Ген рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (human epidermal growth factor receptor 2 oncogene — ERBB2, HER2, или HER2neu) кодирует одну из ключевых рецепторных тирозинкиназ, нарушения экспрессии которой играют ведущую роль в онкогенезе рака молочной железы (РМЖ) [1]. Амплификация гена HER2 является основной причиной гиперэкспрессии протеина и определяется в 15—20% случаев РМЖ [1, 2]. До появления препаратов, блокирующих рецептор HER2, его гиперэкспрессия и/или амплификация гена асссоциировались с плохим прогнозом течения заболевания, а именно с высоким риском метастазирования и низкой выживаемостью без прогрессии. Разработка и внедрение в клиническую практику таких лекарственных средств, как трастузумаб, лапатиниб, пертузумаб, драматически изменили жизнь пациенток с HER2-позитивными опухолями [3—8]. В связи с этим правильная оценка так называемого HER2-статуса опухоли является чрезвычайно важной как для клинициста, так и для больной, поскольку имеет ключевое значение для разработки тактики лечения. Традиционно основными методами определения HER2-статуса являются иммуногистохимический (ИГХ), позволяющий оценить уровень экспрессии протеина на поверхности клетки, и флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), выявляющая количество копий исследуемого гена в ядре. Оба метода являются равноценными и взаимодополняющими. Однако уже первые крупные исследования, проведенные более 10 лет назад, выявили значительные разночтения в оценке результатов как ИГХ, так и FISH, что привело к попытке стандартизации как самих методик, так и критериев их интерпретации [5, 6, 9]. В 2007 г. были опубликованы рекомендации Американского общества клинических онкологов и Коллегии американских патологов (American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists — ASCO/CAP) по оптимизации HER2-тестирования [10]. Основной целью рекомендаций было достижение максимально возможной сходности между результатами двух методик и снижение количества разночтений между разными лабораториями, работающими с ИГХ и FISH. Были разработаны критерии оценки уровня экспрессии протеина и копийности гена HER2, определены границы клинически значимой внутриопухолевой гетерогенности (ВОГ), рекомендованы определенные реагенты, показавшие на тот момент наилучшие результаты при проведении тестирования. Широкое внедрение рекомендаций ASCO/CAP 2007 в международную практику позволило достичь существенного прогресса в унификации и повышении качества HER2-тестирования [11]. Однако при ретроспективном анализе результатов крупнейших исследований с использованием рекомендаций 2007 г. было показано, что ужесточение критериев тестирования по сравнению с первоначальными критериями Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (Food and Drug Administration — FDA) может ограничивать доступ к соответствующему лечению группе больных, нуждающейся в его назначении [12, 13]. Особое внимание авторами уделялось существенному повышению порога клинически значимой ВОГ и не совсем корректной оценке так называемой полисомии 17-й хромосомы методом FISH. В связи с этим в 2013 г. появились новые рекомендации ASCO/CAP, во многом вернувшие критерии тестирования к первоначальным критериям FDA, а также добавившие в клиническую практику результаты последних исследований [14] (см. таблицу).

Учитывая, что использование новых рекомендаций предполагает очередную оптимизацию HER2-тестирования и, как следствие, улучшение выживаемости пациенток РМЖ, в нашей клинике критерии ASCO/CAP 2013 были внедрены в рутинную практику.

Целью настоящей работы явился анализ результатов использования новых рекомендаций при оценке HER2-статуса при РМЖ методом FISH.

Исследование методом FISH проводилось на фиксированном в формалине и залитом в парафин биопсийном материале 572 больных РМЖ, поступившем в лабораторию молекулярной биологии ГАУЗ МГОБ № 62 ДЗМ после предварительного ИГХ-исследования. Во всех случаях метод ИГХ показал сомнительный уровень экспрессии протеина HER2 (2+) по критериям ASCO/CAP 2007 (в 20% случаев) или ASCO/CAP 2013 (в 80% случаев). В 86% случаев материал был получен методом трепанобиопсии первичной или метастатической опухоли. Исследование проводилось только на материале удовлетворительного качества и содержащем достаточное количество опухолевой ткани, достоверно относящейся к инвазивному компоненту опухоли. Каждый образец поступал в сопровождении соответствующего гистологического препарата, окрашенного гематоксилином и эозином, и препарата, окрашенного методом ИГХ для выявления экспрессии протеина HER2.

В качестве основного метода исследования проводилась двухцветная FISH с использованием набора HER2 pharm Dx Kit («DAKO», США) по методике, предложенной производителем. Исследование дополнительных локусов для выявления сочетанной амплификации HER2 и CEP17 или возможной полисомии 17-й хромосомы проводилось с использованием флюоресцентных зондов Vysis Smith-Magenis Region Probe — LSI SMS Region SpectrumOrange/LSI RARA SpectrumGreen (Vysis, «Abbott», США).

Из поступивших препаратов приготавливались гистологические срезы толщиной 3—4 мкр, которые подвергались выдержке в термостате при температуре 56 °C, дальнейшей депарафинизации и предварительной обработке раствором тиоцианата натрия. Далее проводилась обработка материала пепсином и проведение гибридизации с флюоресцентным зондом в программируемом термостате Dako («Dako», Дания) или Thermobrite («Abbott Molecular», США) в температурном режиме, рекомендуемом производителем. По завершении гибридизации проводилась отмывка несвязавшейся пробы и окрашивание препаратов 4’, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации ядер клеток. Просмотр готовых препаратов и оценка результатов гибридизации приводились с использованием флюоресцентного микроскопа Axioimager Z2 («Karl Zeiss», Германия), изображение фиксировалось при помощи программы ISIS («Metasystems», Германия). Гибридизация считалась успешной в тех случаях, когда ядра не менее чем 80% опухолевых клеток имели непрерывные границы, уровень аутофлюоресценции позволял отчетливо различать зеленые флюоресцентные сигналы, внутри ядер выявлялись четкие сигналы красного и зеленого цветов.

Оценка результатов гибридизации проводилась согласно критериям ASCO/CAP 2007 и ASCO/CAP 2013 (см. таблицу) с целью дальнейшего проведения анализа полученных различий. Исследование образцов с ВОГ и сомнительным результатом FISH (соотношение копий HER2/CEP17 менее 2 при среднем количестве копий гена HER2 более или равно 4, но менее 6) выполнялось согласно алгоритмам, предложенным W. Hanna и соавт., и одобренным рекомендациями ASCO/CAP 2013 [14, 15] (рис. 1, 2). Сочетанная амплификация HER2 и CEP17 считалась доказанной при выявлении соотношения HER2/(RARA, SMS) более и равно 2, такие случаи квалифицировались как HER2-позитивные, в случаях с соотношением сигналов менее 2 предполагалась полисомия 17-й хромосомы.

Статистическая обработка полученных данных проводилась методом анализа таблиц сопряженности с вычислением статистик связи (с поправкой Йэйтса на непрерывность).

Проведение гибридизации in situ было успешным во всех случаях, включенных в исследование. При оценке результатов FISH по критериям ASCO/CAP 2007 113 (25%) случаев были определены как HER2-позитивные.

Оценка образцов с внутриопухолевой гетерогенностью согласно критериям ASCO/CAP 2007 и ASCO/CAP 2013

Признаки ВОГ (от 5 до 50% опухолевых клеток с признаками амплификации гена HER2 в образце) были обнаружены в 206 (36%) случаях от всей исследуемой группы. Уровень гетерогенности более 30% (клинически значимая ВОГ по критериям ASCO/CAP 2007) выявлялся в 30 (5,2%) случаях. Применение рекомендаций ASCO/CAP 2013 позволило квалифицировать еще 30 образцов с уровнем гетерогенности от 10 до 30% как HER2-позитивные (5,2%). Уточняющее исследование дополнительного образца опухоли при уровне ВОГ около 10% удалось провести у 24 пациенток. В 11 случаях (1,9% от общей группы) результаты дополнительного исследования выявили более 10% опухолевых клеток с признаками амплификации, что позволило отнести этих больных к HER2-позитивным.

Таким образом, использование новых критериев оценки ВОГ привело к увеличению числа пациенток с клинически значимой гетерогенностью, квалифицированных как HER2-позитивные, на 7,1% (с 5,2 до 12,3%), что оказалось статистически достоверным [отношение шансов (ОШ) =2,6021; 95% ДИ 1,6371— 4,1522; р=0,0005].

Оценка образцов увеличением копийности гена HER2 согласно критериям ASCO/CAP 2007 и ASCO/CAP 2013

В 113 (19,8%) случаях соотношение копий HER2/CEP17 более 2,2 позволило квалифицировать эти случаи как HER2-позитивные по критериям ASCO/CAP 2007. Применение рекомендаций ASCO/CAP 2013 (соотношение копий HER2/CEP17 более или равно 2) привело к выявлению дополнительных 12 (2%) HER2-позитивных случаев.

При исследовании образцов с соотношением копий HER2/CEP17 менее 2 в 32 случаях (5,6%) было обнаружено увеличение копийности гена HER2 более или равно 6 в клетке, что по критериям ASCO/CAP 2013 также является признаком HER2-позитивности. Кроме того, в 30 (5,2%) образцах выявлялось промежуточное увеличение копийности гена HER2 (более или равно 4, но менее 6). Согласно рекомендациям 2013 г., в этих случаях было проведено дополнительное исследование референсных генов 17-й хромосомы для выявления сочетанной амплификации HER2 и CEP17. Сочетанная амплификация была определена в 16 (2,8%) образцах.

Таким образом, применение новых рекомендаций при оценке копийности гена HER2 привело к увеличению количества HER2-позитивных пациенток со 113 (19,7%) (по критериям ASCO/CAP 2007) до 173 (30,2%) (ОШ=1,7616; 95% ДИ 1,3296—2,3348; р=0,0006). С учетом случаев с клинически значимой гетерогенностью общее количество HER2-позитивных больных в исследуемой группе возросло с 25 до 42,5% (рис. 3).

Проведенный анализ показал, что данные различия были статистически достоверными (ОШ=2,2178; 95% ДИ 1,8254—2,6950; р=0,0005).

Несмотря на то, что определение статуса HER2 при РМЖ имеет длительную историю и широко внедрено в практику, правильная трактовка результатов этого исследования по-прежнему является весьма непростой. Главной причиной этого является необычайная биологическая неоднородность РМЖ, доказанная последними исследованиями молекулярной структуры опухоли [16]. К сожалению, новые методы, позволяющие предельно точно оценить все биологические особенности каждого образца, пока недоступны для практического применения ввиду их сложности и дороговизны.

Разработка новых критериев ASCO/CAP 2013 по оценке HER2-статуса является очередной попыткой добиться максимальной клинической валидности и информативности теста, используя рутинные методы. Причиной внесенных в рекомендации изменений стала очевидная дискриминация части пациенток в результате применения критериев ASCO/CAP 2007 и лишение их возможности получать терапию препаратами, блокирующими HER2. В первую очередь это касалось больных с невысокой степенью ВОГ (от 10 до 30% HER2-позитивных клеток в образце). Доказательством необходимости назначения этим пациенткам анти-HER2-терапии стала ретроспективная оценка результатов исследования NCCTG N9831 с использованием критериев ASCO/CAP 2007 вместо примененных ранее критериев FDA, опубликованная E. Perez и соавт. в 2012 г. [12]. Оказалось, что выживаемость без прогрессирования пациенток с низкой степенью гетерогенности, получавших в адъювантном лечении химиотерапию и трастузумаб, не отличалась от таковой у больных с гетерогенностью более 30%. Несмотря на то, что разница в выживаемости внутри самой группы с ВОГ низкой степени не была статистически значимой, ввиду небольшого количества включенных случаев, около 4% больных оказались бы лишенными патогенетической терапии, если бы критерии 2007 г. применялись при проведении исследования. В ближайшее время ожидаются результаты исследования NSABP B-47, изучающего эффективность применения трастузумаба у больных, квалифицированных как HER2-негативные по критериям ASCO/CAP 2007, которое, возможно, предоставит более убедительные доказательства значения гетерогенности низкой степени.

Важными акцентами при проведении исследования являются обязательный просмотр всего препарата и подсчет сигналов в 40—60 опухолевых клетках в случае обнаружения ВОГ. Такой подход объясняется широким использованием мелких биопсий (трепанобиоптатов) для первичной оценки статуса HER2. Влияние неточного взятия материала, выборочно исследованных зон опухоли и малого количества подсчитанных клеток было показано в работах M. Brunelli и соавт. и B. Bernasconi и соавт. [17, 18]. По их результатам, от 13 до 15% образцов могут быть оценены неверно из-за ограниченности исследования. Следует особо отметить еще одну особенность оценки низкой степени ВОГ согласно новым рекомендациям: истинной генетической гетерогенностью считается обнаружение групп клеток с высокой копийностью гена HER2, в то время как единичные клетки зачастую являются артефактом, обычно вызванным механическим удалением сигналов, соответствующих CEP17 или дупликацией генетического материала в процессе митоза. В таких случаях в клетке определяется ложное соотношение сигналов HER2/CEP17 более 2 [19]. Типичный случай скопления клеток с повышенной копийностью гена HER2 представлен на рис. 4.

Применение новых критериев оценки ВОГ в нашем исследовании привело к увеличению числа HER2-позитивных пациенток на 7,1% (с 5,2 до 12,3%). Похожие результаты были получены B. Bernasconi и соавт. [18], обнаруживших 27 (10,3%) пациенток с низкой степенью ВОГ среди 262 обследованных. В 24 случаях (при обнаружении пограничного значения ВОГ) мы проводили исследование дополнительного материала. Такой подход позволил установить клинически значимую ВОГ почти в половине исследованных случаев (11 образцов), хотя обнаружение ВОГ менее 10% в исходном материале пока может игнорироваться в связи с отсутствием четких клинических данных о значении этого феномена.

Вторым, возможно даже более важным изменением в рекомендациях ASCO/CAP 2013, стал новый подход к оценке копийности гена HER2 и так называемой полисомии 17-й хромосомы при РМЖ. Полисомия определяется как наличие одной или более дополнительных копий целых хромосом в клетке и классически выявляется при кариологическом исследовании. При исследовании методом FISH суррогатом числа хромосом, как правило, являются так называемые нумерационные пробы, комплементарные последовательностям перицентромерного региона. Однако такой подход, оправданный в перинатальной диагностике, не всегда может быть применим при исследовании злокачественных опухолей, характеризующихся сложнейшими нарушениями кариотипа. По данным ряда исследований, истинная полисомия 17-й хромосомы является крайне редким событием при РМЖ; в большинстве случаев, квалифицированных как полисомные методом FISH, методами сравнительной геномной гибридизации и MPLA была показана сочетанная амплификация регионов различной длины, включающих как локус гена HER2, так и центромерный регион 17-й хромосомы [20, 21]. Данные о клиническом значении полисомии неодназначны. Анализ результатов крупнейшего исследования по применению трастузумаба в адъювантной терапии HERA показал, что пациентки с экспрессией HER2 2+/3+ и полисомией 17-й хромосомы точно также отвечали на терапию трастузумабом, как и пациентки без полисомии, но с амплификацией [22]. В связи с этим авторами новых рекомендаций было предложено в случае увеличения копийности центромерного региона ориентироваться в первую очередь на копийность гена HER2, а не на соотношение HER2/CEP17. Критерием позитивности было выбрано количество копий HER2 более или равно 6, поскольку именно такое число копий ассоциировалось с позитивной иммуногистохимической окраской в исследовании HERA [22]. В случае пограничного значения FISH (HER2 более или равно 4, но менее 6) было рекомендовано проведение дополнительного исследования нескольких генов, расположенных на разных плечах 17-й хромосомы. Оценка копийности этих генов предполагает приблизительную оценку копийности всей 17-й хромосомы. В качестве минимального объема исследования было предложено исследование генов RARA (17q21.1) и SMS (17p11.2) [15].

В нашем исследовании 32 (5,6%) случая были квалифицированы как HER2-позитивные по наличию 6 и более копий гена HER2. Кроме того, исследование дополнительных генов 17-й хромосомы в 30 сомнительных случаях позволило установить сочетанную амплификацию HER2 и центромерного региона в 16 (53,3%) из них. Похожие результаты были получены С. Tse и соавт. [23], определившими с помощью дополнительных проб сочетанную амплификацию в 58 (43,9%) из 132 исследованных образцов и разработавшими алгоритм исследования образцов с предполагаемой полисомией. Случай сомнительного увеличения копийности гена HER2 (4—5 копий на клетку) представлен на рис. 5. Дополнительное исследование генов SMS и RARA выявило нормальную копийность короткого плеча 17-й хромосомы (ген SMS) и повышенную копийность зоны на длинном плече (ген RARA) (рис. 6).

Таким образом, применение новых критериев ASCO/CAP 2013 в оценке результатов FISH привело к существенному увеличению количества HER2-позитивных больных в группе с сомнительным уровнем экспрессии протеина (с 25 до 42,5%). Реклассификация была проведена у 100 пациенток, различия оказались статистически достоверными. Подобные результаты были опубликованы М. Shah и соавт. [24], сообщившими об изменении оценки статуса HER2 с негативного на позитивный у 48 (15%) пациенток при сравнительной оценке результатов исследования 321 образца, поступивших для проведения FISH. Эта же группа проанализировала результаты исследования N9831 с использованием критериев ASCO/CAP 2013 вместо ASCO/CAP 2007. Было обнаружено, что реклассификация потребовалась относительно небольшому числу больных (80 из 3505), что не позволило выявить достоверные различия в их выживаемости в зависимости от назначения трастузумаба.

Несмотря на то что эти больные составляют небольшое число от всех пациенток, страдающих РМЖ, предоставление им возможности получить наиболее эффективную для них терапию может стать еще одним шагом в оптимизации лечения РМЖ. Окончательная оценка преимуществ и недостатков нового подхода к проведению HER2-тестирования станет возможна после получения результатов крупных проспективных клинических исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.А.Д.

Сбор и обработка материала: Е.О.Ц., М.Б.Г.

Написание статьи, статистическая обработка: И.А.Д.

Конфликт интересов отсутствует.