В настоящее время известно, что существует несколько альтернативных механизмов канцерогенеза рака толстой кишки. Во всех из них накапливается все больше данных о главной роли стволовых раковых клеток. Основная сложность при исследовании данной популяции клеток состоит в том, что она малочисленная и трудно идентифицируемая, а кроме того, вероятно, является нестабильной с возможным переходом в другие популяции клеток и обратно.

Известными прогностическими факторами выживаемости являются стадия заболевания, дифференцировка опухоли, инвазия сосудов, параканкрозное воспаление, микросателлитная нестабильность и др. [1, 2]. В настоящее время накоплен достаточно большой опыт по определению пролиферативной активности при помощи иммуногистохимического исследования белка Ki-67 [3—5], экспрессии генов неспаренных нуклеотидов ДНК (MSH2, MSH6, MLH1, PMS2) [6, 7]. Все больше работ посвящено выявлению стволовых раковых клеток при помощи различных маркеров: CD133, CD24, LGR5, ALDH1 [1, 8, 9]. Однако до сих пор не сделаны выводы о влиянии этих маркеров и их сочетаний на показатели выживаемости больных раком толстой кишки. Кроме того, в литературе нет работ по изучению специфических факторов, определяющих потенциал метастазирования при раке толстой кишки, в то время как при других локализациях уже показано значение рецепторов к хемокинам (в частности, CXCR4) [10, 11].

Многие факторы, которые можно исследовать иммуногистохимическим способом, рассматривают не только с точки зрения прогностического значения, но и предиктивного (как факторы, предсказывающие эффективность противоопухолевого лечения). К таким маркерам относят: тимидилат синтазу (TS), тимидин фоcфорилазу, дигидропиримидин дегидрогеназу (DYPD), ERCC-1, III-класс-бета-тубулина, топоизомеразу-II-альфа, Ki-67 [12—15]. Какие из этих маркеров или их сочетания могут определять эффективность предстоящей стандартной химиотерапии (FOLFOX, FOLFIRI, де Грамонт), остается неясным.

Таким образом, определение предиктивного и прогностического значения имеющихся факторов, их сочетаний, а также поиск новых маркеров являются актуальной проблемой.

Были обследованы 582 больных раком толстой кишки I—II (205 пациентов) и IV (377) стадий, средний возраст составил 57,6 года. Проведено иммуногистохимическое исследование аденокарциномы толстой кишки. Изучали рецепторы к хемокинам CCR10 (ab30718, «Аbcam»), CXCR4 (ab58176, «Аbcam»), маркер стволовых клеток (ALDH1, EP1932Y, «Epitomics»), пролиферативную активность (Ki-67, MIB-1, «DAKO»). Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартной методике с использованием системы визуализации DAKO Real EnVision в случае монохромного исследования и DBS Montage Multiplex System с пероксидазной меткой и диаминобензидином к мышиным антителам, щелочной фосфатазой с хромогеном красным, прочным к кроличьим антителам в исследованиях с двойной меткой. У пациентов при II стадии прослежен 5-летний период и оценена безрецидивная выживаемость в зависимости от изученных прогностических факторов. У больных при IV стадии исследовали как прогностические, так и предиктивные факторы. Последние включали Ki-67 (MIB1, «DAKO»), топоизомеразу-II-альфа (Ki-S1, «Thermo Scientific»), III-класс-бета-тубулина (EP1569Y, «Epitomics»), TS (Sc-33679, «Santa Cruz»), TP (P-GF.44C, «Thermo Scientific»), DYPD (ab54797, «Аbcam»), ERCC1 (PDM 151, «DBS»). Исследовали частоту объективного ответа, время до прогрессирования у 104 больных раком ободочной кишки IV стадии, получавших 5-фтор-пиримидин-содержащую химиотерапию. Полученные показатели сопоставляли с результатами иммуногистохимического исследования предиктивных маркеров. Кроме того, экспрессию всех изученных маркеров сопоставляли у больных раком ободочной кишки II и IV стадии с целью оценки прогностического их значения для распространенности процесса. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли при помощи метода множественной регрессии и хи-квадрата (χ²).

Для идентификации стволовых клеток мы выбрали альдегиддегидрогеназу 1 (ALDH1), потому что выработка этого фермента является одним из основных свойств стволовой клетки. Для формирования опухоли в экспериментальных условиях требуется минимальное количество ALDH1-позитивных клеток относительно всех изученных маркеров [16, 17].

При оценке экспрессии ALDH1 в аденокарциноме толстой кишки выявлена широкая вариабельность частоты позитивных раковых клеток (от 1 до 80%) с парадоксальным субтотальным окрашиванием некоторых раковых комплексов, интенсивность окраски также варьировала. Кроме того, количество позитивных на ALDH1 клеток было неравномерным в пределах одной опухоли. Так, в некоторых раковых железах процент позитивных клеток мог достигать 50 и более, в то время как в рядом лежащих комплексах выявляли единичные позитивные клетки.

Для изучения пролиферации стволовых клеток использована методика двойного иммуногистохимического окрашивания. Вначале оценена экспрессия в нормальной слизистой оболочке толстой кишки. Выявлено значительное отличие в пролиферативной активности ALDH1-позитивных и негативных клеток (p<0,001). Нормальные стволовые тканекоммитированные клетки практически не пролиферировали. При исследовании с использованием аналогичной методики раковых комплексов все 20 случаев показали значительное различие в пролиферации стволовых раковых клеток (0,1—10%) и общей клеточной популяции (30—90%; р<0,001). В среднем пролиферация стволовых раковых клеток не превышала 10% всей популяции пролиферирующих клеток (рис. 1).

В нашем исследовании изучили экспрессию двух основных рецепторов к хемокинам: CCR10 и CXCR4. Экспрессия CXCR4 выявлена в 77% случаев рака толстой кишки с широкой вариабельностью частоты позитивных клеток (от 10 до 90%, рис. 2).

Экспрессия CCR10 не выявлена ни в одном случае аденокарциномы толстой кишки. В слизистой оболочке толстой кишки коричневое окрашивание CXCR4 (хромогендиаминобензидин) выявлялось в виде 1—5 гранул, расположенных над нуклеолеммой, обращенной в сторону просвета кишки. Причем наиболее выраженная экспрессия отмечалась в средних отделах и ослабевала к поверхностной и глубокой частям крипт.

Таким образом, исходя из полученных данных, клеточный состав опухоли условно можно разделить на 4 популяции: 1) стволовые непролиферирующие (ALDH1+, Ki-67–); 2) стволовые пролиферирующие (ALDH1+, Ki-67+); 3) амплифицирующиеся (ALDH1–; Ki-67+); 4) дифференцирующиеся (ALDH1–; Ki-67–). Соотношение данных популяций в среднем составляет 9:1:60:30. Преобладающей популяцией являются амплифицирующиеся клетки (медиана 60%), а наименьшей — пролиферирующие стволовые раковые (медиана 1%). Кроме того, мы определили, что часть клеток имеет экспрессию рецептора хемокина CXCR4, который в литературе при изучении других локализаций показывал связь с развитием метастазов [18, 19].

Для изучения связи пролиферативной активности опухоли со стадией мы проанализировали уровень пролиферации, измеренный по индексу Ki-67, при диссеминированной (IV стадия) и локализованной (I—II стадия) формах. Для этого мы выделили 4 интервала: Ki-67 менее 30%, 30—50%, 50—70%, более 70%.

Для статистической оценки связи пролиферативной активности опухоли с ее распространенностью мы взяли крайние интервалы пролиферативной активности. Как видно из табл. 1, имеется значительное различие частоты случаев с относительно низким (30% и менее) и высоким (более 70%) уровнями пролиферации опухоли группы с локализованным раком. В случае диссеминированного рака это различие мало выражено. Таким образом, выявлена статистически значимая обратная корреляция между индексом Ki-67 и распространенностью опухоли толстой кишки (р=0,0019).

При оценке связи пролиферативной активности опухоли с безрецидивной выживаемостью пациентов при II стадии опухоли после радикального хирургического лечения с последующим выявленным прогрессированием заболевания медиана безрецидивной выживаемости с низким индексом Ki-67 (менее 30%) составила 7 мес по сравнению с 11 мес при высоким индексе Ki-67 (более 70%).

В группе пациентов с диссеминированным раком (IV стадия) в 28 (90%) из 31 случая была позитивная реакция на CXCR4. Ее уровень варьировал от 10 до 90%. При II стадии опухоли также преобладала позитивная реакция на CXCR4, но число случаев без экспрессии рецептора к хемокину было значительно больше по сравнению с 1-й группой (41 и 10% соответственно). Таким образом, негативная реакция на CXCR4 статистически значимо коррелирует с локализованным раком толстой кишки (р=0,0196).

При изучении экспрессии CXCR4 при II стадии опухоли после радикального хирургического лечения в зависимости от развития прогрессирования заболевания в течение 5 лет оказалось, что в 68% случаев с позитивной реакцией на CXCR4 заболевание прогрессирует, а у 75% пациентов с негативным статусом CXCR4 наблюдается 5-летний безрецидивный период (p=0,02, табл. 2). При оценке влияния экспрессии CXCR4 в группе при II стадии, где произошло прогрессирование заболевания, оказалось, что медиана выживаемости у больных с высоким CXCR4 (более 70%) составляет 8 мес против 11 мес при низком CXCR4 (менее 30%).

В наших исследованиях мы не выявили корреляции между экспрессией ALDH1 и распространенностью рака толстой кишки, а также с безрецидивной выживаемостью больных при II стадии. Вероятно, простое увеличение стволовых раковых клеток еще не приводит к усилению метастатической активности опухоли, а для этого должен произойти ряд дополнительных событий, таких как увеличение экспрессии рецепторов хемокинов и др. [20].

Все это заставило нас оценить совокупное влияние экспрессии хемокиновых рецепторов и пролиферативной активности опухоли на безрецидивную выживаемость больных при II стадии после радикального хирургического лечения, у которых наблюдалось прогрессирование заболевания. В целом повышение экспрессии CXCR4 сопровождалось снижением пролиферативной активности. Несмотря на то что обратная корреляция между CXCR4 и Ki-67 была статистически недостоверной (p=0,06), в нашем исследовании не было наблюдений c синхронно высокими или низкими CXCR4 и Ki-67 (табл. 3).

Как видно из табл. 3, синхронное снижение экспрессии CXCR4 и увеличение Ki-67 приводит к большей безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки II стадии после радикального хирургического лечения. Медиана безрецидивной выживаемости с высоким CXCR4 (более 70%) и низким Ki-67 (менее 30%) составила 16,5 мес, а с низким CXCR4 (менее 30%) и высоким Ki-67 (более 70%) — 7 мес. При оценке влияния совокупности факторов с использованием метода множественной регрессии снижение экспрессии CXCR4 вместе с увеличением Ki-67 статистически значимо улучшало безрецидивную выживаемость (p<0,05). Таких закономерностей не было выявлено при изучении маркера стволовых клеток ALDH1.

Во второй части исследования мы оценили частоту объективного ответа и время до прогрессирования при стандартной химиотерапии (FOLFOX, FOLFRI, де Грамонт) у больных диссеминированным раком толстой кишки с учетом значения экспрессии маркеров (TS, TP, DYPD, ERCC-1, III-класс-бета-тубулина, топоизомеразы-II-альфа, Ki-67). Для этого проведено обследование 104 больных раком ободочной кишки IV стадии.

При исследовании влияния экспрессии анализируемых маркеров на время до прогрессирования заболевания выявлена связь показателей при анализе TS (р=0,0036) и TP (p=0,0058) (табл. 4). При оценке влияния экспрессии маркеров на частоту объективного ответа (полный и частичный регресс) результаты были схожие. Частота объективного ответа при наличии экспрессии TP и отсутствии TS составила 39%, при обратном сочетании (экспрессия TS и отсутствие TP) — 13% (р=0,04).

Таким образом, иммуногистохимическое исследование TS, TP может быть использовано в оценке эффективности химиотерапии пациентов с раком толстой кишки, получающих препараты, содержащие 5-фторпиримидин.

Рак толстой кишки II стадии остается камнем преткновения у врачей-онкологов. В нашем исследовании мы выделили две различные по прогнозу группы пациентов. Так, больным при II стадии рака толстой кишки с высоким индексом Ki-67 и низкой экспрессией CXCR4, вероятно, не следует назначать адъювантную химиотерапию, так как в 75% случаев после радикального хирургического лечения безрецидивный период у них превысил 5 лет. В то же время у пациентов с низким индексом Ki-67 и высокой экспрессией CXCR4 наблюдается низкая безрецидивная выживаемость и им, вероятно, требуется адъювантное лечение.

В случае необходимости проведения адъювантной химиотерапии (диссеминированная форма рака) для выбора решения об использовании 5-фторпиримидинов может быть выполнено иммуногистохимическое исследование тимидилат синтазы (TS) и тимидин фосфорилазы (TP). При условии низкой экспрессии TS и высокой TP можно предполагать лучший эффект от лечения данной группой химиопрепаратов.

Иммуногистохимическое исследование других маркеров (ALDH1, CCR10, ERCC-1, DYPD, топоизомеразы-II-альфа, III-класс-бета-тубулина) для выбора тактики лечения больных раком толстой кишки значения не имеет.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г. А.Р., Р.В.О., С.В.П.

Сбор и обработка материала: Г. А.Р., Р.В.О.

Статистическая обработка данных: Г. А.Р.

Написание текста: Г. А.Р.

Редактирование: К.М.П., Р.В.О., С.В.П.

Конфликт интересов отсутствует.