SMILE (многослойное муцинпродуцирующее интраэпителиальное поражение — англ. stratified mucinproducing intraepithelial lesion) — предраковое изменение эпителия шейки матки, локализующееся в зоне трансформации, включенное в гистологическую классификацию опухолей женской репродуктивной системы ВОЗ в 2014 г. (раздел железистых новообразований шейки матки) [1]. SMILE нередко сочетается с аденокарциномой in situ (AIS) и/или цервикальной интраэпителиальной неоплазией (CIN), изредка сопровождает плоскоклеточную или эндоцервикальную карциному, рассматривается в качестве маркера фенотипической нестабильности и, возможно, является проявлением аденосквамозной карциномы in situ [2]. Изолированно SMILE наблюдается редко и патологами преимущественно обозначается резервно-клеточной дисплазией или многослойной железистой CIN. Диагностирование SMILE или его сочетания с CIN (при отсутствии AIS) следует отражать в гистологическом заключении, поскольку таким пациенткам показаны лечебные мероприятия, аналогичные таковым при AIS. SMILE поражает покровный эпителий шейки матки и эпителий, выстилающий эндоцервикальные крипты. Морфологические особенности SMILE включают одновременно признаки CIN и AIS. Общим с CIN для SMILE является многорядное строение, с AIS — содержание муцина в клетках. Однако по сравнению с AIS, которой свойственно формирование желез с сохраненной базальной мембраной и наличием глобул с муцином в апикальной части клеток, в SMILE железы не определяются, муцин располагается в виде вакуолей или просветления цитоплазмы на протяжении всего эпителиального пласта и визуализируется даже без применения дополнительной окраски. Также отмечаются атипия ядер клеток, гиперхромазия, митозы; апоптотические тельца встречаются в вариабельном количестве. При иммуногистохимическом исследовании наблюдаются диффузное окрашивание р16Ink4a и высокий пролиферативный индекс по Ki-67 [3].

Несмотря на вышеизложенное, данные литературы, касающиеся SMILE, ограничены, в российских изданиях упоминаний о таком поражении мы не обнаружили, в практическую работу клинических патологов этот термин не внедрен. В настоящей работе выполнен анализ архивного материала для возможного обнаружения SMILE с последующей его морфологической и иммуногистохимической характеристикой с целью охарактеризовать важность правильной диагностики SMILE как самостоятельного поражения и определить вспомогательные методы для постановки данного диагноза патологом.

Материалом для настоящего исследования послужили гистологические препараты конусов шейки матки с верифицированным диагнозом CIN3 от 53 женщин, поступивших в патологоанатомическое отделение ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России в 2015 г. При диагностировании CIN использовалась гистологическая классификация опухолей женской репродуктивной системы ВОЗ 2014 г. [1]. При обнаружении морфологических признаков, подозрительных в отношении SMILE, с соответствующих парафиновых блоков приготовлены дополнительные гистологические срезы и окрашены муцикармином, а также проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к p63. Позитивное окрашивание муцикармином и очаговая слабовыраженная или негативная экспрессия р63 подтверждали предположительный диагноз в соответствии с данными литературы [2—5]. Впоследствии эти образцы подвергались иммуногистохимическому исследованию с использованием биомаркеров р16/Ki-67 (набор CINtec PLUS), состоящих из моноклональных мышиных антител к р16 (клон Е6Н4) и моноклональных кроличьих антител к Ki-67 (клон 274−11 АС3), а также системы выявления RTU, «Roche»; Oct4 — моноклональные мышиные антитела (клон MRQ-10), 1:100, «Cell Marque»; CD117 — моноклональные кроличьи антитела (клон YR145), 1:50, «Cell Marque»; CD34 — моноклональные мышиные антитела (клон QBEnd/10), 1:100, «Cell Marque»; p53 — моноклональные мышиные антитела (клон DO-7), RTU, «Dako»; EMA — моноклональные мышиные антитела (клон E29), 1:500, «Dako»; CK15 — моноклональные мышиные антитела (клон LHK15), 1:250, «NeoMarkers».

При повторном изучении гистологических препаратов конусов шейки матки у всех 53 женщин была подтверждена CIN3. У 7 женщин на протяжении зоны трансформации, проксимальнее CIN3, также выявлены участки многослойного интраэпителиального поражения, состоящего из атипических клеток, расположенных менее плотно по сравнению с CIN3, что, вероятно, было обусловлено накоплением внутриплазматического муцина, визуально увеличивающего расстояние между ядрами клеток. Ядра клеток характеризовались легкой атипией и гиперхромностью, небольшое число митозов определялось во всей толщине эпителиального пласта. Данное поражение имело гладкий ровный контур, локализовалось на поверхности шейки матки и распространялось в эндоцервикальные крипты. Вышеописанные морфологические особенности расценены нами как SMILE (см. рисунок, а).

При гистохимическом исследовании на муцикармин у 7 женщин позитивное окрашивание наблюдалось в эндоцервикальных криптах, негативное — в CIN3, в участках SMILE у 2 пациенток отмечалось очаговое окрашивание муцикармином на протяжении всего эпителиального пласта, у 5 — негативное.

Проведено иммуногистохимическое исследование 7 образцов препаратов, позитивных в отношении муцикармина (положительное окрашивание всего эпителиального пласта). Экспрессия маркера р63 во всех 7 образцах наблюдалась в базальном отделе многослойного плоского эпителия, в базальном и промежуточном слоях CIN3, в эндоцервикальном эпителии отмечено фоновое окрашивание; в участках SMILE у 2 женщин очаговая экспрессия р63 визуализировалась в базальном отделе, у остальных 5 пациенток обнаружено диффузное окрашивание базального и промежуточного отделов эпителия. Таким образом, SMILE установлено лишь у 2 женщин (см. рисунок, б, в), CIN3 — у 5 пациенток.

При иммуногистохимическом исследовании образцов, содержащих SMILE, выявлена экспрессия маркера Кi-67, составившая около 40% (см. рисунок, г), и диффузная, умеренно выраженная как в ядре, так и в цитоплазме клеток экспрессия маркера p16INK4a. Диффузная, интенсивная экспрессия маркера EMA наблюдалась в эндоцервикальном и многослойном плоском эпителии, CIN3 и SMILE. Экспрессия маркеров стволовых клеток okt4 и CD117 и маркера ангиогенеза CD34 отсутствовала в эпителиальном компоненте препаратов шейки матки. Изучение экспрессии маркера p53 показало диффузное окрашивание последнего на протяжении CIN3, негативное — в неизмененном многослойном плоском и эндоцервикальном эпителии, на протяжении SMILE визуализировалась преимущественно слабая диффузная экспрессия р53, соответствующая wild type-гену TP53, с выраженным ядерным окрашиванием отдельных клеток в одном из двух препаратов, свидетельствующим о присутствии мутантного гена ТР53. Экспрессия СК15 обнаружена в CIN3 в виде диффузного окрашивания всего эпителиального пласта, в базальном слое многослойного плоского и эндоцервикального эпителия, в образцах SMILE визуализировалась слабая очаговая экспрессия СК15 (см. рисунок, е).

Поскольку, по данным литературы, SMILE нередко ассоциировано с CIN3, в исследование были включены конусы шейки матки с верифицированным CIN3; при пересмотре гистологических препаратов с учетом критериев SMILE данное поражение выявлено у 2 пациенток. О сочетании SMILE с другими предраковыми изменениями сообщают многие исследователи. По сведениям D. Boyle и соавт. [4], ассоциация SMILE и CIN наблюдалась в 64 образцах, SMILE и AIS — в 29, SMILE, CIN и AIS — в 21. У двух пациенток со SMILE в цервикальных биоптатах в последующем резецированной части шейки матки обнаружены SMILE и CIN. А. Backhouse и соавт. [5], изучившие SMILE у 34 пациенток, доложили об ассоциации с CIN у 26 женщин, с AIS у 1, одновременно с CIN и AIS у 6 [5]. J. Onishi и соавт. [6], напротив, указали на преобладание ассоциации SMILE и AIS (92%) по сравнению с ассоциацией SMILE и CIN (67%). Сочетание SMILE и AIS в настоящем исследовании не представлено, это обусловлено небольшим количеством материала, подвергшегося изучению, и редкостью исследуемого поражения, что отмечено и в мировой литературе. Так, J. Park и соавт. [2, 14] доложили о 18 наблюдениях SMILE, R. Lastra и соавт., J. Onishi и соавт. [2, 6, 7] — о 15 и 12 соответственно. Самым объемным явилось 6-летнее ретроспективное исследование D. Boyle и соавт. [4], включавшее 60 наблюдений SMILE, однако и эти авторы не исключают возможность гиподиагностики SMILE, так как гистологическое заключение проводилось разными патологами с вариабельными, нестандартизированными морфологическими критериями SMILE. Нельзя исключить ошибочное отнесение образований с гистологическими признаками SMILE к CIN3, поскольку известно о существовании цилиндрической дифференцировки в плоскоклеточных интраэпителиальных поражениях и плоскоклеточных карциномах шейки матки в виде выявленного продуцирования муцина или построения железоподобных структур [8]. Описаны случаи продуцирования муцина плоскоклеточными карциномами [9]. Диагноз в этих случаях ставился на основании гистологических признаков: положительное окрашивание на слизь цитоплазмы клеток и отсутствие палисадных структур на периферии опухоли [10]. Позднее часть этих опухолей реклассифицировали в аденосквамозную карциному, многие исследователи не исключали возможности спорадического образования слизи в плоскоклеточных карциномах. Известно о продукции муцина в CIN3, в связи с этим учеными высказывалось предположение о предшествовании этих муцинпродуцирующих CIN3 аденосквамозной карциноме, которое впоследствии не получило подтверждения [11].

При проведении иммуногистохимического исследования в образцах SMILE, мы, как и J. Park и соавт., установили высокую экспрессию Ki-67, подтверждающую неопластический характер, а не скопление доброкачественных эндоцервикальных клеток; очаговая экспрессия р63 в базальном отделе в отличие от диффузной экспрессии р63 в HSIL позволяет отнести данное интраэпителиальное поражение в отдельную группу [2]. Полученные результаты иммуногистохимического исследования экспрессии р16Ink4a не отличаются от данных D. Boyle и соавт., согласно которым в образцах SMILE обнаруживается диффузная иммунореактивность в отношении этого маркера с вовлечением базального отдела и распространением на все вышележащие пласты поражения, что свидетельствует об ассоциации с высокоонкогенными типами вируса папилломы человека (ВПЧ) [4].

Обнаруженная экспрессия р53 в образцах SMILE также указывает на связь с высокоонкогенными типами ВПЧ. Как известно, р53 представляет собой опухолевый супрессор, его связывание с HPV Е6 препятствует возможности остановки клетки в G₁-фазе клеточного цикла при наличии повреждений ДНК или нарушении клеточной пролиферации и их исправлению перед следующим циклом синтеза ДНК. По данным литературы, позитивная экспрессия р53 выявлена в 25% наблюдений CIN и 64% плоскоклеточных карцином [12].

Экспрессия СК15 свидетельствует о способности к многослойному строению. Так, ее выявление в резервных эндоцервикальных клетках предопределяет их дальнейшую трансформацию в метапластический эпителий. Вместе с тем экспрессия СК15 наблюдается в половине неороговевающих плоскоклеточных карцином и большинстве аденокарцином. Таким образом, обнаруженная очаговая экспрессия СК15 в SMILE, хотя и не может использоваться при дифференциальной диагностике SMILE, CIN и AIS, возможно, подтверждает сочетание в SMILE плоскоклеточной и эндоцервикальной дифференцировки вследствие возникновения из мультипотентной стволовой клетки [13].

На развитие SMILE из мультипотентной стволовой клетки указывают многие ученые. В своей работе J. Park и соавт. [14] доложили о клинических наблюдениях, имеющих одновременно цилиндрическую и плоскоклеточную дифференцировку, варьирующую от отдельных плоскоклеточных (CIN3) и эндоцервикальных (AIS) компонентов до поражений, представляющих переход стволовой клетки к плоскоклеточной и эндоцервикальной дифференцировке. С. Crum и соавт. [15] сообщили, что экспрессия маркеров базальных/плоских клеток в ядрах клеток, прилежащих к низкодифференцированным аденокарциномам in situ, также, по-видимому, указывает на мультипотентность базально-расположенных неопластических клеток, из которых могут возникать в том числе и эти «смешанные» опухоли.

Аналогичные данные получили М. Herf и соавт. [16], при сравнении иммунофенотипа клеток переходной зоны пре- и постнаталов женского пола, мышей и половозрелых женщин было обнаружено, что в начале жизни стволовые клетки располагаются равномерно во всей шейке матки, впоследствии их число уменьшается, и в репродуктивном периоде они концентрируются в переходной зоне шейки матки. Во всех изученных авторами образцах наблюдалась трансформация кубических стволовых клеток в метапластические базальные/резервные клетки, которая сопровождалась утратой иммунофенотипа клеток переходной зоны. Подобное выявлено в CIN3 и позволяет предположить, что инфицирование стволовых кубических клеток переходной зоны инициирует возникновение более агрессивного поражения.

В настоящей работе представлены 2 наблюдения SMILE, сопутствующие CIN3, имеющие морфологическое и иммуногистохимическое сходство с CIN3: многослойное строение, аналогичную экспрессию Кi-67, р16Ink4a и р53. Отличительными особенностями явились наличие внутриклеточного муцина, обнаруженное при окрашивании муцикармином, и слабая очаговая экспрессия р63 в базальном отделе SMILE. Следует отметить, что окончательно диагноз SMILE может быть поставлен только при применении иммуногистохимического исследования, так как при гистохимическом исследовании участков, подозрительных в отношении SMILE, были окрашены позитивно только 13% (7 из 53), в то время как соответствующий SMILE иммунофенотип имели только 29% (2 из 7). Данные особенности должны быть учтены в производственно-диагностической работе клинических патологов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.В.Ш., А.В.А., Л.С.Е., А.В.К.

Сбор и обработка материала: М.В.Ш., А.В.А., Л.С.Е., Н.М.Ф., М.Р.Д., А.В.К.

Написание текста: М.В.Ш.

Редактирование: А.В.А., Л.С.Е., А.В.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.