В настоящее время заболеваемость серозной карциномой яичника (СКЯ) остается очень высокой, занимая среди злокачественных заболеваний у женщин 10-е место в России и 8-е место в Западных странах. Также высокой является и смертность от данной патологии — 4-е место в России и 1-е место в Западных странах среди причин смерти у женщин [1, 2]. Кроме того, большинство СКЯ диагностируется на поздних стадиях, поэтому методы разработки ранней диагностики этой опухоли являются приоритетными в области онкологии и онкоморфологии. В последние годы представление о патогенезе злокачественных эпителиальных опухолей яичника и СКЯ в частности претерпели существенные изменения. Ранее в качестве основного источника развития всех эпителиальных опухолей яичника рассматривался поверхностный эпителий яичника. Однако проведенные в последнее десятилетие морфологические, иммуногистохимические (ИГХ) и генетические исследования убедительно показали, что наиболее вероятно происхождение по крайней мере части СКЯ из серозных трубных интраэпителиальных карцином (СТИК) маточной трубы. Источники развития других карцином яичника, как полагают многие зарубежные авторы, также лежат за его пределами (кишечный эпителий — для муцинозных карцином, эндометрий — для эндометриоидных, переходно-клеточный эпителий узелков Вальтхарда — для злокачественных опухолей Бреннера) [3]. Таким образом, именно СТИК и ее предшественники оказались в центре внимания патологов по всему миру, поскольку всестороннее исследование данных поражений могло бы помочь в разработке методов ранней диагностики и профилактики СКЯ, которые среди карцином яичника встречаются наиболее часто. Следует отметить, что в более ранних исследованиях частота возникновения СТИК оценивалась только по срезам, окрашенным гематоксилином и эозином, что приводило к низкой воспроизводимости диагноза [4]. Однако после разработки диагностического алгоритма с использованием ИГХ-маркеров р53 и Ki-67 достоверность оценки встречаемости СТИК значительно улучшилась [5, 6]. Именно поэтому в настоящем исследовании применен алгоритм, в соответствии с которым выделяют поражения, получившие названия «p53-signature», серозное трубное интраэпителиальное поражение (СТИП, serous tubal intraepithelial lesion), СТИК [6].

Так называемая «р53-signature» представляет собой участок из 12 секреторных клеток и более, в которых отмечаются снижение экспрессии PAX2, выраженная экспрессия р53 и низкая экспрессия Ki-67 в отсутствие гистологических изменений эпителия. СТИП является промежуточным поражением между р53-signature и СТИК: р53-signature отличаются от СТИП отсутствием каких-либо морфологических признаков атипии/неоплазии эпителия маточной трубы и низким пролиферативным индексом, в то же время для СТИП нехарактерно наличие столь выраженных морфологических проявлений атипии трубного эпителия, как для СТИК. Для СТИК характерны такие морфологические признаки, как увеличение ядра, гиперхромазия, неравномерно распределенный хроматин, выраженные ядрышки, митотическая активность, признаки апоптоза, потеря полярности и скученность эпителиальных клеток. Кроме того, для СТИК характерна аномальная экспрессия р53 и высокая экспрессия Ki-67 [5, 6].

Помимо данных поражений, в настоящее время выделяют еще одно, возникающее, как полагают, на самых ранних этапах развития интраэпителиальных поражений маточной трубы: разрастание секреторных клеток (РСК, англ. Secretory cells outgrowth, SCOUT) [7, 8]. Для РСК характерны участки, состоящие не менее чем из 30 последовательно расположенных секреторных клеток, при этом отмечается выраженная экспрессия Bcl-2 и PAX8, а также утрата экспрессии PAX2 [9]. В отличие от р53-signature в области РСК не отмечается повышенной экспрессии р53, объединяет эти два поражения отсутствие изменения фенотипа клеток. В нашем исследовании ИГХ-подтверждение РСК проведено с помощью маркера PAX2, поскольку накоплен наибольший опыт использования именно антитела к данному фактору транскрипции для выявления этого поражения, что позволяет провести сравнительный анализ наших результатов с результатами других авторов [7, 8].

Таким образом, цель нашего исследования — изучить частоту возникновения интраэпителиальных поражений маточной трубы при эпителиальных опухолях яичника и высказать предположение об их патогенетической связи с определенным гистотипом опухоли яичника.

В исследование включены 136 пациенток: 116 с серозными опухолями яичника (СКЯ высокой степени злокачественности (низкодифференцированные, англ. high-grade serous carcinoma) у 20 пациенток, серозные пограничные опухоли у 66, серозные цистаденомы у 30) и 20 пациенток с несерозными карциномами яичника (муцинозные пограничные опухоли у 4, муцинозные карциномы у 6, эндометриоидные карциномы у 4, светлоклеточные карциномы у 3, злокачественные опухоли Бреннера у 3). Все пациентки прооперированы в НЦАГиП им. В.И. Кулакова. Проведены такие оперативные вмешательства, как удаление придатков с одной стороны (в том числе с биопсией контралатерального яичника и резекцией большого сальника) у 62 пациенток, удаление придатков матки с обеих сторон у 10, пангистерэктомия с удалением сальника и биопсией брюшины у 64. Средний возраст пациенток с СКЯ составил 63 года (от 35 до 79 лет), с серозными пограничными опухолями — 51 год (от 32 до 59 лет), с серозными цистаденомами — 55 лет (от 28 до 75 лет), пациенток с муцинозными пограничными опухолями — 54 года (от 44 до 63 лет), муцинозными карциномами — 61 год (от 59 до 67 лет), эндометриоидными карциномами — 52 года (от 39 до 59 лет), светлоклеточными карциномами — 52 года (от 45 до 60 лет), злокачественными опухолями Бреннера — 49 лет (45—56 лет).

Для морфологического исследования отобраны все доступные срезы маточных труб пациенток, включенных в исследование (от 1 до 18 фрагментов маточных труб), при этом тотально (по SEE-FIM протоколу [10]) исследованы маточные трубы 86 пациенток с серозными пограничными опухолями яичника и СКЯ, при другой патологии у 50 пациенток обязательно исследовали фимбриальный отдел маточной трубы.

Для ИГХ-исследования отобрана часть случаев из каждой группы, включающая наиболее репрезентативные участки трубного эпителия. Для проведения данной части работы готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и сушили при температуре 37 °C в течение 18 ч. После снятия парафина со срезов их регидратировали в батарее спиртов 95°, 80° 70°, инкубируя в каждом растворе по 2 мин. Восстановление антигенной активности проводили в PT Link («Dako») при температуре 97 °C в течение 20 мин в 10 мМ цитратном буфере; рН 6,0. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 мин в 3% растворе перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. Реакцию с первичными антителами проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. В исследовании использовали моноклональные антитела к p53 (RTU, clone D0−7, «Dako», Дания), к Ki-67 (RTU, clone MIB-1, «Dako», Дания) и поликлональные антитела к PAX2 (разведение 1:10, Cell Marque). В качестве вторичных антител использовали систему Dako REAL EnVision («Dako», Дания). Для визуализации мест связывания антител с антигенами использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием водонерастворимого конечного продукта коричневого цвета. Для правильной постановки ИГХ-реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергали стандартной процедуре ИГХ-реакции, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы-производителя (препараты миндалины для Ki-67, рака молочной железы для р53, ткани почки для PAX2). После проведения ИГХ-реакций срезы контрастировали гематоксилином и заключали в синтетическую среду Shandon mount TM (США). Оценку результатов ИГХ-реакций осуществляли следующим образом: экспрессию Ki-67 подсчитывали в процентах на 3000 клеток одного типа, экспрессию р53 и PAX2 считали положительной, если ядра клеток окрашивались умеренно и сильно, PAX2-негативные участки диагностировали при утрате ядерной экспрессии маркера, при этом экспрессия его в цитоплазме могла сохраняться. Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна—Уитни (для сравнения экспрессии PAX2 при различных опухолях яичника) и критерия χ2 (для сравнения частоты возникновения интраэпителиальных поражений при опухолях яичника).

Оценку интраэпителиальных поражений маточной трубы проводили с помощью алгоритма, предложенного R. Vang и соавт. [6]. В соответствии с этим алгоритмом при морфологической оценке срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, выделяют следующие изменения: а) соответствующие СТИК (имеющие большинство признаков СТИК: увеличение ядра, гиперхромазия, неравномерно распределенный хроматин, выраженные ядрышки, митотическая активность, признаки апоптоза, потеря полярности и скученность эпителиальных клеток) в 12 и более подряд расположенных эпителиоцитах; б) подозрительные в отношении СТИК (имеющие часть признаков СТИК); в) неподозрительные в отношении СТИК (имеющие минимальные изменения эпителиоцитов, не позволяющие отнести их к предыдущим двум категориям). После морфологической оценки по данному алгоритму проводится ИГХ-оценка срезов: для верификации аномальной экспрессии р53 необходима умеренная или высокая экспрессия данного маркера более чем в 75% клеток пораженной области, высокая экспрессия Ki-67 диагностируется при выявлении положительного окрашивания ядер более чем в 10% клеток в зоне поражения.

При морфологических изменениях, соответствующих СТИК, после ИГХ-оценки выделяли: СТИК (при аномальной экспрессии р53 и высокой экспрессии Ki-67), СТИП (при аномальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67; нормальной экспрессии р53 (слабое окрашивание ядер клеток или цитоплазматическое окрашивание) и высокой экспрессии Ki-67; нормальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67).

При морфологических изменениях, подозрительных в отношении СТИК, после ИГХ-оценки выделяли: СТИК (при аномальной экспрессии р53 и высокой экспрессии Ki-67 (рис. 1, а—в)), СТИП (при аномальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67; нормальной экспрессии р53 и высокой экспрессии Ki-67 (см. рис. 1, г—е)), нормальный трубный эпителий или его реактивные изменения (при нормальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67).

При морфологической картине, не соответствующей СТИК, после ИГХ-оценки выделяли: СТИП (при аномальной экспрессии р53 и высокой экспрессии Ki-67), р53-signature (при аномальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67 (см. рис. 1, ж—и)), нормальный трубный эпителий или его реактивные изменения (при нормальной экспрессии р53 и высокой экспрессии Ki-67, при нормальной экспрессии р53 и низкой экспрессии Ki-67).

Следует отметить, что точные морфологические критерии, отличающие СТИП от СТИК в алгоритме R. Vang и соавт. [6], а также в исследованиях других ученых [11] не описаны, поэтому данный аспект требует дальнейшего изучения и доработки. В нашем исследовании к «подозрительным в отношении СТИК» поражениям относились те, что имели 2 критерия СТИК и более (как и в исследовании S. Munakata [12]).

После проведения морфологического исследования поражения, соответствующие критериям СТИК, выявлены в 14,7% случаев, подозрительные в отношении СТИК — в 25,7% случаев, не имеющие признаков СТИК, но имеющие только секреторный фенотип — в 59,6% случаев. После проведения ИГХ-исследования и применения алгоритма R. Vang и соавт. СТИК диагностирована в 10% случаев, СТИП — в 13,3%, р53-signature — в 11,7%, нормальный трубный эпителий или его реактивные изменения — в 65% случаев (см. рис. 1, а—в).

При применении морфологического метода соответствующие критериям СТИК поражения выявлены только при СКЯ, подозрительные в отношении СТИК — при СКЯ, серозных пограничных опухолях, серозных цистаденомах, муцинозных карциномах, эндометриоидных карциномах, злокачественных опухолях Бреннера, муцинозных пограничных опухолях и светлоклеточных карциномах (рис. 2, а).

После применения алгоритма R. Vang и соавт. CТИК выявлены только при СКЯ, СТИП — при СКЯ, серозных пограничных опухолях, эндометриоидной карциноме яичника, р53-signature — при СКЯ, серозных пограничных опухолях и серозных цистаденомах яичника. Таким образом, СТИК достоверно чаще встречались при СКЯ, чем при других эпителиальных опухолях яичника (р<0,05). Все трубные интраэпителиальные поражения, выделяемые в соответствии с алгоритмом R. Vang и соавт., достоверно чаще выявляли при серозных опухолях яичника, чем при несерозных карциномах яичника (p<0,05) (см. рис. 2, б). При муцинозных пограничных опухолях интраэпителиальные поражения маточной трубы не выявлено.

Среди карцином яичника также наблюдалось различное распределение трубных интраэпителиальных поражений: СТИК и р53-signature выявлены только при серозном типе карцином, СТИП — еще и при эндометриоидных карциномах, различия также были достоверно значимы (р<0,05).

К настоящему моменту выявлены многочисленные доказательства патогенетической связи дисплазии трубного эпителия и СКЯ (как наследственных, так и спорадических) [5, 13]. Однако, несмотря на большее внимание к диспластическим изменениям слизистой оболочки маточной трубы, воспроизводимость соответствующих диагнозов была довольно низкой (значения коэффициента воспроизводимости kappa от 0,33 до 0,5) [4, 5]. Это связано со сложностью гистологических критериев, которые в некоторых случаях являются общими для разных интраэпителиальных поражений маточных труб. Однако введение алгоритма R. Vang и соавт. с использованием ИГХ-маркеров р53 и Ki-67 позволило повысить коэффициент воспроизводимости до 0,67 [6], что послужило основанием для использования данного алгоритма в нашей работе. Таким образом, был выявлен значительно бо́льший процент случаев, соответствующих критериям СТИК и подозрительных в отношении СТИК, чем случаев СТИП и СТИК, подтвержденных ИГХ-методом (40,4 и 23,3% соответственно). Полученные показатели также свидетельствуют о сложности постановки диагноза интраэпителиальных поражений на основании только срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и подтверждают необходимость применения дополнительных методов исследования.

Относительно частоты возникновения СТИК среди карцином яичника получены данные, согласующиеся с опубликованными ранее: среди пациенток, включенных в исследование, СТИК выявлены только при СКЯ (в 30%). S. Tang и соавт. и S. Munakata и соавт. выявили наличие СТИК в маточных трубах пациенток с СКЯ в 19 и 20% случаев соответственно [12, 14]. Очень близкие к полученным нами были продемонстрированы данные исследования Н.В. Даниловой и соавт. (30%) [15]. Хотя в этом исследовании алгоритм R. Vang и соавт. не применялся, однако в работе принимали участие патологи с большим опытом, в том числе и в области гинекологии, что может объяснить выявленный ими достаточно высокий процент СТИК. D. Maeda и соавт. и C. Przybycin и соавт. выявили СТИК в 47 и 59% исследованных СКЯ соответственно, причем в этих работах, так же как и в нашей, СТИК не были выявлены ни при одном гистотипе карцином яичника, кроме серозного [16, 17]. Более высокий процент выявляемости СТИК в нашем исследовании по сравнению с данными S. Tang и S. Munakata можно объяснить большей долей случаев, включающих исследование фимбриального отдела маточных труб, в нашей работе. С другой стороны, небольшое число наблюдений и включение в исследование только спорадических случаев СКЯ могли стать причиной более низких показателей частоты возникновения СТИК, чем в исследованиях D. Maeda и соавт. и C. Przybycin и соавт. Различия в частоте встречаемости СТИК в нашем исследовании были достоверно значимы как среди серозных опухолей различной степени злокачественности (p<0,05), так среди карцином яичника разных гистотипов (р<0,05).

Что касается других интраэпителиальных поражений маточной трубы, исследованных в нашей работе, — СТИП и p53-signature, то и в отношении этих поражений отмечена более высокая частота возникновения среди серозных опухолей. При этом СТИП выявлялось чаще при СКЯ, чем при серозных пограничных опухолях, а при серозных пограничных опухолях — чаще, чем при серозных цистаденомах, однако достоверно значимых различий в отношении данного поражения среди серозных опухолей выявлено не было (p>0,05). Схожую закономерность определили и S. Munakata и соавт. [12]. p53-signature выявлена в нашей работе только при серозных опухолях, причем при СКЯ частота возникновения р53-signature была ниже, чем при пограничных серозных опухолях и серозных цистаденомах, однако достоверных различий также не выявлено (p>0,05). В исследованиях S. Munakata и соавт. р53-signature диагностированы при серозных аденомах, муцинозных и эндометриоидных карциномах, четкой связи со степенью злокачественности и гистотипом опухоли авторы не обнаружили. В работе K. Leonhardt и соавт. [18] при серозных пограничных опухолях интраэпителиальных поражений вообще выявлено не было. Данные результаты свидетельствуют о том, что для уточнения роли таких интраэпителиальных поражений, как СТИП и p53-signature, необходимы совместное проведение молекулярно-генетического и ИГХ-исследований, а также большее число наблюдений.

Отдельно от исследования трубных интраэпителиальных поражений, отраженных в алгоритме R. Vang и соавт., провели морфологическое и иммуногистохимическое (с использованием маркера PAX2) исследования РСК. Морфологическим методом РСК выявлены в 90% случаев СКЯ, в 74,2% серозных пограничных опухолей и в 56,7% случаев серозных цистаденом (см. рис. 1, к). При этом различия во встречаемости РСК между серозными опухолями разной степени злокачественности были достоверно значимы (p<0,05). Среди маточных труб пациенток с несерозными опухолями РСК отмечались в 20% случаев, при этом РСК выявлены при муцинозной и эндометриоидной карциноме яичника, а также при злокачественной опухоли Бреннера.

Для ИГХ-исследования отобрана часть случаев наиболее репрезентативных в отношении РСК для выявления так называемых PAX2-негативных РСК (см. рис. 1, л). Утрата PAX2 отмечалась в 75% случаев при СКЯ, в 60% при серозных пограничных опухолях, в 40% при серозных цистаденомах яичника, в 15% при несерозных карциномах яичника. Достоверных различий во встречаемости РСК между пациентками с вариантами несерозных опухолей яичника выявлено не было. При этом выявлены достоверные различия между встречаемостью РСК при серозных опухолях яичника и несерозных карциномах, а также при СКЯ и несерозных карциномах яичника как до, так и после ИГХ-исследования (p<0,05).

Следует отметить, что варианты РСК в настоящее время изучены недостаточно. Известно, что в трубном эпителии преобладает два основных типа клеток — секреторные и реснитчатые. Кроме того, высказано мнение о том, что существует особый вид секреторных клеток (peg cell), которые являются прогениторными и могут дифференцироваться как в реснитчатые, так и в секреторные клетки [19]. Секреторные и реснитчатые клетки могут быть организованы в группы из одного типа клеток, прерываемые клетками другого типа, что является вариантом нормы. Однако непрерывные цепочки секреторных клеток (не менее 30) рассматриваются как патологическое изменение эпителия и получили названия РСК [7, 8]. В то же время роль более коротких разрастаний секреторных клеток (менее 30 клеток) в патогенезе трубных интраэпителиальных поражений неизвестна. Также не исследовался вопрос о роли тех РСК, которые не утрачивают экспрессию PAX2 (являются ли они предшественниками PAX2-негативных РСК или их роль эквивалентна). С точки зрения нарушений на молекулярном уровне для РСК могут быть характерны изменения экспрессии PAX8 и PAX2 (члены семейства PAX2-генов, кодирующих факторы транскрипции, PAX1—PAX9). Однако изменения экспрессии γ-H2AX (маркер нарушения репарации ДНК) и р53 (супрессор опухолевого роста), которые характерны для р53-signature, при РСК не наблюдаются [9]. В нашем исследовании как при морфологическом, так и при ИГХ-исследовании РСК в маточных трубах верифицированы с разной частотой при вариантах эпителиальных опухолей яичника. Более высокая частота возникновения РСК у пациенток с серозным гистотипом карцином яичника выявлена и в других исследованиях [7, 8]. В нашей работе РСК, верифицированные морфологически, были PAX2-негативными в 73—80% случаев, другие исследователи также сообщают о том, что большинство (но не все) РСК утрачивают экспрессию PAX2 [8]. Возможно РСК, определяемые морфологически, но являющиеся PAX2-позитивными, предшествуют появлению ИГХ-верифицированных РСК. Однако для уточнения данного вопроса необходимы дополнительные исследования, в том числе изучение экспрессии PAX8, bcl2 и др., а также генетический анализ данных поражений. При сравнении частоты возникновения РСК с p53-signature выявлено, что как РСК, так и р53-signature преобладают при опухолях с серозным гистотипом, при этом частота возникновения р53-signature существенно выше, чем РСК (при СКЯ в 6 раз, при серозных пограничных опухолях в 3 раза, при серозных цистаденомах в 2 раза). Данное наблюдение позволяет предположить, что РСК и p53-signature являются разными этапами развития единого патологического процесса и предшествуют возникновению более тяжелых интраэпителиальных поражений (СТИП и СТИК). Отдельно следует подчеркнуть, что в наше исследование включены только СКЯ высокой степени злокачественности, которые, как полагают, имеют патогенез, отличный от СКЯ низкой степени злокачественности. Для последних, как и для серозных пограничных опухолей яичника, более характерно развитие в маточной трубе так называемой папиллярной гиперплазии, которая может быть патогенетически связана с данными опухолями. Данное поражение стало для нас объектом отдельного исследования [20].

Полученные результаты подтверждают, что для более точной диагностики интраэпителиальных поражений маточной трубы необходимо применение ИГХ-исследования. Кроме того, подтверждена патогенетическая связь между СТИК и СКЯ высокой степени злокачественности и выявлены значимые различия во встречаемости других интраэпителиальных поражений маточной трубы при серозных цистаденомах, пограничных опухолях и СКЯ, а также при различных карциномах яичника. Поражения, являющиеся, как полагают, предшественниками развития СТИК (СТИП, р53-signature, РСК), достоверно чаще выявлялись при серозных опухолях яичника, их развитие прямо пропорционально зависело от злокачественного потенциала серозной опухоли. Данное наблюдение позволяет предположить, что наиболее ранним этапом в патогенезе СКЯ является развитие РСК, далее образуются р53-signature, которые в дальнейшем могут дать начало развитию СТИП и, наконец, СТИК (при приобретении дополнительных мутаций). Однако это лишь один из возможных сценариев патогенеза, так как СТИК выявлялись только при СКЯ, в то время как ее предполагаемые предшественники обнаружены и при других серозных опухолях яичника. Таким образом, требуется дальнейшее изучение триггерных факторов развития промежуточных поражений слизистой оболочки маточной трубы и их возможной роли не только в патогенезе СКЯ высокой степени злокачественности, но в развитии серозных пограничных опухолей и СКЯ низкой степени злокачественности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.В.А., Л.С.Е., Н.М.Ф, М.В.С.

Сбор и обработка материала: А.В.А., Н.М.Ф. Г. Н.Х.

Статистическая обработка данных: А.В.А., М.В.С.

Написание текста: А.В.А., Н.М.Ф.

Редактирование: Л.С.Е., Г. Н.Х.

Конфликт интересов отсутствует.