Амилоидоз является тяжелым патологическим процессом, который характеризуется внеклеточным отложением в органах и тканях патологического фибриллярного белка амилоида. Согласно современным представлениям, амилоидоз развивается в результате мутации генетического аппарата клеток, синтезирующих фибриллярные белки амилоида с измененными антигенными свойствами, и снижения иммунного контроля. Выделяют системный и локальный амилоидоз. Наиболее частой формой системного амилоидоза является AL-амилоидоз, включающий первичный идиопатический амилоидоз, амилоидоз при миеломной болезни, В-клеточных опухолях, плазмоцитоме, болезни Вальденстрема [1]. Полагают, что аномальный клон плазматических или В-клеток в костном мозге продуцирует амилоидогенные иммуноглобулины, представляющие легкие цепи моноклонального иммуноглобулина лямбда- и каппа-типов, обладающие амилоидогенностью [2, 3]. Некоторые аминокислоты в вариабельных участках легких цепей этих иммуноглобулинов занимают необычную позицию, что приводит к их нестабильности и склонности к фибриллогенезу. Наиболее часто встречаются I и IV субклассы лямбда-цепей и I, III, IV субкласс каппа-цепей иммуноглобулинов, что позволяет считать их наиболее амилоидогенными. Синтез амилоида осуществляют макрофаги, на поверхности которых происходит сборка амилоидных фибрилл. При этом макрофаги тесно взаимодействуют с плазмоцитами и миеломными клетками. В дальнейшем развивается преципитация амилоидных белков в тканях органов-мишеней [4, 5].

Диагностика AL-амилоидоза является сложной задачей и требует проведения комплекса лабораторно-инструментальных исследований, однако окончательный диагноз должен быть подтвержден морфологически. Для обнаружения амилоидных масс в гистологических препаратах используют окраску конго красным, являющуюся золотым стандартом для выявления амилоида. После гистологического подтверждения амилоидоза необходимо его типирование для выбора наиболее рационального метода лечения, который может включать химиотерапию или трансплантацию органа [6—8]. Сегодня известно более 30 видов амилоидных белков, вызывающих различные типы амилоидоза [9]. Наиболее точным является иммуногистохимическое типирование с использованием моноклональных антител к белкам-предшественникам амилоида [10, 11]. В отличие от других типов амилоидоза в случаях с AL-амилоидозом иммуногистохимическая диагностика вызывает определенные трудности. Считается, что каждый пациент с данным видом амилоидоза имеет индивидуальные участки аминокислот в вариабельном регионе легких цепей этих иммуноглобулинов, и, следовательно, использование стандартного набора моноклональных антител (направленных против константного региона) дает достоверный диагноз только в 40% случаев [12]. Для того чтобы облегчить иммуногистохимическую диагностику AL-амилоидоза и предотвратить ошибки в установлении его вида, целесообразно использовать синтезированные нами антитела, направленные против вариабельного и константного регионов каппа-легких цепей.

Цель данной работы — создание новых пептидных антител для улучшения иммуногистохимической диагностики AL-каппа-амилоидоза; оценка эффективности и специфичности полученных антител при помощи иммуногистохимического исследования биопсийного материала пациентов с различными типами амилоидоза.

Используя базу данных Института патологии им. Рудольфа Вирхова (Берлин, Германия) и базу данных амилоидного регистра г. Киль, исследовано 222 биоптата, полученных у 193 пациентов, из которых 105 мужчин и 85 женщин. Пол 3 пациентов был неизвестен. Пациенты обследованы в возрасте от 32 до 92 лет, средний возраст составил 65 лет.

Биоптаты для исследований взяты из 33 различных органов и тканей, среди которых сердце, печень, легкое, почки, желудок, тонкая и толстая кишка, гребень подвздошной кости и так далее. Биоптаты выбраны за период с декабря 2007 по декабрь 2010 г. из амилоидного регистра, содержащего более чем 1000 случаев с гистологически подтвержденным амилоидозом.

При помощи базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) изучали все аминокислотные цепи, соответствующие критериям поиска амилоида и каппа-легких цепей. Поиск осуществляли в декабре 2007 г. и вновь начали в январе 2009 г. Все найденные аминокислотные цепи обработаны с помощью программы Tcoffe Regular. Вторичную структуру белка анализировали по методике, описанной Паркером (1986), используя программное обеспечение Peptide Companion software (CoshiSoft/peptiSearch; San Diego, CA).

Два рекомбинантных пептида синтезированы и очищены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPCL) с чистотой 86 и 89%. Четыре новозеландских кролика были иммунизированы синтетическим пептидом согласно стандартизованному протоколу иммунизации (Pineda Antibody-Service, Берлин, Германия). Сыворотку брали на 60-й и 100-й день после иммунизации. Фракцию IgG очищали при помощи аффинной хроматографии на колонке Hi Trap Protein G HP («Amersham Biosciences AB», Фрайбург, Германия).

Все биоптаты фиксировали в формалине и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Амилоидные отложения идентифицированы при исследовании срезов, окрашенных конго красным в поляризованном свете.

Иммуногистохимические исследования проведены с использованием моноклональных антител к АА-амилоидозу (в разведении 1:600), поликлональных антител к плазменному амилоидному Р-компоненту (1:5000), фибриногену (1:2000), лизоциму (1:3000), транстиретину (1:4000), лямбда-легким цепям (1:160 000) и каппа-легким цепям (1:160 000) компании «Dako» (Гамбург). Использовали также коммерчески недоступные поликлональные антитела к аполипопротеину AI (anti-ApoAI в разведении 1:1000), лямбда-легким цепям (Anti-AL1, в разведении 1:3000), пептидные антитела к лямбда-легким цепям AL3 (1:250) и AL7 (1:500). Для иммунной окраски использовали систему Bench Mark XT и ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit («Vetana Medical Systems», Tucson/AZ, США). Для инкубации с антителами к амилоид-Р-компоненту, Anti-Apo AI, лямбда- и каппа-легким цепям, а также ATTR и AL7 срезы обработаны Cel Conditioning 1 (по протоколу производителя CC1; «Vetana») или с использованием цитрата натрия.

Окрашивание нашими новыми антителами к каппа-легким цепям (anti-AK1 (1:1500), anti-AK2 (1:1000), anti-AK3 (1:3000), anti-AK4 (1:1000)) выполнено при помощи LSAB Kit («Dako») и Super sensitive Link-Label IHC Detection System («BioGenex»).

Поиск эпитопов и генерирование антител. Используя базу данных NCBI, были изучены аминокислотные цепи, полученные у пациентов с установленным AL-каппа-амилоидозом. Всего найдено 112 аминокислотных цепей, подразделенных в базе данных NCBI на 5 субклассов. Субкласс I составил 87 аминокислотных цепей, субкласс II — 3 цепи, III и IV субклассы — по 11 цепей, субкласс V состоял из одной цепи. Для дальнейших исследований был выбран субкласс I, так как он является самым распространенным [13—25]. Все найденные аминокислотные цепи обработаны с помощью программы TCoffe Regular. На основании полученных данных составлена гипотетическая цепь из наиболее часто встречающихся аминокислотных остатков, которая состояла из вариабельного и константного регионов каппа-легких цепей.

Первый антигенный эпитоп (антигенная детерминанта) выбран из наиболее часто встречающегося участка в вариабельном регионе гипотетической цепи и соответствовал аминокислотным позициям 3—17 (QMTQSPSSLSASVGD).

Анализ константного региона 112 аминокислотных цепей пациентов с AL-каппа-амилоидозом показал, что у всех пяти субклассов он одинаков. В качестве второго эпитопа выбран участок из константного региона, соответствующий аминокислотным позициям 116—130 (FIFPPSDEQLKSGTA). Вторичную структуру белка анализировали по методике, описанной J. Parker [26].

Двух новозеландских кроликов иммунизировали с NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH, а двух других — с NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2. Успешность иммунизации протестирована методом Dot-блоттинга с использованием синтезированного пептида в качестве позитивного контроля.

Антитела, полученные от кроликов, иммунизированных в течение 100 дней, давали более яркую окраску, чем антитела, полученные после 60-дневной иммунизации, поэтому были выбраны для последующих исследований.

В результате получили четыре новых антитела. Антитела очищенной формы IgG, направленные к NH2-CQMTQSPSSLSASVGD-CONH, названы AK1 и AK2, а антитела к NH2-CFIFPPSDEQLKSGTA-CONH2 — AK3 и AK4.

Иммуногистохимически исследовано 222 биоптата, полученных у 193 пациентов с установленным амилоидозом.

Из 222 образцов биопсий 100 составляли случаи с AL-каппа-амилоидозом, 48 — с AL-лямбда-амилоидозом, 32  — с AA-амилоидозом, 39 — с транстиретиновым амилоидозом, 3 — с инсулиновым амилоидозом.

Иммуногистохимические исследования проводились нами в два этапа На первом этапе протестировали антитела AK1, AK2, AK3, AK4, используя 105 образцов, взятых у пациентов с установленным амилоидозом (рис. 1).

Из 60 случаев с AL-каппа-амилоидозом в 55 (92%) все 4 антитела были позитивными. В остальных 5 случаях одно или два антитела дали отрицательную окраску. Случаев с негативным окрашиванием всех 4 антител не было. Иммунопозитивная реакция с антителом AK1 выявлена в 43 (72%) из 60 случаев с AL-каппа-амилоидозом. В 15 (25%) случаях выявляли слабое положительное окрашивание амилоидных отложений, 2 (3%) случая были отрицательными. Окрашивание с AK2 было иммунопозитивным в 46 (77%) из 60 случаев. 10 (17%) образцов биопсий были слабопозитивными, 4 (6%) — отрицательными. Срезы, окрашенные с использованием антитела AK3 (58 биопсий), были в 100% иммунопозитивные. В 49 (96%) случаях из 51 выявляли положительное окрашивание с AK4, остальные 2 (4%) случая были слабопозитивными. В некоторых случаях с AL-лямбда-амилоидозом не хватило гистологического материала для окрашивания с антителами AK3 и AK4 (AK3 в 2 случаях, AK4 в 9), но все эти биоптаты дали иммунопозитивную окраску при окрашивании с антителами AK1 и AK2.

Специфичность наших антител протестирована на 45 биопсиях, произведенных у 34 пациентов с другими видами амилоидоза: 18 пациентов с AL-лямбда-амилоидозом, 14 пациентов с AA-амилоидозом, 10 с транстиретиновым амилоидозом и 3 с инсулиновым амилоидозом (AIns).

В 14 (78%) из 18 случаев с AL-лямбда-амилоидозом все 4 антитела (AK1-AK4) были негативны. В 4 биоптатах выявлялось слабое положительное окрашивание с некоторыми из антител. В одном случае (биопсия бронха) отмечалось слабое позитивное окрашивание с AK1 и AK4, а также положительное окрашивание с антителами AL-каппа («DAKO») и TTR («DAKO»), что может свидетельствовать о смешанной форме амилоидоза. В биоптатах легкого AK2 и AK4 показали слабую иммунореактивность. В двух случаях (биопсия сердца) отмечали иммунопозитивную реакцию с AK1 и AK3, а окрашивание с AK4 было слабоположительным.

Во всех случаях с АА-, TTR-, и АIns-амилоидозом антитела AK1—AK4 были негативны (100%), что свидетельствует о их высокой специфичности (рис. 2).

Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что из четырех генерированных нами антител наиболее достоверные данные получены при использовании антитела AK3. Поэтому во втором этапе исследований мы решили оценить степень специфичности и сенситивности антитела AK3, протестировав его на 117 биоптатах, взятых у 108 пациентов: 40 с установленным каппа-амилоидозом, 30 с лямбда-амилоидозом, 29 с транстиретиновым и 18 с АА-амилоидозом.

Во всех 40 (100%) случаях с каппа-амилоидозом антитело АК3 дало выраженную иммунопозитивную реакцию. В 28 (93%) из 30 случаев с лямбда-амилоидозом окрашивание с АК3 было негативным, а в двух случаях слабопозитивным. В 27 (93%) из 29 случаев с транстиретиновым амилоидозом окрашивание с АК3 было отрицательным, а в двух случаях — слабоположительным. Случаи со слабоположительной реакцией АК3 у пациентов с лямбда-амилоидозом и транстиретиновым расценены как контаминация амилоидных отложений с плазменными белками.

Правильное типирование амилоидоза является очень важным для выбора лечения пациента. Согласно данным литературы, наиболее распространенным методом типирования является иммуногистохимическое исследование. Однако число неклассифицируемых случаев составляет от 13 до 43% [27, 28]. Несмотря на то что случаи с AL-амилоидозом и транстиретиновым иногда имеют схожую клиническую и морфологическую характеристику, мы предполагаем, что большинство неклассифицированных случаев были все же случаи с AL-амилоидозом. Для преодоления этой проблемы в случаях с AL-лямбда-амилоидозом наша научная группа в предшествующих исследованиях расширила набор антител к лямбда-амилоидозу, создав коммерчески недоступные антитела (AL1, AL3, AL7), что позволило снизить число неклассифицируемых случаев на 5% [29]. Несмотря на улучшение классификации, все еще остаются случаи с неустановленным типом амилоидоза. Мы предполагаем, что использование лишь одного коммерчески доступного антитела к AL-каппа-амилоидозу может быть недостаточным для корректной классификации. Поэтому в данном исследовании мы решили увеличить число антител для иммуногистохимической классификации амилоидоза.

В результате нами впервые были успешно синтезированы четыре новых поликлональных пептидных антитела (AK1, AK2, AK3 и AK4) для диагностики AL-каппа-амилоидоза, направленные к вариабельному и константному регионам каппа-легких цепей, что позволило облегчить иммуногистохимическую диагностику AL-амилоидоза и предотвратить ошибки в установлении его типа. Полученные антитела являются высокоспецифичными для выявления AL-каппа-амилоидоза и неспецифичными (100%) для амилоидоза других типов (АА-, ATTR- и Insulin, AL-лямбда-амилоидоза). Антитела AK1—AK4 могут быть рекомендованы для улучшения иммуногистохимической классификации амилоидоза. Иммунопозитивная реакция с несколькими антителами, направленными к каппа-легким цепям, повышает вероятность правильной диагностики AL-каппа-амилоидоза у пациентов, что позволяет тем самым снизить риск ошибочного иммуногистохимического типирования амилоидоза.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: К.Р., Л.М.М.

Сбор и обработка материала: З.В.Г.

Статистическая обработка: З.В.Г.

Написание текста: Л.М.М., З.В.Г.

Редактирование: Л.М.М.

Конфликт интересов отсутствует.