Врожденный буллезный эпидермолиз (ВБЭ) представляет собой обширную группу наследственных заболеваний, развивающихся с рождения или в первые дни жизни и характеризующихся образованием пузырей на коже и слизистых оболочках на местах предшествовавшего даже незначительного механического воздействия — трения, давления [1]. Заболевание встречается крайне редко — около 19 случаев на 1 млн живорожденных детей [2] и обусловлено мутациями в генах, кодирующих ряд структурных белков эпидермиса и дермо-эпидермального соединения, в котором выделяют 4 компонента — полудесмосомы базальных кератиноцитов, светлую пластинку (lamina lucida), плотную пластинку (lamina densa) и фиброретикулярную пластинку.

Полудесмосомы локализуются на нижнем полюсе базальных кератиноцитов. В их структуре выделяют внутри- и внеклеточные диски. Кератиновые промежуточные филаменты, состоящие из цитокератинов 5 и 14, непосредственно связаны с внутренним диском полудесмосом и междисковым пространством, а также с белками полудесмосом — плектином и антигеном буллезного пемфигоида 1 (БПАГ1, или БП230, или дистонином). Плектин и дистонин, относящиеся к семейству плакинов, обеспечивают ряд межбелковых взаимодействий, а также связывают в единую структуру два трансмембранных белка, составляющих внеклеточный диск полудесмосом, — α6β4-интегрин и коллаген XVII типа (также известный как БПАГ2 или БП180) [3].

Непосредственно под плазматической мембраной базальных кератиноцитов локализуется электронно-прозрачная область (так называемая светлая пластинка) и электронно-плотная область (плотная пластинка, представляющая собой густую сеть соединительнотканных волокон). Сквозь светлую пластинку, лежащую непосредственно под полудесмосомами, проходят тонкие якорные филаменты, проникающие в плотную пластинку. Ламинин-332 (ранее известный как калинин, или ламинин-5), состоящий из трех цепей (α3, β3 и γ2), кодирующихся разными генами, выявляется на участке между верхней частью плотной пластинки и нижней частью светлой пластинки, располагаясь в основании якорных филаментов, состоящих из коллагена XVII типа [3].

Под плотной пластинкой локализуется фиброретикулярная пластинка с полукруглыми петлевыми структурами, так называемыми якорными фибриллами, состоящими преимущественно из коллагена VII типа, причем N-терминальные аминогруппы противоположно направленных коллагеновых фибрилл начинаются и заканчиваются в плотной пластинке, обеспечивая связь плотной пластинки с подлежащими коллагеновыми волокнами и другими компонентами дермы [3].

Важная роль в обеспечении дермо-эпидермального соединения отводится гену FERMT1 (или KIND1), ответственному за синтез киндлина-1 — белка семейства ферминтина. Киндлин-1, вероятно, обеспечивает связь актинового цитоскелета с β1-интегринами и внеклеточным матриксом в сайтах фокальной адгезии, расположенных на нижнем полюсе базальных кератиноцитов между полудесмосомами, участвуя в контроле и активации клеточной адгезии [3, 4].

Структурная целостность эпидермиса обеспечивается особым типом контактов между кератиноцитами — десмосомами, состоящими из белков клеточной адгезии семейства кадгеринов (десмоглеина и десмоколлина) и адапторных белков (десмоплакина, плакофиллина и плакоглобина), соединяющих внутриклеточные домены кадгеринов с кератиновыми промежуточными филаментами [5].

Таким образом, целостность эпидермиса и его соединение с подлежащими тканями обеспечивается большим количеством структурных элементов и генетические дефекты в выработке любого из них могут привести к развитию одной из форм ВБЭ. Согласно рекомендациям 3-го Международного согласительного совещания по диагностике и классификации ВБЭ (2008 г.) и на основании пересмотра его в 2014 г. выделяют более 30 клинических форм заболевания, объединенных по уровню расположения пузырей в 4 типа: простой ВБЭ, пограничный ВБЭ, дистрофический ВБЭ и Киндлер-синдром (см. таблицу).

Простой ВБЭ сопровождается формированием интраэпидермальных щелей в базальных или супрабазальных отделах эпидермиса в результате снижения или отсутствия экспрессии десмоглеина, плакофиллина-1, цитокератинов 5 или 14, плектина или интегрина α6β4. Клиническое течение простого ВБЭ в большинстве случаев благоприятное — пузыри и эрозии наблюдаются лишь на начальных этапах заболевания (у детей в возрасте до 1 года), при этом заживление происходит в нормальные сроки, без формирования рубцов. У взрослых пациентов с простым ВБЭ клинические проявления могут ограничиваться гиперкератозом и гипергидрозом ладоней и подошв. Продолжительность жизни при данном типе ВБЭ соответствует таковой в общей популяции [8, 9].

При пограничном типе ВБЭ расщепление кожи происходит в зоне светлой пластинки дермо-эпидермального соединения вследствие нарушения экспрессии ламинина-332, коллагена XVII типа или интегрина α6β4. Течение заболевания более тяжелое — выявляются множественные пузыри с вялой покрышкой, заживающие с формированием на их местах участков рубцовой атрофии; характерно наличие грануляционной ткани вокруг ногтей и развитие анонихии; рубцовые изменения в периоральной области приводят к формированию микростомии. На местах повторно возникающих высыпаний может развиваться плоскоклеточный рак кожи [9].

Дистрофический тип ВБЭ протекает с формированием щелей также в области дермо-эпидермального соединения, однако глубже, чем при пограничном типе, под плотной пластинкой при недостаточном синтезе коллагена VII типа. Этот тип ВБЭ имеет наиболее тяжелое клиническое течение — с множеством глубоких эрозий, заживающих крайне медленно (в сроки до нескольких месяцев) с формированием грубых рубцов и стриктур, что впоследствии приводит к развитию микростомии, псевдосиндактилий, контрактур пальцев. Стриктуры и стенозы также могут выявляться во всех отделах желудочно-кишечного тракта. Состояние больных тяжелое, качество жизни значительно нарушено, продолжительность жизни снижена главным образом за счет развития на местах повторно возникающих высыпаний плоскоклеточного рака кожи крайне агрессивного течения с быстрым метастазированием [8].

При Киндлер-синдроме в результате недостаточности белка киндлина-1 щели формируются вариабельно — на разных уровнях в пределах одного кожного лоскута выше и ниже зоны плотной пластинки, а также в промежутках между кератиноцитами [9]. Отличительными клиническими признаками Киндлер-синдрома являются пойкилодермия и фоточувствительность в области высыпаний. В остальном картина заболевания часто имитирует пограничный или дистрофический типы ВБЭ.

Установление типа ВБЭ крайне важно для определения в каждом случае прогноза заболевания, что, учитывая многообразие клинических проявлений заболевания, требует комплексного подхода [1], включающего клинический осмотр, морфологическое исследование, в том числе трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ), иммунофлюоресцентное антигенное картирование (ИАК) и молекулярно-генетическое исследование.

Молекулярно-генетическое исследование является наиболее точным диагностическим методом, так как направлено на выявление определенной мутации, ответственной за развитие заболевания, что позволяет не только оценить его прогноз, но и при необходимости провести пренатальную диагностику с таргетным поиском у плода выявленных у родителей генетических нарушений. Однако на сегодняшний день известно порядка 16 генов и в каждом из них в среднем около 50 мутаций, обусловливающих развитие различных вариантов ВБЭ. Таким образом, применение молекулярно-генетического исследования без предварительного уточнения формы ВБЭ не представляется возможным.

Цель исследования — оптимизация морфологической диагностики различных видов ВБЭ.

Проведено исследование 28 биоптатов кожи от 14 пациентов с различными видами ВБЭ в возрасте 10—48 лет, двое из которых находились в близкородственных связях (мать и сын). При клиническом осмотре у 4 больных предварительно установлен простой тип ВБЭ, у 9 больных — дистрофический, у 1 — Киндлер-синдром. У всех пациентов на исследование брали два фрагмента кожи: один из зоны пузыря для проведения рутинного гистологического исследования, второй из видимо неповрежденной кожи для проведения ИАК. В качестве контроля использовалась здоровая кожа, полученная при проведении пластических коррекций у 10 пациентов в возрасте 26—48 лет. ИАК проводили на криостатных срезах с применением непрямой реакции иммунофлюоресценции (нРИФ) в соответствии со стандартным протоколом [10]. Использовали антитела к 13 компонентам дермо-эпидермального соединения: ламинин α-3 кроличьи поликлональные антитела («Santa Cruz Biotechnology», США); ламинин бета 3, ламинин гамма 2, коллаген VII и ITGB4 кроличьи поликлональные антитела, плектин и десмоплакин кроличьи моноклональные антитела, коллаген тип XVII, плакофилин 1, интегрин альфа 6 мышиные моноклональные антитела («GeneTex», США); цитокератин 5 и цитокератин 14 кроличьи моноклональные анитела («Epitomics», США); киндлин-1 кроличьи антитела («Thermo scientific», США). В качестве вторичных антител, меченных флюорохромами, применяли: goat anti-rabbit polyclonal antibody DyLight 488 (флюоресценция наблюдается в зеленом диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 488 нм) и goat anti-mouse polyclonal antibody DyLight 633 (флюоресценция наблюдается в красном диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 633 нм). Для заключения препаратов под покровное стекло использовали среду, содержащую нуклеотидспецифичный флюорохром DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) (Fluoroshield with DAPI, «Sigma-aldrich», США), флюоресцирующий в синем диапазоне при воздействии лазерного света с длиной волны 405 нм. Анализ изготовленных препаратов осуществляли с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus IX81S1F-S (Германия).

При проведении морфологического исследования у всех больных подтвержден клинически установленный диагноз ВБЭ. В 12 наблюдениях отмечалось наличие субэпидермального пузыря без признаков воспаления, что могло соответствовать любому из типов ВБЭ (рис. 1, а). В одном наблюдении выявлен внутриэпидермальный пузырь с перинуклеарным расщеплением базальных кератиноцитов, в дне пузыря отмечались фрагменты цитоплазмы базальных клеток (см. рис. 1, б). На основании этих изменений предположительно был диагностирован простой тип ВБЭ. В другом наблюдении в покрышке пузыря выявлялась полоска базальной мембраны, что свидетельствовало о расщеплении кожного лоскута под плотной пластинкой, кроме того, в дне пузыря выявлялись признаки фиброза, характерные для повторного возникновения пузырей в одной и той же области (см. рис. 1, в). Указанные признаки дали основание предположить дистрофический тип ВБЭ.

При проведении ИАК контрольной группы свечение антител соответствовало локализации структурных компонентов дермо-эпидермального соединения, выявлялось в виде четкой, широкой, непрерывной полосы вдоль базальной мембраны (рис. 2, а—и) либо в виде свечения в межклеточных промежутках всех слоев эпидермиса по контуру клеточных мембран кератиноцитов, напоминая «сетку» или «пчелиные соты» (см. рис. 2, к, л), либо перинуклеарно во всех слоях эпидермиса (см. рис. 2, м, н).

В 7 наблюдениях из группы больных ВБЭ, у которых после проведения гистологического исследования не была уточнена форма заболевания, при проведении нРИФ отмечалось снижение экспрессии коллагена VII типа. В 6 случаях свечение флюорохромов отличалось гранулярным характером, местами представляло собой прерывистую линию, идущую вдоль дермо-эпидермальной границы. В одном биоптате на большем протяжении дермо-эпидермальной границы свечение было сохранено в виде широкой, непрерывной полосы, сходной с таковой в здоровой коже, отсутствуя лишь на единичных участках (рис. 3, а). Экспрессия остальных 12 исследованных компонентов дермо-эпидермального соединения не отличалась от контрольной группы. На основании выявленного нарушения экспрессии коллагена VII во всех 7 наблюдениях диагностирован дистрофический тип ВБЭ, а в качестве кандидата на поиск мутации определен ген, ответственный за продукцию коллагена VII.

Совместное нарушение экспрессии нескольких белков дермо-эпидермального соединения отмечалось в трех случаях, в том числе два образца были от близких родственников (мать и сын). При развитии заболевания в одной семье в обоих биоптатах отмечались идентичные изменения. Во всех исследованных компонентах дермо-эпидермального соединения наблюдалось совместное нарушение экспрессии α3-цепи ламинина (см. рис. 3, б) и коллагена XVII типа (см. рис. 3, в). Полоса свечения флюорохромов в этих образцах, соответствующая локализации α3-цепи ламинина, по сравнению с образцами контрольной группы была истончена, отмечались ее многократные прерывания. Экспрессия коллагена XVII типа визуализировалась вдоль дермо-эпидермальной границы в виде очень коротких единичных отрезков и гранул.

В другом наблюдении отмечалось совместное нарушение экспрессии β3-цепи ламинина (см. рис. 3, г) и коллагена XVII типа. Экспрессия β3-цепи ламинина представляла собой узкую, местами едва различимую за свечением ядер клеток базального слоя эпидермиса прерывистую полосу. Свечение флюорохромов, соответствовавшее коллагену XVII типа, на большем протяжении отсутствовало и лишь очагово выявлялось в виде широкой нечеткой «размытой» полосы. Экспрессия других 11 компонентов дермо-эпидермального соединения не отличалась от контрольной группы. Во всех 3 случаях на основании ИАК был установлен диагноз пограничного ВБЭ, который не был диагностирован клинически и были выявлены белки, дефекты продукции которых и обусловили развитие заболевания.

В одном наблюдении, в котором при гистологическом исследовании был выявлен пузырь в базальном слое с расщеплением кератиноцитов, отмечалось снижение экспрессии β4-субъединицы интегрина (см. рис. 3, д). Свечение антител выявлялось на границе между наружным корневым влагалищем и дермой виде прерывистой линии, местами имеющей гранулярную структуру. Таким образом, был подтвержден предположительный диагноз ВБЭ простого типа и выявлен дефектный белок.

Нарушение экспрессии киндлина-1 позволило установить диагноз Киндлер-синдрома. Свечение флюорохромов визуализировалось в единичных участках эпидермиса: по контуру клеточных мембран базальных и надбазальных кератиноцитов, а также вдоль дермо-эпидермальной границы в виде единичных коротких узких полос, не формирующих непрерывную линию (см. рис. 3, е). Экспрессия остальных компонентов дермо-эпидермального соединения не отличалась от таковой контрольной группы.

В двух наблюдениях при проведении ИАК экспрессия всех структурных белков дермо-эпидермального соединения не отличалась от контрольной группы. Тем не менее в обоих случаях методом ИАК удалось выявить уровень расщепления кожного лоскута при формировании пузыря, что позволило установить тип ВБЭ. В одном случае спонтанное расщепление кожного лоскута было выше светлой пластинки (свечение флюорохромов, соответствующее α6-субъединице интегрина, отмечалось в дне пузыря (см. рис. 3, ж), что указывало на простой ВБЭ. При этом экспрессия белков (цитокератинов 5 и 14, десмоглеина, плакофиллина), нехватка которых приводит к развитию простого ВБЭ, по данным ИАК, не была снижена. В другом наблюдении спонтанное расщепление кожного лоскута произошло под светлой пластинкой, свечение флюорохромов, соответствующее β4-субъединице интегрина, отмечалось в покрышке пузыря (см. рис. 3, з), что указывало на дистрофический ВБЭ. При этом экспрессия коллагена VII типа, нарушение которой ответственно за развитие дистрофического ВБЭ, по данным ИАК, соответствовала таковой в коже здоровых лиц.

Таким образом, по результатам проведенного ИАК, тип ВБЭ, предварительно установленный при клиническом осмотре, был подтвержден у 11 больных. У двух больных установлен простой тип ВБЭ, при этом лишь у одного из них удалось установить белок с нарушенной экспрессией. У 8 пациентов подтвердился дистрофический тип ВБЭ, у 1 — Киндлер-синдром. Расхождения клинического и иммуноморфологического диагнозов отмечались в 3 случаях. У 2 пациентов (мать и сын) клинически предполагался простой ВБЭ, тогда как по результатам ИАК был установлен пограничный тип заболевания. У 1 пациента после проведения ИАК клинический диагноз дистрофического ВБЭ был также изменен на пограничный вариант.

Проведенное исследование показало, что при подозрении на ВБЭ должно проводиться этапное морфологическое исследование. На первом этапе необходимо проведение рутинного гистологического исследования. При выявлении пузыря, локализующегося в зоне дермо-эпидермального соединения и не сопровождающегося воспалительными изменениями, подтверждается клинический диагноз ВБЭ. Более точная диагностика типа заболевания на этом этапе, как правило, невозможна, или может быть только ориентировочной. При выявлении в зоне пузыря воспалительных изменений необходимо уточнение клинических данных по срокам существования элемента, механизму его образования и возможности вторичного инфицирования.

После подтверждения диагноза ВБЭ проводится установление типа ВБЭ, этот этап требует применения более точных методов. Ранее для установления типа ВБЭ активно использовалась ТЭМ, позволяющая с высокой точностью выявить ультраструктурные изменения в коже больных и определить уровень формирования щелей [11]. Однако, одному уровню расщепления может соответствовать нарушение экспрессии различных структурных компонентов дермо-эпидермального соединения (см. таблицу), в связи с чем применение ТЭМ в большинстве случаев незначительно сужает область поиска мутаций при молекулярно-генетическом исследовании и на сегодняшний день редко используется в диагностике ВБЭ [6, 7].

На современном этапе тип ВБЭ определяется на основании результатов ИАК, позволяющего визуализировать экспрессию каждого из структурных белков дермо-эпидермального соединения и выявить нарушения их продукции [3], что в значительной мере сужает поиск генетических мутаций и упрощает проведение молекулярно-генетических исследований. В 3 наблюдениях только благодаря проведению ИАК стало возможно диагностировать тип ВБЭ, так как клинические проявления заболевания были полиморфны и могли быть отнесены к иным типам заболевания.

Даже в тех случаях, когда не удается выявить нарушения экспрессии белков дермо-эпидермального соединения, ИАК остается ценным диагностическим методом. В нашем исследовании в двух наблюдениях тип ВБЭ был установлен по уровню спонтанного расщепления кожного лоскута, при сохранении экспрессии и распределения антител ко всем исследованным компонентам дермо-эпидермального соединения в пределах нормы. Этот факт, вероятно, может быть объяснен явлением мозаицизма [12—15], описанным для пациентов с ВБЭ, в этом случае у больных присутствуют две и более генетически различные популяции клеток, в связи с чем при заборе биоптата с участка видимо здоровой кожи, удаленного из области высыпаний, в препарат может не попасть область со сниженной экспрессией одного из белков.

Также необходимо остановиться на трудностях, возникающих при исследовании материала от больных ВБЭ. Поскольку в основе заболевания лежат структурные дефекты белков, обеспечивающих прочность дермо-эпидермального соединения, кожа таких пациентов отличается крайней ранимостью, и даже при незначительных воздействиях часто возникает ее расслоение, нередко с утратой эпидермальной части. В нашем исследовании в трех биоптатах эпидермис был полностью разрушен в процессе забора материала, в связи с чем выявить дермо-эпидермальную границу не представлялось возможным. В таких случаях обращалось внимание на наличие волосяных фолликулов или их фрагментов в имеющемся препарате кожи. Как было показано в ряде исследований, наружное корневое влагалище по своей структуре гомологично эпидермису [16, 17], в нем выявляются те же структурные белки эпидермиса и дермо-эпидермального соединения, что позволяет использовать его для проведения ИАК. В указанных трех случаях локализация и характер свечения всех исследуемых антител определялись в области наружного корневого влагалища волоса (см. рис. 3, д) [13].

Таким образом, проведенное исследование показало важное значение морфологических методов в диагностике различных типов ВБЭ. Их использование позволяет провести поэтапную диагностику заболевания — дифференцировать ВБЭ с другими буллезными дерматозами, установить тип ВБЭ, выявить нарушение структурной целостности дермо-эпидермального соединения на уровне экспрессии белков, что в итоге ограничивает область поиска мутаций при молекулярно-генетическом исследовании одним—двумя генами. ИАК является неотъемлемой частью комплексной морфологической диагностики ВБЭ, позволяя выявить белок с нарушенной экспрессией и выступая, таким образом, промежуточным звеном между патоморфологическим подтверждением диагноза ВБЭ и таргетным поиском мутации молекулярно-генетическим методом.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.А.К., А.Э.К.

Сбор и обработка материала: В.А.С., В.И.А., М.А.Н.

Статистическая обработка: В.А.С., М.А.Н.

Написание текста: В.А.С., В.И.А., М.А.Н.

Редактирование: А.А.К., А.Э.К.

Конфликт интересов отсутствует.