Грипп относится к числу важнейших социально значимых инфекций. С ним связывают, особенно в эпидемический период, многочисленные летальные исходы. ВОЗ приводит данные о 250—500 тыс. летальных исходов гриппа в мире ежегодно [1]. Вместе с тем вопрос о достоверности статистики, касающейся летальности и смертности от гриппа, не является окончательно решенным. В настоящее время при определении смертности от гриппа используют данные медицинских свидетельств о смерти, учитывая только лабораторно подтвержденные случаи [2, 3]. Этот способ следует признать не до конца объективным, так как диагноз в медицинском свидетельстве может быть неточно сформулирован или неверно зашифрован.
В литературе имеются сведения, что в случае летальных исходов от гриппа как в прежние годы [4, 5], так и в период последней эпидемии [6] имеются характерные именно для этой инфекции изменения, позволяющие по меньшей мере заподозрить этот диагноз. Однако в подавляющем большинстве зарубежных и многих отечественных публикаций вопросы характерных для гриппа изменений чувствительных клеток не рассматриваются. В работах вирусологов, эпидемиологов, инфекционистов и патологоанатомов подробно изучена возможность заболевания и даже летальных исходов (особенно у детей) в межэпидемический период. Роль гриппа в танатогенезе не всегда однозначна, что особенно актуально для умерших с комбинированными заболеваниями [7]. Кроме того, в силу целого комплекса объективных и субъективных причин некоторые умершие, страдавшие респираторными инфекциями, ни прижизненно, ни посмертно не обследуются регламентированными вирусологическими методами [полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией] и в связи с этим полностью выпадают из поля зрения статистики.
В работах А.В. Цинзерлинга и представителей его научной школы ранее было показано, что большинство очаговых пневмоний имеет вирусно-бактериальную этиологию, а грипп неблагоприятно влияет на течение менингококковой инфекции и сепсиса у детей и стафилококковой инфекции в эксперименте [4, 8, 9]. В период эпидемий гриппа происходит увеличение количества летальных исходов ИБС, пневмоний, а также повышается уровень общей смертности, характеризующий «дополнительную смертность», под которой понимают число летальных исходов, превышающее ожидаемое количество умерших в определенное время года в местности, охваченной эпидемией [10—13].
Во второй половине XX века рядом зарубежных исследователей были разработаны статистические приемы в основном на базе регрессионного и корреляционного анализа для количественной оценки влияния эпидемий гриппа на дополнительную смертность [14]. В зарубежных и отечественных работах, посвященных этой проблеме, подробно освещены вопросы выявления и количественной оценки дополнительной смертности в популяции по нозологиям, половозрастной структуре, а также по отношению к преобладающим в различные эпидемии серотипам вируса [10—13, 15, 16]. Вместе с тем прямых доказательств роли вируса гриппа и гриппозной инфекции в летальных исходах от соматических заболеваний имеется недостаточно. На основании статистических данных о дополнительной смертности можно предположить, что этиологическое значение вируса гриппа, в частности в возникновении пневмоний, больше, чем официально регистрируется. Одним из наиболее объективных методов проверки этого предположения в случаях летальных исходов является проведение комплексных клинико-морфологических исследований.
Целью настоящего исследования была оценка возможной роли вируса гриппа в летальных исходах от пневмоний в период эпидемий и в межэпидемический период.
На патологоанатомических материалах трех патологоанатомических отделений больниц и бюро СМЭ Архангельска проведен клинико-морфологический анализ 40 летальных исходов очаговых пневмоний за 2009—2013 гг. с использованием иммуногистохимического метода. Для анализа было выбрано 20 случаев (основная группа), в которых при наличии пневмонии клиническая и/или морфологическая картина позволяла заподозрить ОРВИ (грипп), но по разным причинам такой диагноз не был установлен. В 18 случаях пациенты на ОРВИ не были обследованы, в 2 — результат исследования носоглоточного мазка методом ПЦР был отрицательным. 17 случаев относились ко времени пандемии (вскрытия с ноября 2009 г. по январь 2010 г.), а также сезонного подъема заболеваемости (февраль—март 2011 г., февраль—апрель 2013 г.), 3 случая наблюдались в межэпидемический период.
Дополнительно была сформирована контрольная группа из 20 образцов, в которых не было ни клинических, ни последующих морфологических оснований подозревать грипп. В данной группе было выделено 2 подгруппы. В первую были включены 8 летальных исходов, произошедших в указанные выше эпидемические периоды. В большинстве случаев у умерших имелось тяжелое основное заболевание, а пневмония рассматривалась как танатогенетически значимое осложнение и носила преимущественно гнойный характер (6 из 8). Во вторую подгруппу было включено 12 смертельных исходов бактериальных пневмоний различной этиологии во внеэпидемические периоды.
Срезы с одним—двумя парафиновыми блоками из ткани легкого в каждом случае освобождали от парафина в ксилоле, регидратировали в спиртах убывающей концентрации, обрабатывали мышиными моноклональными антителами к нуклеопротеину вируса гриппа, А (ОАО «ППДП», Санкт-Петербург), отмывали от несвязавшихся антител и инкубировали с раствором вторичных антител, меченных пероксидазой («Sigma», кат.#A2304). После отмывки от несвязанных вторичных антител проводили визуализацию метки при помощи системы визуализации («Abcam», ab64238) в соответствии с инструкцией производителя. Для положительного контроля использовали по одному парафиновому блоку с кусочком легкого из материалов трех секционных случаев (2009, 2011 и 2013 г.) с лабораторно и морфологически подтвержденным гриппом, для отрицательного контроля — по одному парафиновому блоку с кусочком легкого из патологоанатомических материалов, относящихся к трем летальным исходам во внеэпидемические периоды, при которых поражения дыхательных путей и легких отсутствовали.
При анализе результатов иммуногистохимического исследования обращали внимание на тип клеток, дающих позитивную реакцию, их внешний вид, локализацию, численность, тип и интенсивность окрашивания. Для определения численности позитивных клеток и интенсивности реакции использовали раздельную полуколичественную оценку: 0+ (окраска отсутствует), 1+ (окраска средней интенсивности, количество позитивных клеток 1—2 на 10 полей зрения при увеличении в 400 раз, для эпителия бронхов — позитивность клеток хотя бы в одном эпителиальном пласте в срезе), 2+ (окраска интенсивная, количество позитивных клеток более 2 на 10 полей зрения при увеличении в 400 раз, для эпителия бронхов — позитивность клеток более чем в одном пласте в срезе). В единичных наблюдениях окраску эпителия бронхов определили как сомнительную из-за выраженного фонового окрашивания.
Клинически у большинства больных основной группы (14 из 20) отмечались катаральные явления, кашель, фебрильная лихорадка, одышка. Продолжительность заболевания составила от 5 до 46 сут (в среднем 16,3±13), позднее 16-х суток от начала заболевания умерли только 4 пациента. В 5 случаях клинической информации о больных не имелось (4 пациента умерли дома, материал был получен из БСМЭ, 1 — в приемном отделении через несколько минут после поступления, находясь в терминальном состоянии, и анамнез не был собран). В одном случае клинические признаки как ОРВИ, так и пневмонии, по данным медицинской документации, полностью отсутствовали. Соответственно по этим же причинам в указанных 6 наблюдениях отсутствовали сведения о длительности заболевания.
Морфологические признаки вероятного гриппа включали наличие характерных цитопатических/цитопролиферативных изменений в бронхиальном и альвеолярном эпителии (рис. 1). Пролиферация эпителия бронхов с появлением крупных светлых ядер выявлялась в 14 (70%) случаях (рис. 2), из них в 11 наблюдениях в альвеолах обнаруживались макрофаги с увеличенными ядрами и интенсивно окрашенной цитоплазмой и 1—2-ядерные альвеолоциты со сходными изменениями (рис. 3). В остальных случаях наблюдалась морфологическая картина пневмонии вирусной или вирусно-бактериальной этиологии. В большинстве случаев [12 (60%) из 20] пневмония носила преимущественно серозно-десквамативный характер, часто с наличием гиалиновых мембран, в остальных наблюдениях, в том числе при небольшой продолжительности заболевания, экссудат в альвеолах был смешанным с преобладанием гнойного, в некоторых случаях также имелся гнойный бронхит.
Ведущая танатогенетическая роль поражения легких установлена в 17 наблюдениях. В остальных 3 случаях пациенты с ИБС в анамнезе умерли внезапно, при этом диагностирована острая коронарная недостаточность или инфаркт миокарда, а очаговая серозно-десквамативная пневмония выявлена только при патологоанатомическом исследовании. Известно, что у 2 из них примерно за неделю до смерти имелись клинические признаки ОРВИ.
При иммуногистохимическом анализе было установлено, что в группе положительного контроля отмечалось среднее по интенсивности и распространенности цитоплазматическое окрашивание эпителиальных клеток (альвеолоцитов и бронхиального эпителия), в двух случаях окрашивались также макрофаги, локализованные как на поверхности, так и в глубине альвеолярной стенки, в одном наблюдении распространенность и интенсивность позитивной реакции макрофагов была оценена на 2+. Окрашивания эндотелиальных клеток не отмечено. В группе отрицательного контроля окрашенных клеток не выявлено.
В опытной группе позитивная иммуногистохимическая реакция в цитоплазме эпителия бронхов установлена в 10 (50%) случаях, в том числе в 3 — интенсивная (рис. 4), в 2 — распространенная. Окраска пластов бронхиального эпителия не была диффузной: позитивную реакцию демонстрировали преимущественно клетки с увеличенными светлыми ядрами округлой формы. В 3 случаях окраска оценена как сомнительная. Окрашивание альвеолоцитов (также цитоплазматическое) отмечено в 6 (30%) наблюдениях: в 5 распространенное, в 2 из них интенсивное (рис. 5). Во всех 6 случаях имелось также четкое окрашивание бронхиального эпителия. Случаи с высокой интенсивностью окраски эпителиальных клеток демонстрировали также более распространенное их окрашивание. Позитивная реакция в цитоплазме макрофагов обнаружена в 11 (55%) наблюдениях, численность окрашенных клеток оценена на 2+ в четырех случаях, интенсивность окраски — в пяти. В 8 (73%) наблюдениях из 11 отмечалась также позитивная реакция в эпителиальных клетках, во всех этих случаях макрофаги демонстрировали высокоинтенсивное и/или распространенное окрашивание. Окрашенные макрофаги находились преимущественно в стенке альвеол, не демонстрируя цитопатических изменений, и только в трех случаях в просвете (рис. 6). В эндотелии кровеносных сосудов позитивная реакция встретилась в 3 (15%) наблюдениях в единичных клетках (тип окрашивания ядерный и цитоплазматический), во всех случаях сочетаясь с окрашиванием альвеолоцитов и/или бронхиального эпителия, а также макрофагов. Следует отметить, что положительная реакция обнаруживалась только в тех эпителиальных клетках, в которых имелись цитопатические/цитопролиферативные изменения. В наблюдениях, в которых указанные изменения не выявлялись, окраска клеток бронхиального и альвеолярного эпителия отсутствовала. Позитивная реакция в эпителиальных клетках обнаруживалась максимально на 22-е сутки от начала заболевания, в эндотелии — на 13-е сутки, в макрофагах — на 40-е сутки. При наличии признаков бактериальной пневмонии (8 наблюдений с нейтрофильными лейкоцитами в альвеолах) окрашивание бронхиального эпителия имелось в 3 (37,5%) случаях, альвеолярного — в 2 (25%).
В двух случаях, в которых при жизни проводилось исследование носоглоточного мазка методом ПЦР с отрицательным результатом, при иммуногистохимическом исследовании реакция полностью отсутствовала во всех клетках.
Распространенное и интенсивное окрашивание бронхиального и альвеолярного эпителия обнаружено у 1 умершего в межэпидемический период, а также у 4 из 6 умерших, по которым по вышеописанным причинам отсутствовала клиническая информация. У последних также выявлена позитивная реакция в макрофагах. Один из этих пациентов, госпитализированный в плановом порядке для оперативного лечения опухоли головного мозга, умер внезапно от острой коронарной недостаточности при отсутствии клинической картины ОРВИ и танатогенетически значимой пневмонии. В этом случае распространенная интенсивная реакция выявлена в бронхиальном эпителии и макрофагах, локализованных в стенках альвеол.
В контрольных группах позитивную иммуногистохимическую реакцию демонстрировали макрофаги, локализованные преимущественно в интерстиции альвеол: в первой подгруппе (умершие в эпидемический период) в 5 (62,5%) случаях из 8, во второй подгруппе (умершие во внеэпидемический период) в 6 (50%) случаях из 12, при этом позитивные клетки не были единичными, а их окраска оказывалась довольно интенсивной. Численность таких клеток в первой подгруппе оценена на 2+ в двух случаях, во второй — в трех, интенсивность соответственно в четырех и в трех случаях. Во второй подгруппе также в одном случае отмечалась окраска бронхиального эпителия, еще в одном наблюдении окраска была сомнительной. Окрашенные макрофаги не демонстрировали цитопатических изменений. Позитивной реакции со стороны других типов клеток не было выявлено.
Установлено, что в лабораторно подтвержденных случаях нуклеопротеин вируса гриппа закономерно обнаруживается иммуногистохимическим методом в эпителии бронхов, бронхиальных желез и альвеол, в эндотелии кровеносных сосудов, а также в макрофагах [17—20]. Гистологически в легких при этом может наблюдаться картина диффузного повреждения альвеол, пневмонии, бронхиолита. При электронно-микроскопическом исследовании в пораженных клетках выявляются ультраструктурные изменения, а также признаки репликации вируса.
Считается, что репликация вируса гриппа у людей в паренхиме легких происходит только в бронхиолярном эпителии и альвеолоцитах 1-го и 2-го типа [21], но не в макрофагах [22]. Легочные макрофаги, нейтрофилы, а также антитела играют ключевую роль в элиминации вируса из организма [22, 23]. На поздних сроках заболевания из ткани легких не выделяются полноценные вирусы, но возможно выявление вирусных антигенов [24]. Точная природа этого феномена неизвестна. В эксперименте на мышах РНК вируса выявлялась в альвеолярных макрофагах через 5 мес после острой инфекции, что свидетельствует о возможности длительной персистенции вируса в клетках системы мононуклеарных фагоцитов [25]. При помощи радиоиммунологического анализа антиген вируса гриппа был выявлен в легких мышей через 120 сут после заражения, тогда как вирус не выделялся из тех же образцов позже 10-х суток [24]. Сходная ситуация складывается и при многих внелегочных поражениях [5].
В проведенном нами исследовании в опытной группе нуклеопротеин вируса гриппа был выявлен при помощи иммуногистохимического исследования в клетках бронхиального эпителия в половине наблюдений, в альвеолоцитах в 30% случаев (как при наличии признаков бактериальной инфекции, так и без нее), что указывает на роль вируса в этиологии пневмоний в исследованных случаях. Окраска альвеолоцитов закономерно сочеталась с окраской бронхиального эпителия. Показательно, что позитивная иммуногистохимическая реакция наблюдалась только в эпителиальных клетках с признаками цитопатических изменений, что подтверждает их диагностическую значимость и подчеркивает важность гистологического исследования для посмертной диагностики гриппа. Интенсивная позитивная реакция в эпителии бронхов и альвеол у умершего во внеэпидемический период не явилась неожиданной, поскольку у него имелись клинические признаки ОРВИ с прогрессирующей дыхательной недостаточностью, а также морфологическая картина организующейся вирусной пневмонии с ярко выраженными проявлениями цитопатического эффекта, характерного для гриппа. По результатам иммуногистохимического исследования, роль вируса гриппа была вероятна в одном случае внезапной смерти взрослого пациента с ИБС. В единичных случаях отмечена позитивная иммуногистохимическая реакция клеток эндотелия кровеносных сосудов, сочетавшаяся с окрашиванием эпителия и макрофагов, что согласуется с данными литературы [17, 20]. Максимальные сроки выявления нуклеопротеина вируса с помощью иммуногистохимического анализа в макрофагах в 2 раза превышали таковые для эпителиальных клеток (40 дней против 22 дней). В целом из всех изученных типов клеток макрофаги демонстрировали наиболее интенсивное окрашивание.
В обеих контрольных подгруппах отмечалось значительное количество случаев с позитивной реакцией макрофагов. Частота встречаемости этих случаев оказалась примерно идентичной в обеих контрольных подгруппах и опытной группе наблюдений. Эти клетки были локализованы преимущественно в интерстиции альвеол и бронхов. Важно, что, несмотря на частую встречаемость и интенсивное окрашивание, они не демонстрировали цитопатических изменений. Позитивную реакцию в этих случаях можно объяснить персистенцией в макрофагах вируса гриппа с резко сниженной вирулентностью, что, возможно, является следствием давнего инфицирования и служит приспособительной реакцией вируса для сохранения его как вида [25]. Патогенетическое значение вируса гриппа в контрольных наблюдениях нуждается в дальнейшем изучении.
В результате проведенного клинико-морфологического исследования с использованием иммуногистохимического метода получены объективные данные, подтверждающие непосредственную роль вируса гриппа в возникновении случаев «дополнительной смертности» в эпидемический период, обусловленной в основном пневмониями. Также показана принципиальная возможность летального исхода при межэпидемическом гриппе, в диагностике которого тщательное морфологическое исследование приобретает особое значение.
Ряд вопросов патогенеза гриппозной инфекции, особенно при ее хроническом течении, нуждается в дальнейшем изучении.
Конфликт интересов отсутствует.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: В.А.Ц., В.В.З.
Сбор и обработка материалов: С.А.Г. , А.А.Ш., С.В.Б.
Статистическая обработка: С.А.Г.
Написание текста: С.А.Г.
Редактирование: В.А.Ц., В.В.З.