Актуальными проблемами детской андрологии являются профилактика и предотвращение мужского бесплодия. Известно, что истоки мужского бесплодия часто закладываются в детском возрасте, а более 60% перинатальной патологии возникает еще в антенатальном периоде. Основной причиной ее развития является плацентарная недостаточность, приводящая к гипоксии и задержке развития плода.

Многочисленными исследованиями [1, 2] установлено, что ткани яичек имеют высокую чувствительность к гипоксии. Возникая во время беременности и родов, гипоксия вызывает системные повреждения, отрицательно влияет на формирование и созревание органов и систем плода. Особое значение имеет повреждение половой системы в антенатальном периоде, так как последствия этого могут быть необратимы и привести к недоразвитию фетального яичка и в дальнейшем отрицательно повлиять на репродуктивную функцию [3].

Влияние хронической гипоксии на становление репродуктивной системы в условиях эксперимента изучали разные исследователи. Ими установлено снижение массы яичек новорожденных крысят по сравнению с контролем. При гистологическом исследовании отмечали уменьшение размера канальцев, интерстициальный отек и разрастание межканальцевой соединительной ткани, дистрофические изменения и нарушение функциональной активности клеток Лейдига [1—3].

Доказано, что на тканевом уровне гипоксия вызывает неоваскуляризацию, или ангиогенез. Данный процесс обусловлен серией реакций, включающих пролиферацию, дифференцировку и миграцию эндотелиальных клеток, и регулируется сосудистыми факторами роста, например сосудистым эндотелиальным фактором роста [4].

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является ключевым регулятором роста и проницаемости эндотелия. Однако имеются данные [5—7] об экспрессии VEGF и в неэндотелиальных клетках, например в клетках трофобласта, сердечно-сосудистой системе, а также в ткани яичек.

В литературе [8, 9] имеются немногочисленные работы об экспрессии VEGF в ткани яичек, где авторы высказывают предположение, что VEGF влияет на пролиферацию клеток Лейдига и повышение уровня тестостерона, тем самым играя роль в регулировании мужской фертильности.

Исследования влияния гипоксии на формирование патологии репродуктивной системы проводили в основном в эксперименте [1—10], тогда как морфологические исследования, посвященные изучению изменений яичек плодов человека под влиянием хронической внутриутробной гипоксии, практически отсутствуют.

Цель исследования — выявить морфологические особенности и изучить экспрессию васкулоэндотелиального фактора роста в яичках плодов, подвергшихся влиянию хронической внутриутробной гипоксии при патологическом течении беременности на разных сроках гестации.

Проведена морфологическая оценка яичек 48 плодов мужского пола, полученных от матерей с патологическим течением беременности (секционный материал). Во всех 48 случаях диагностирована хроническая фетоплацентарная недостаточность.

Все исследуемые случаи разделили на три группы: 1-я группа — плоды при сроке гестации 19—22 нед — 23 случая, 2-я группа — при сроке гестации 23—25 нед — 16, 3-я группа — 26—29 нед — 9.

Полученный материал после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина и проводки по спиртам возрастающей концентрации заливали в парафин. Изготавливали серийные срезы толщиной 4—5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрический анализ гистологических препаратов и фотографирование проводили с помощью микровизора медицинского проходящего света µVizo-101 (ЛОМО).

В 10 полях зрения каждого случая при увеличении 246,4 и 774 проводили подсчет следующих показателей: количество канальцев, клеток в канальцах, сосудов в строме, клеток Лейдига, диаметра канальцев и высоты клеток в канальцах.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод. После депарафинизации и регидратации парафиновых срезов проводили ИГХ-исследование согласно протоколу ИГХ-окрашивания. В качестве системы визуализации использовали REVEAL-Biotin-Free Polyvalent DAB («Spring Bioscience», США). В работе использовали моноклональное мышиное антитело к Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (разведение 1:20).

Оценка ИГХ-реакций базировалась на визуальной оценке интенсивности окрашивания клеток.

У всех пациенток получено информированное согласие на участие в исследовании согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WMA Declaration of Helsinki — Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование одобрено комиссией по вопросам биоэтики университета.

При статистическом анализе полученных результатов использовали пакеты компьютерных программ IBM SPSS Statistics 24.0, Microsoft Office Excel 2007.

Процедуры статистического анализа выполняли с помощью программы IBM SPSS Statistics 24.0. При проверке выборочных совокупностей исследуемых величин на нормальность распределения по методу Колмогорова—Смирнова выявлено, что распределение исследуемых параметров отличается от нормального, поэтому для анализа количественных признаков использовали методы непараметрической статистики с расчетом медианы и межквартильного размаха. Множественные сравнения проводили с помощью аналога дисперсионного анализа для непараметрических распределений — критерия Краскела—Уоллиса. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

При обзорной световой микроскопии в сроки 19—22 нед ткань яичек представляла собой скопление канальцев и рыхлой соединительной межуточной ткани (рис. 1, а,

При сроке гестации 23—25 нед наблюдали выраженный фиброз стромы и уменьшение площади канальцев (медиана площади канальцев — 0,0065, медиана площади стромы — 0,0127) (см. таблицу) по сравнению с более ранним периодом гестации (см. рис. 1, в, г). Разделения ткани яичка на дольки не наблюдали.

При морфометрическом анализе выявлено увеличение количества канальцев до 25-й недели гестации, а далее этот показатель оставался практически неизменным (в 19—22 нед медиана — 15, в 23—25 нед — 21,5, в 26—29 нед — 21 в поле зрения (см. таблицу).

На 26—29-й неделе антенатального периода отмечали уменьшение расстояния между извитыми семенными канальцами (см. рис. 1, д, е). Однако, несмотря на сближение семенных канальцев, фиброз стромы значительно выражен и при анализе морфометрических данных установлено, что стромальный компонент преобладает (медиана площади стромы — 0,0120, медиана площади канальцев — 0,009) (см. таблицу). Также наблюдали уменьшение количества клеток в просвете канальцев (медиана — 26 в поле зрения) (см. таблицу) по сравнению с более ранним периодом гестации.

В нашем исследовании количество сосудов до 25-й недели гестации практически не изменилось, максимальное количество сосудов зафиксировано при сроке 26—29 нед (медиана 12) (см. таблицу). При количественном анализе клеток Лейдига максимальный показатель также определен при сроке 26—29 нед (медиана 11) (см. таблицу).

При анализе данных ИГХ-исследования наблюдали выраженную цитоплазматическую экспрессию VEGF в ткани яичек в разные сроки гестации в клетках сперматогенного эпителия, сосудах, интерстициальных клетках Лейдига, причем максимальную экспрессию данного рецептора наблюдали в сроки 19—25 нед гестации, при сроке 26—29 нед степень выраженности экспрессии уменьшалась (рис. 2).

По результатам непараметрического теста Краскела—Уоллиса выявлены достоверные различия во всех трех группах по следующим параметрам: площадь канальцев (р<0,0001), площадь стромы (р<0,0001), диаметр канальцев (р<0,0001), количество сосудов (р<0,005), количество клеток в канальцах (р<0,0001).

Анализ результатов исследования позволил установить, что описанная гистологическая картина строения яичек плодов 19—22 нед гестации не соответствует возрастной норме и свидетельствует о задержке развития. Так, по данным литературы [11], такое строение сперматогенного эпителия соответствует яичкам плодов 14–16-недельного возраста.

Согласно исследованиям других авторов [11, 12], при увеличении срока гестации увеличивается количество канальцев и в 24 нед у плода хорошо различимо деление яичка на дольки. В нашем исследовании количество канальцев увеличивалось до 25-й недели гестации, а далее оставалось практически неизменным, при сроке гестации 23—25 нед разделения на дольки не наблюдалось, что также свидетельствует о задержке развития канальцевого аппарата вследствие действия патологических факторов, и в первую очередь гипоксии.

По данным M. Padmini и соавт. [11], с увеличением срока гестации интерстициальная ткань почти исчезает, хорошо развита васкуляризация, семенные канальцы близко располагаются друг к другу, так как длина канальцев увеличивается, а клетки Лейдига уменьшаются и претерпевают инволютивные изменения.

В нашем исследовании при сроке гестации 23—25 нед наблюдались выраженный фиброз стромы и уменьшение площади канальцев по сравнению с более ранним периодом гестации.

Согласно данным литературы [12], для периода 26—29 нед характерно увеличение количества гоноцитов в просвете канальцев. В нашем исследовании наблюдалось уменьшение количества клеток в просвете канальцев, что обусловлено, по всей видимости, дестабилизирующим влиянием хронической гипоксии на процессы пролиферации сперматогенного эпителия.

По данным литературы [11], наибольшее количество клеток Лейдига наблюдается между 17-й и 19-й неделями гестации, после этого количество их уменьшается. В нашем материале максимальное количество клеток Лейдига наблюдали в 26—29 нед.

При ИГХ-исследовании наблюдали выраженную цитоплазматическую экспрессию VEGF в ткани яичек в разные сроки гестации в клетках сперматогенного эпителия, сосудах, интерстициальных клетках Лейдига, причем максимальная экспрессия данного рецептора наблюдалась в сроки 19—25 нед гестации, при сроке 26—29 нед экспрессия уменьшалась. Наши данные согласуются с данными других авторов [9], которыми отмечено, что, помимо повышения сосудистой проницаемости, VEGF оказывает влияние на пролиферацию клеток Лейдига.

Это позволяет предположить, что VEGF не только является активатором ангиогенеза, но и может играть определенную роль в формировании мужской фертильности.

Внутриутробная гипоксия оказывает дестабилизирующее влияние на процессы пролиферации и дифференцировки сперматогенного эпителия, интерстициальных эндокриноцитов, активирует процессы ангиогенеза и рост соединительной ткани. Все это может повлечь не только аномальное формировние гонад, но и в дальнейшем нарушение репродуктивной функции.

Показано, что гипоксия стимулирует экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста, рецепторы которого (VEGFR) присутствуют почти во всех популяциях тестикулярных клеток. Можно предположить, что VEGF, помимо индуктора ангиогенеза, может выступать в качестве паракринного регулятора активности клеток Лейдига и тем самым играть определенную роль в становлении мужской фертильности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г. Н.М., А.Б.Б., Т.В.П.

Сбор и обработка материала — А.В.М., Е.С.В.

Статистическая обработка — Т.В.П.

Написание текста — Т.В.П.

Редактирование — Г. Н.М., А.Б.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Палатова Татьяна Васильевна — ассистент каф. патологической анатомии; https://orcid.org/0000-0002-3889-5052; e-mail: iamnot88@bk.ru