Д.Н.Х., Н.А.З.

Сбор и обработка материала: С.О.К., Д.Н.Х., Н.А.З., М.Т.Д.

Статистическая обработка данных: С.О.К., Н.А.З.

Написание текста: Н.А.З., С.О.К.

Редактирование: О.В.М.