Рак молочной железы (РМЖ), как и многие другие неоплазии, отличается высокой гетерогенностью [1]. Изучение профилей генной экспрессии внесло значительный вклад в понимание этой гетерогенности на молекулярном уровне, доведя систематику, основанную только на очевидных критериях, таких как гистологический тип и степень дифференцировки, до более совершенной, отражающей гормонально-рецепторный статус и характерные профили белковой экспрессии, что дало возможность определить мишени для таргетной терапии.

В отличие от люминальных подтипов РМЖ и HER-2-позитивных опухолей, эффективно поддающихся терапии, направленной на блокаду ER и HER-2 соответственно, тройные негативные опухоли базальной подгруппы трудно поддаются лечению ввиду отсутствия очевидной терапевтической мишени. Хорошо известно, что опухоли с тройным негативным иммунофенотипом неоднозначно отвечают на традиционную полихимиотерапию (ПХТ), проявляя в ряде случаев абсолютную резистентность [2]. Наряду с этим для тройного негативного РМЖ характерны высокая степень малигнизации (grade 3), агрессивный рост и склонность к метастазированию, что ассоциировано с неблагоприятным прогнозом.

Высокую резистентность тройного негативного РМЖ к традиционным стратегиям ПХТ предположительно связывают с присутствием стволовых опухолевых клеток (СОК), характеризующихся высокой экспрессией CD44 и низкой CD24 [3, 4]. Подобно нормальным стволовым клеткам, СОК формируют специфическое микроокружение, способствующее поддержанию основных свойств опухолевых клеток. Одной из таких особенностей микроокружения является высокая продукция гликопротеида внеклеточного матрикса тенасцина С. Тенасцин С избирательно усиливает сигнальные пути, способствующие выживанию СОК при стрессовых воздействиях, таких как радио- и химиотерапия, а также участвует в создании дистанционной ниши для СОК и в ангиогенезе, благоприятствуя формированию и росту метастазов [5]. При нарастающем объеме данных, подтверждающих значение популяции СОК в отсутствие ответа на химиотерапию и особую роль тенасцина С в поддержании ниши СОК, не найдено сведений, указывающих прямо или косвенно на взаимосвязь тенасцина С и клеток с характерным для СОК фенотипом CD44⁺/CD24^low/–, при тройном негативном РМЖ, и при его химиорезистентных формах.

Цель исследования — установить связь между основными маркерами СОК — CD44 и CD24, уровнем продукции тенасцина С и химиорезистентностью при тройном негативном РМЖ.

В исследование отобрано 30 образцов биопсии тройного негативного РМЖ, полученных от пациенток, прошедших предоперационное химиотерапевтическое лечение и далее оперативное лечение в ФГАУ «Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России с 2014 по 2016 г. включительно. Всем отобранным пациенткам стандартно назначали неоадъювантную ПХТ паклитакселом в сочетании с карбоплатином AUC-6, 4—6 курсов.

В отношении первичных биоптатов проводили стандартную патоморфологическую и иммуногистохимическую оценку с целью верификации морфологического типа, степени дифференцировки и иммунофенотипа опухоли (подтверждение тройного негативного статуса). Операционный материал анализировали в отношении степени морфологического ответа опухоли на ПХТ. Выраженность лечебного эффекта неоадъювантной терапии оценивали по системе RCB с применением on-line-калькулятора, остаточная опухолевая нагрузка ранжировалась по классам от 0 до III. При этом изучали ложе остаточной опухоли, при неполном регрессе остаточный опухолевый узел, наличие компонента протокового рака in situ, количество метастатических лимфатических узлов, диаметр наибольшего метастаза.

Маркеры CD44, СD24 и тенасцин С выявляли стандартным иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах, используя в качестве первичных моноклональные антитела к CD44 (клон 156−3C11, «Thermo Fisher Scientific»), к СD24 (клон ALB9, «Thermo Fisher Scientific»), к тенасцину С (клон BC-24, «Abcam»). Для визуализации применяли систему детекции Envision FLEX («Dako»). Иммуногистохимическому исследованию были подвергнуты как первичные, так и операционные биоптаты в случаях слабого ответа опухоли на проведенное предоперационное лечение (II—III класс остаточной опухолевой нагрузки). В случае выраженного или полного ответа опухоли на ПХТ (0—I класс остаточной опухолевой нагрузки) иммуногистохимически исследовали только первичные биопсии.

По степени морфологического ответа на ПХТ исследованные тройные негативные опухоли распределились следующим образом: 12 (40%) образцов имели выраженный или полный морфологический ответ (0—I класс остаточной опухолевой нагрузки), в 18 (60%) выявлен слабый ответ или его отсутствие (II—III класс остаточной опухолевой нагрузки).

При полном ответе опухоли на ПХТ только в 2 (17%) образцах из 12 выявлены единичные метастазы в регионарных лимфатических узлах. Напротив, в 16 (89%) из 18 случаев с проявлением слабого ответа на ПХТ отмечены метастазы, в том числе множественные (9, 50%). При этом множественные метастазы были ассоциированы с признаками лимфатической инвазии, манифестирующимися опухолевыми эмболами в лимфатических щелях, а также транснодулярной инвазией с прорастанием в перинодулярную жировую клетчатку.

Слабый ответ опухоли на ПХТ в большей части образцов (16, или 89%) сочетался с иммунофенотипом, характеризующимся умеренной или резкоположительной реакцией к CD44 и слабоположительной реакцией или ее отсутствием к CD24 (CD44⁺/CD24^low/–) (рис. 1, а—в). Именно эти случаи были ассоциированы с метастатической болезнью. Во всех образцах данной подгруппы наблюдалась также положительная реакция к тенасцину С. При этом полное резкоположительное окрашивание опухолевой стромы на тенасцин С отмечалось во всех случаях с множественными метастазами и лимфатической инвазией (см. рис. 1, г). В остальных случаях с единичными метастазами тенасцин С обнаруживал умеренное крупноочаговое окрашивание, резко усиливающееся на участках инвазивного фронта по краю первичного очага. В двух других опухолях, имеющих слабый морфологический ответ на ПХТ, но не ассоциированных с метастазированием, помимо выраженной экспрессии CD44, отмечалась умеренно-положительная и резкоположительная реакция к CD24. Эти же опухоли отличались очаговым характером распределения тенасцина С от слабого до умеренного по интенсивности окрашивания.

Следует отметить, что характер иммуногистохимических реакций не менялся на фоне ПХТ и был идентичным как в первичных биоптатах до назначения неоадъювантной терапии, так и в операционных образцах после курсов ПХТ.

При выраженном или полном морфологическом ответе тройных негативных опухолей на ПХТ иммуногистохимические реакции на выявление исследуемых маркеров проводились только в первичных биоптатах в силу практически полного отсутствия остаточной опухоли в операционных образцах. В этой подгруппе найдены лишь 2 опухоли из 12, строго соответствующие профилю CD44⁺/CD24^low/–, в одном из которых отмечен регионарный метастаз. В остальном наблюдалась широкая вариабельность окрашивания на CD44 от почти полного его отсутствия до резкоположительного. CD24 в половине случаев оставался высоким. Иммуногистохимическая реакция на тенасцин С в основном имела слабо- и умеренно-положительный характер и была очаговой (рис. 2). В четырех случаях, в том числе в обоих с присутствием метастазов, реакция на тенасцин С заметно усиливалась, однако именно в этих биоптатах профиль экспрессии не соответствовал фенотипу CD44⁺/CD24^low/–. В то же время объективно оценить, охватывало усиление реакции на тенасцин С весь опухолевый узел или было ассоциировано с инвазивным краем первичной опухоли на материале тонкоигольной биопсии, не представлялось возможным. Полного отсутствия тенасцина С ни в одном случае не наблюдалось.

В исследованных 30 образцах биопсии тройного негативного РМЖ установлена разная степень морфологического ответа на ПХТ паклитакселом в сочетании с карбоплатином, демонстрирующая резистентность в 60% случаев. Выявленная неоднозначность морфологического ответа тройного негативного РМЖ на неоадъювантную терапию подчеркивает гетерогенность данного опухолевого субтипа, что подтверждается также обнаружением клеток с иммунным профилем CD44⁺/CD24^low/– лишь в части опухолей и преимущественной ассоциативной связью данного иммунофенотипа с резистентностью к ПХТ. Иммунофенотип CD44⁺/CD24^low/– соответствует характерному для СОК сочетанию экспрессии маркеров и может свидетельствовать о наличии в составе части тройных негативных РМЖ популяции СОК.

Полученные результаты в пользу гетерогенности изученных случаев тройного РМЖ вполне согласуются с данными литературы и классификацией РМЖ, основанной на изучении молекулярных профилей. Поскольку базальный опухолевый фенотип характеризуется недостаточностью экспрессии ER, PR и HER2, его часто упоминают как тройной негативный РМЖ. Тем не менее тройной негативный РМЖ не является абсолютным синонимом базальному, поскольку неоднороден по другим молекулярным характеристикам [6]. В 2007 г. детальный анализ экспрессии генов в образцах тройного негативного РМЖ позволил выделить еще один подтип в пределах этой группы — низкоклаудиновый [7], отличающийся от типичных базальных опухолей отрицательной регуляцией белков плотных эпителиальных контактов клаудинов 3, 4 и 7 [8], гликопротеина межклеточной адгезии Е-кадгерина, а также маркерами эпителиально-мезенхимального перехода и наличием признаков СОК, таких как отсутствие или низкая экспрессия CD24 и повышенная экспрессия CD44 [9].

В настоящее время активно изучается взаимоотношение между различными подтипами РМЖ и наличием маркеров СОК, поскольку обнаружение СОК часто связано с плохим прогнозом. В некоторых исследованиях сообщается о высоком проценте клеток CD44⁺/CD24^low/– как в базальном, так и в низкоклаудиновом подтипе тройного негативного РМЖ. В то же время считается, что маркеры СОК прямо не связаны с внутренними свойствами самих СОК и их присутствие может широко варьировать в различных типах опухолей [6], в том числе встречаться в люминальных подтипах РМЖ [11] и HER-2-позитивном РМЖ [2].

Несмотря на то что, по данным литературы, экспрессия описанного молекулярного профиля CD44⁺/CD24^low/– коррелирует со слабым ответом на ПХТ, в нашем исследовании найдена преимущественная, однако не абсолютная связь данного профиля с устойчивостью к ПХТ. Последнее может указывать на необходимость поиска дополнительных маркеров, возможно, сопровождающих СОК и способствующих их выживанию, в частности в условиях стресса. Одним из наиболее вероятных маркеров в этом смысле видится белок внеклеточного матрикса тенасцин С.

В литературе, однако, не найдено источников, описывающих взаимосвязь совместной положительной экспрессии тенасцина С и фенотипа СОК с химиорезистентностью. В настоящем исследовании выявлено, что все случаи слабого ответа на ПХТ ассоциированы с присутствием профиля CD44⁺/CD24^low/– в сочетании с резкоположительной иммуногистохимической реакцией на тенасцин С, в то время как при выраженном ответе на неоадъювантную терапию единичные случаи обнаружения фенотипа СОК не сопровождались высоким уровнем тенасцина. Существуют немногочисленные экспериментальные исследования in vitro, прямо подтверждающие роль тенасцина С в развитии химиорезистентности и гормональной резистентности. Так, в культуре клеток поджелудочной железы взаимодействие тенасцина с рецептором Annexin A2 индуцирует резистентность к гемцитабину [12]. В культуре клеток меланомы тенасцин активирует фенотип СОК, ассоциированный с экспрессией АТФ-связывающих кассетных транспортеров, которые опосредуют резистентность к доксорубицину [13]. В культурах РМЖ тенасцин С способен снимать митотический блок G1/S в раковых клетках на фоне воздействия доксорубицина путем отрицательной регуляции p21 через адапторный белок 14−3-3 tau [14]. Согласно тому же механизму, может развиться резистентность к гормональной терапии тамоксифеном [14]. По некоторым данным, тенасцин С был идентифицирован как часть профиля генной экспрессии, связанного с устойчивостью к тамоксифену у пациентов с метастатическим РМЖ [15].

Кроме того, наиболее высокая продукция тенасцина С в ассоциации с фенотипом CD44⁺/CD24^low/– отмечена в случаях, отличающихся не только химиорезистентностью, но также множественным метастазированием и другими признаками агрессивного течения, как, например, массивная лимфатическая инвазия. Выявленная взаимосвязь резкоположительной экспрессии тенасцина С и иммунофенотипа СОК с множественным метастазированием, по-видимому, также не является случайной. В последнее время все больше признается роль внеклеточного матрикса в опухолевой прогрессии и метастазировании как важного регулятора клеточных реакций [16]. Функциональный результат сигнализации очень зависит от сопутствующих факторов и может модулироваться особенностями состава внеклеточного матрикса [17]. Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия крайне важны для поддержания и выживания СОК при инвазии и метастазировании, где особая роль отводится именно тенасцину С. В норме большое количество тенасцина С вырабатывается в период эмбрионального развития млекопитающих особенно при миграции клеток нервного гребня в ходе формирования ЦНС и в локусах эпителиально-мезенхимальных взаимодействий [18, 19]. Во взрослых тканях экспрессия тенасцина С большей частью подавлена, тенасцин С в условиях нормального гомеостаза в основном определяется лишь в нишах стволовых клеток некоторых тканей, включая головной мозг, волосяной фолликул, красный костный мозг, что также свидетельствует в пользу регуляторного воздействия тенасцина С на популяцию стволовых клеток в целом [20].

Продукция тенасцина С может быть в значительной степени индуцирована РМЖ. Агрессивные формы РМЖ способствуют созданию дистанционной ниши для СОК путем секреции тенасцина С. В литературе появляются данные, свидетельствующие, что накопление тенасцина С сочетается с неблагоприятным прогнозом, что подтверждается соответствующим профилем генной экспрессии, предшествующим отдаленному метастазированию [21, 22]. В частности, тенасцин С усиливает Wnt- и Notch-сигнальные пути, способствующие выживанию и росту микрометастазов [25]. В связи с этим также обращает на себя внимание вариабельность детекции тенасцина С, обнаруженная в настоящей работе в ряде метастатических случаев при слабом ответе опухоли на ПХТ, которая выражалась в резком усилении реакции на участках инвазивного фронта по краю первичного очага. Согласно данным литературы, при многих типах рака в опухолевых узлах описан неравномерный характер распределения тенасцина С, при котором наиболее выраженный синтез тенасцина С, действительно, ассоциирован с инвазивным фронтом [23]. Идентичная гетерогенность присутствия тенасцина С описана также и в метастазах [5]. Этот феномен может иметь особое функциональное значение для некоторых стадий опухолевой прогрессии. Во время метастатического распространения раковые клетки, диссеминированные из первичного очага, сталкиваются в отдаленных участках с чужеродным микроокружением, к которому плохо адаптируются и имеют риск элиминации. Повышенная продукция тенасцина С на краю инвазии способна обеспечивать малигнизированному эпителию преимущества при столкновении с чужеродным микроокружением при распространении и росте метастазов во вторичных органах [24].

В результате настоящего исследования показано, что тройной негативный РМЖ является гетерогенным в отношении присутствия клеточной популяции, имеющей фенотип CD44⁺/CD24^low/–, носителем которого предположительно являются СОК. Установление химиорезистентности тройного негативного РМЖ на основании морфологических критериев оценки остаточной опухолевой нагрузки в большинстве случаев совпадало с выявлением профиля CD44⁺/CD24^low/–. Вместе с тем обнаружение повышенной продукции гликопротеида внеклеточного матрикса тенасцина С, участвующего в формировании ниши СОК, полностью сочеталось с фенотипом CD44⁺/CD24^low/–, при этом максимальное усиление реакции к тенасцину С отмечено в случаях, отличающихся не только отсутствием ответа на ПХТ, но также наибольшей агрессивностью течения в сочетании с метастатической болезнью.

Таким образом, при иммуногистохимическом анализе однозначная ассоциативная связь между фенотипом CD44⁺/CD24^low/– и резковыраженной продукцией тенасцина С может иметь прогностический потенциал, проспективно свидетельствуя о неэффективности неоадъювантной ПХТ, в частности производными платины, стандартно назначаемой для лечения тройного негативного РМЖ.

Учитывая роль тенасцина С в инвазии, метастазировании и химиорезистентности, он сам по себе может рассматриваться в качестве перспективной мишени для таргетной и/или комбинированной терапии онкологических заболеваний, в частности тройного негативного РМЖ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: О.П.П., А.А.И.

Сбор и обработка материала: О.П.П., С.Ю.Б.

Статистическая обработка: С.Ю.Б.

Написание текста: О.П.П.

Редактирование: С.Ю.Б., А.А.И.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.