В октябре 2017 г. вышла из печати новая редакция 4-го издания Классификации ВОЗ (2017) опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани [1]. После выхода 4-го издания классификации (2008) за последние годы в научной литературе накоплены новые данные о молекулярном патогенезе клональных миелоидных неоплазий, что позволило разработать новые подходы к диагностике, прогнозу заболевания и лечению с использованием так называемой таргетной терапии. Как и предыдущие издания, новая редакция Классификации ВОЗ базируется на комплексе анамнестических, клинических, лабораторных, цитоморфологических, цитохимических, гистологических, иммунофенотипических, цитогенетических и молекулярно-генетических характеристик для установления той или иной нозологической формы. Диагностическая значимость гистологического метода исследования трепанобиоптата костного мозга для разных нозологий различна. В новой редакции 4-го издания ВОЗ (2017) произошли значительные изменения в разделе патоморфологической диагностики Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (Ph-МПЗ) с учетом высокого уровня воспроизводимости разработанных критериев (76—88%) [2, 3]. Гистологическое исследование трепанобиоптата костного мозга введено в большие критерии диагностики для каждой нозологии в рамках группы Ph-МПЗ. Объем диагностического материала трепанобиоптата костного мозга крайне важен для проведения дифференциальной диагностики. Так, во введении к разделу «Миелоидные неоплазии» в новой редакции ВОЗ [1] регламентируется длина диагностического фрагмента губчатой костной ткани не менее 1,5 см, рекомендуется исследование не менее 10 сохранных костномозговых полостей. При исследовании трепанобиоптата костного мозга необходимо охарактеризовать клеточность кроветворной ткани (относительно возрастной нормы), возможное наличие неравномерности ее распределения («patch»), гистотопографии ростков миелопоза, сохранность или нарушение дифференцировки/созревания клеточных элементов 3 ростков миелопоэза, наличие изменений стромы (отек, серозная атрофия, ретикулиновый, коллагеновый фиброз), остеосклероз костных балок, наличие/отсутствие лимфоидной инфильтрации и ее характер, признаки гемосидероза.
Для миелодиспластических синдромов (МДС) патоморфологическое исследование костного мозга является одним из звеньев комплексной диагностики, основанной прежде всего на исключении иной этиологии цитопений. Необходимым условием для постановки диагноза МДС, как и острых лейкозов, является цитологическое исследование мазков крови (подсчет 200 клеток) и аспирата костного мозга (подсчет 500 клеток).
Пересмотренная Классификация ВОЗ опухолей кроветворной и лимфоидной ткани (2017) представлена в табл. 1.
1. Миелопролиферативные заболевания
Учитывая лингвистические особенности и традиции русскоязычного перевода, многолетнюю сложившуюся гематологическую и гематопатологическую практику с традиционным использованием термина «хронические миелопролиферативные заболевания», представляется целесообразным использовать в русскоязычной литературе для данной группы заболеваний термин «миелопролиферативные заболевания» вместо «миелопролиферативные неоплазии/опухоли».
Изменения последовательности ДНК, называемые драйверными мутациями (driver mutations), придают пролиферативные преимущества клеточной популяции, что имеет онкогенный потенциал. Некоторые драйверные мутации наследуются в зародышевой линии, но большинство возникает в соматических клетках в течение жизни, вместе со многими мутациями-«пассажирами» (passenger mutations), не определяющими развитие опухоли/неоплазии. К драйверным диагностическим мутациям при Ph-МПЗ относятся мутации JAK2, MPL, Calreticulin (CALR), что биологически определяет эту группу миелоидных неоплазий в сочетании с цитозами, морфологическими особенностями в трепанобиоптатах костного мозга, другими клиническими признаками (плетора, наличие артериальных и венозных тромбозов, спленомегалия и анемия при первичном миелофиброзе). В настоящее время существуют трипл-негативные случаи эссенциальной тромбоцитемии, первичного миелофиброза, прогноз этих заболеваний при трипл-негативном статусе уточняется. Соматические мутации ASXL1, TET2, EZH2, IDH½, SRSF2, SF3B1 имеют прогностическое значение и используются для верификации клональности МПЗ при трипл-негативных случаях Ph-МПЗ.
Для истинной полицитемии введены новые референсные значения Hb, Ht, позволяющие избежать гиподиагностики истинной полицитемии. Определение степени ретикулинового фиброза имеет важное прогностическое значение, что обосновывает выполнение трепанобиопсии костного мозга даже в случаях развернутой клинической и гематологической картины истинной полицитемии. Ниже приведены критерии для диагностики истинной полицитемии [1].
Большие критерии
1. Hb более 16,5 г/мл для мужчин, Hb более 16,0 г/мл для женщин, или Ht более 0,49% для мужчин, Ht более 0,48% для женщин, или увеличение массы циркулирующих эритроцитов (RCM) более чем на 25% выше референсного значения.
2. Гистологическое исследование костного мозга с гиперплазией всех ростков миелопоэза, пролиферация полимфорных различных по размеру мегакариоцитов со зрелой морфологией.
3. Мутация JAK2
Малый критерий
Субнормальный уровень EPO.
Для установления диагноза истинной полицитемии необходимо наличие 3 больших критериев, или первые 2 большие и 1 малый критерий.
При уровне Hb более 18,5 г/л, Ht 55,5% у мужчин и Hb более 16,5 г/л, Ht более 49,5% у женщин допускается отказ от трепанобиопсии костного мозга. Вместе с тем оценка ретикулинового фиброза стромы при гистологическом исследовании трепанобиоптата костного мозга имеет прогностическое значение — повышенный риск трансформации в постполицитемический миелофиброз (около 20% пациентов).
Критерии диагностики эссенциальной тромбоцитемии [1] включают:
Большие критерии
1. Количество тромбоцитов 450·109/л и более.
2. При гистологическом исследовании костного мозга — пролиферация крупных мегакариоцитов со зрелой морфологией с гиперлобулярными ядрами без выраженного увеличения или омоложения гранулоцитарного и эритроидного ростков миелопоэза.
3. Отсутствие критериев для BCR-ABL1+ ХМЛ, истинной полицитемии, первичного миелофиброза или других миелоидных опухолей.
4. Мутации JAK2, CALR или MPL.
Малый критерий
Наличие клонального маркера или исключение реактивного тромбоцитоза.
Диагноз эссенциальной тромбоцитемии требует наличия всех больших критериев или первых 3 больших критериев и 1 малого критерия.
В пересмотренной Классификации ВОЗ (2017) [1] подчеркивается важность дифференциальной диагностики эссенциальной тромбоцитемии и префиброзной/ранней стадии первичного миелофиброза с обязательной характеристикой степени ретикулинового фиброза по Европейской системе градации (табл. 2).
В пересмотренной Классификации ВОЗ (2017) для первичного миелофиброза введены 2 стадии: префиброзная/ранняя и фиброзная (развернутая) с соответствующими большими и малыми критериями. При наличии степени ретикулинового фиброза MF >1 рекомендуется проводить гистохимическую окраску по Массону и оценку коллагенового фиброза (табл. 3).
В табл. 4 сопоставлены
Нозологическая форма «Миелопролиферативное заболевание, неклассифицируемое» устанавливается при наличии несомненных клинических и лабораторных признаков МПЗ и отсутствии критериев, удовлетворяющих какой-либо специфической нозологии из группы Ph-МПЗ. Данная нозологическая форма в большинстве случаев используется при первичной диагностике ранних стадий Ph-МПЗ или диагностике на стадии миелофиброза/остеосклероза, или на стадии трансформации МПЗ в более агрессивную стадию с увеличенным количеством бластов (в гемограмме/миелограмме) при отсутствии анамнестических данных о наличии МПЗ и предыдущих исследований трепанобиоптатов костного мозга. При этом обязательным является исключение BCR-ABL1+ ХМЛ и заболевания из группы миелоидных/лимфоидных опухолей с реаранжировками PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, PCM1-JAK2 при проведении молекулярных исследований.
2. Мастоцитозы
В новой редакции ВОЗ (2017) группа мастоцитозов выведена из группы МПЗ в связи с их агрессивным клиническим течением. Гистогенез из общей костномозговой миелоидной клетки-предшественницы с дальнейшей миграцией и дифференцировкой в органах и тканях (кожа, слизистые оболочки дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта) отличает мастоциты (тучные клетки) от клеток гранулоцитарного ряда с базофильной дифференцировкой. В части случаев пролиферация мастоцитов сопровождает другие гематологические заболевания. Морфологические признаки мастоцитозов чрезвычайно разнообразны. При окраске по Гимзе/азуром не всегда видны цитоплазматические базофильные гранулы, атипия мастоцитов может имитировать другие опухоли и предполагает расширение ИГХ-исследования для верификации диагноза.
Среди мастоцитозов выделяют:
Кожный мастоцитоз
Системный мастоцитоз:
— индолетный,
— «тлеющий»,
— агрессивный мастоцитоз,
— системный мастоцитоз, ассоциированный с другими гематологическими заболеваниями (миелодиспластические синдромы, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелопролиферативные заболевания), острые миелоидные лейкозы,
— тучноклеточный лейкоз.
Мастоклеточную саркому
3. Миелоидные/лимфоидные опухоли с эозинофилией и реаранжировками генов
Эта группа заболеваний протекает с гиперэозинофилией (более 1,5·109/л), требует исключения реактивных эозинофилий. Морфологическая картина в трепанобиоптатах костного мозга чрезвычайно полиморфна и может носить черты хронического эозинофильного лейкоза, неуточненного (NOS), МПЗ с выраженной эозинофильной дифференцировкой и преобладанием клеток промежуточного пула с псевдопельгероидными формами, в части случаев в дебюте может быть диагностирован острый лимфобластный лейкоз (В- или Т-клеточный).
В данную группу включены:
— миелоидная/лимфоидная опухоль с реаранжировкой PDGFRA,
— миелоидная/лимфоидная опухоль с реаранжировкой PDGFRB,
— миелоидная/лимфоидная опухоль с реаранжировкой FGFR1,
— миелоидная/лимфоидная опухоль с реаранжировкой PCM1-JAK2.
Выявление соответствующих реаранжировок генов является определяющим критерием для нозологических форм данной группы.
4. Миелодиспластические синдромы
МДС — группа клональных миелоидных заболеваний, характеризующихся цитопенией, неэффективным гемопоэзом, морфологическими признаками дисплазии, возможностью трансформации в острый миелоидный лейкоз. МДС — это наиболее частое гематологическое заболевание миелоидной природы [6, 7]. В новой редакции ВОЗ (2017) в разделе МДС термин «рефрактерная анемия/цитопения» заменен на «миелодиспластический синдром», тем самым подчеркивается важность морфологических признаков дисплазии миелопоэза и количества бластных клеток, а не самого факта цитопении, что является неотъемлемым лабораторным признаком МДС, но не всегда коррелирующим с дисплазией соответствующей клеточной линии дифференцировки миелопоэза.
Новые молекулярные технологии NGS (next generation sequence), основанные на массивном параллельном секвенировании однонитевых библиотек фрагментированной ДНК образцов ткани/крови, позволили приблизиться к пониманию молекулярных основ патогенеза миелоидных неоплазий как модели клональной эволюции: клональный гемопоэз неопределенного потенциала (CHIP) — цитопении, ассоциированные с клональными мутациями (CCUS), МДС — острый миелоидный лейкоз. Накопление неблагоприятных соматических мутаций при МПЗ определяет риск трансформации в МДС или вторичный острый миелоидный лейкоз. Схематично этапы клональной эволюции можно изложить следующим образом: стволовая кроветворная клетка с CD90+, CD34+, CD38–, CD45RA– может приобретать соматические мутации генов, участвующих в эпигенетической регуляции TET2, DNMT3A, далее происходит клональная экспансия коммитированных клеток-предшественниц с высоким пролиферативным потенциалом и приобретением дополнительных мутаций, что приводит к вытестению нормального пула коммитированных клеток и формированию субстрата МДС с приобретением соответствующих клинических и лабораторных признаков. Клональный гемопоэз неопределенного потенциала (CHIP) детерминирован 2% мутантной аллельной фракцией и отсутствием у пациента признаков гематологического заболевания/цитопении, для CHIP наиболее характерны мутации DNMT3A, TET2, SF3B1. Расчетный риск развития гематологического заболевания при CHIP составляет 0,5—1% в год и сопоставим с моноклональным В-клеточным лимфоцитозом (MBL), моноклональной гаммапатией неопределенного значения (MGUS). Установлено, что до 35% пациентов с идиопатической цитопенией неопределенного значения (ICUS) имеют соматические мутации генов без морфологических или цитогенетических признаков МДС [8]. CHIP может быть выявлен у 10% пациентов в возрасте старше 65 лет и у 20% в возрасте старше 90 лет [9—11]. Интересно, что при апластической анемии в части случаев обнаружены мутации, характерные для CHIP, такие как DNMT3A, ASXL1 [12]. Вместе с тем известно, что эти мутации обладают неблагоприятным прогнозом при МДС, МПЗ.
Принцип клональной эволюции является базовой позицией для новой редакции Классификации ВОЗ (2017). Введение в Классификацию новых молекулярно-генетических данных о соматических мутациях при миелоидных неоплазиях и острых лейкозах имеет целью создание новых прогностических индексов, использование таргетных ингибиторов мутированных генов (гипометилирующие препараты, анти-IDH½— и анти-EZH2-ингибиторы и другие «малые молекулы» таргетной терапии). Необходимо отметить, что мутации TET2, DNMT3A, участвующие в метилировании ДНК, возникающие на ранних этапах коммитированной кроветворной клетки и характерные для CHIP, могут встречаться при лимфомах, а mutSF3B1 — при В-ХЛЛ, что свидетельствует о наличии общей коммитированной кроветворной клетки-предшественницы с потенциалом мультилинейной дифференцировки [13, 14].
В настоящее время выделяют следующие основные группы генов, участвующие и определяющие патогенез миелоидных опухолей:
1) гены, участвующие в эпигенетической регуляции: TET2, ASXL1, DNMT3A, EZH2,BCOR (коэкспрессор BCL-6), IDH2, IDH1, BCORL, ATRX;
2) гены, участвующие в сплайсинге РНК: SF3B1, SRSF2, U2AF1, ZRSR2, LUC7L2, U2AF2, PRPF8, SF1;
3) миелоидные транскрипционные факторы: RUNX1, CUX1, ETV6, NPM1, ATA2, WT1, CEBPA;
4) гены — опухолевые супрессоры: TP53, PHF6;
5) гены, участвующие в сигнальных путях: JAK2, NF1, NRAS, CBL, MPL, KRAS, FLT3, GNAS, KIT, PTPN11, GNB1, другие — BRCC3, ATM, FANCL, PIGA (при пароксизмальной ночной гемоглобинурии);
6) гены мультибелкового когезиного комплекса, управляющие трехмерной структурой хроматина, имеющие ключевое значение в репарации ДНК, в когезии и сегрегации хромосом во время клеточного деления (митоза/мейоза): STAG2, RAD221, SMC1, SMC2.
В патогенезе МДС участвует более 50 генов, среди них 6 генов встречаются наиболее часто (табл. 5).
Завершая раздел новых молекулярно-генетических данных, следует резюмировать:
1. Соматические мутации в отличие от молекулярных маркеров при Ph+ МПЗ и Ph-МПЗ не имеют специфичности, на сегодняшний день их диагностическая значимость для МДС не определена, за исключением мутации SF3B1, наличие которой при МДС позволяет установить диагноз МДС с кольцевыми сидеробластами и унилинейной или мультилинейной дисплазией даже при наличии кольцевидных сидеробластов 5% и более. Выявлены устойчивые соматические мутации 6/40 генов примерно в 10% МДС, а до 90% случаев МДС имеют одну или несколько соматических мутаций.
2. Соматические мутации генов TET2, DNMT3a, ANSXL1, участвующих в эпигенетической регуляции, при МДС определяются на уровне популяционной частоты и неспецифичны (встречаются при миелоидных и лимфоидных опухолях).
3. Для диагностики МДС более чувствительны соматические мутации генов, участвующих в сплайсинге РНК, –SRSF2, U2AF1, SF3B1; транскрипционной регуляции – RUNX1, репарации ДНК — P53.
4. При наличии ICUS важны мутантная аллельная частота (VAF 30—40%), группа и количество (2 и более) мутированных генов, возраст пациента.
Переходя к комплексной диагностике, следует еще раз подчеркнуть, что наличие, длительность цитопений, исключение других причин цитопений, цитологическое исследование костного мозга/крови, цитогенетическое исследование являются базовыми для диагностики МДС. Вместе с тем наличие генетических аномалий +8, –Y, или del (20q) не является определяющим для диагноза МДС без морфологических признаков дисплазии. В настоящее время иммуногистохимическое исследование трепанобиоптатов костного мозга с полуколичественным определением CD34+ клеток-предшественниц, метод проточной цитометрии для выявления аберрантного иммунофенотипа клеток гранулоцитарного и эритроидного ростков являются дополнительными методами, а молекулярно-генетические исследования (выявление соматических мутаций генов путем таргетного секвенирования) не имеют диагностического значения (за исключением mut SF3B1) и используются как факторы прогноза и доказательства клональности гемопоэза.
При гистологическом исследовании трепанобиоптата костного мозга для субстрата МДС в патоморфологическом описании необходимо указать на наналичие/отсутствие фиброза стромы, лимфоидных очажков, определить клеточность кроветворной ткани (относительно возрастной нормы), что необходимо для выделения гипопластического варианта МДС, при котором эффективна иммуносупрессивная терапия. Гистологически оцениваются признаки дисплазии 2 ростков миелопоэза: мегакариоцитарного (монобилобулярные формы, клетки с фрагментированными ядрами, микроформы), эритроидного ростка («блок» дифференцировки эритроидного ростка, морфологические признаки апоптоза эритрокариоцитов, атипичные митозы). Признаки дисгранулоцитопоэза оцениваются, как правило, при цитологическом исследовании.
Нововведением пересмотренной Классификации в разделе МДС является пересчет количества бластов на все ядросодержашие клетки костного мозга в случае резкого расширения эритроидного ростка (50% и более всех ядросодержащих клеток костного мозга), в связи с чем подтип острого эритроидного лейкоза эритромиелоз (ВОЗ, 2008) практически полностью перешел в раздел МДС с избытком бластов.
5. Миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания (МДС/МПЗ)
Данная группа характеризуется сочетанием клинических признаков — пении и цитоза и признаков дисплазии и атипии при патоморфологическом исследовании, при отсутствии критериев и молекулярных данных, удовлетворяющих другим нозологиям МДС, BCR-ABL1+ ХМЛ и Ph-МПЗ.
К группе МДС/МПЗ относятся:
1. Хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ). Случаи трансформации МДС или Ph-МПЗ по типу ХММЛ исключены из данной нозологии. Необходимо исключение лейкемоидной реакции, реактивных моноцитозов (инфекционные, аутоиммунные заболевания, паранеопластические реакции), BCR-ABL1-позитивного ХМЛ с моноцитозом (химерный транскрипт p190), Ph-МПЗ c моноцитозом, МДС с моноцитозом. Выделяют диспластический тип ХММЛ (лейкоциты до 13·109/л) с преобладающими признаками дисплазии и пролиферативный тип ХММЛ с лейкоцитозом более 13·109/л, гиперклеточным костным мозгом с расширением гранулоцитарного ростка, признаками дисплазии и атипии мегакариоцитарного ростка. При диспластической фазе допустимо отсутствие абсолютного моноцитоза (моноциты более 1·109/л). Соответственно подсчету бластов в гемограмме/миелограмме в пересмотренной редакции ВОЗ (2017) [1] выделяют ХММЛ-0 (менее 2% бластов в крови, менее 5% в костном мозге), ХММЛ-1 (2—4% бластов в крови, 5—9% бластов в костном мозге), ХММЛ-2 (5—19% бластов в крови, 10—19% бластов в костном мозге). Обязательным условием является наличие устойчивого (в динамике) относительного моноцитоза 10% и более. При ХММЛ могут встречаться лимфаденопатия, гепатоспленомегалия, вовлечение других органов с морфологией экстрамедуллярного миелопоза.
2. Атипичный хронический миелоидный лейкоз, BCR-ABL1-негативный. Морфологическая картина, как правило, требует проведения дифференциальной диагностики с BCR-ABL1+ ХМЛ, лейкемоидной реакцией. Молекулярные исследования в данных случаях необходимы и является определяющими для исключения или установления диагноза BCR-ABL1+ ХМЛ. Для атипичного хронического миелоидного лейкоза характерны соматические мутации SETBP1 и/или ETNK1.
3. Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз. Чаще встречается у лиц мужского пола, возрастной диапазон 9—14 лет, 75% случаев диагностируется в возрасте до 3 лет. Среди генетических аномалий, характерных и преобладающих для данной нозологии, отмечаются мутация NF1 и ассоциация с нейрофиброматозом 1-го типа, соматические мутации PTPN11, KRAS, NRAS или герминальная мутация CBL. Обязательными условиями для диагноза являются: абсолютный моноцитоз более 1·109/л, исключение BCR-ABL1+ ХМЛ. Костный мозг характеризуется пролиферацией клеток гранулоцитарной и моноцитарной линий дифференцировки гранулоцитопоэза.
4. МДС/МПЗ с кольцевыми сидеробластами и тромбоцитозом. Эта нозология обрела самостоятельное значение по сравнению с Классификацией 2008 г. (предполагаемая нозологическая форма в 2008 г., 4-е изд.) благодаря устойчивым клиническо-лабораторным и молекулярным признакам: анемия, 15% и более кольцевых сидеробластов, тромбоцитоз 450‧109/л и более, частое сочетание мутаций SF3B1 и драйверных мутаций JAK2, Calreticulin, MPL, характерных для Ph-МПЗ. Условием диагноза является цитогенетическое/FISH-исследование для исключения миелодиспластического синдрома, ассоциированного с del (5q), протекающего с тромбоцитозом. Морфологически характерными являются гиперклеточный костный мозг за счет расширения эритроидного ростка с нерезко выраженными признаками дизэритропоэза, пролиферация мегакариоцитов с преобладанием признаков атипии.
5. МДС/МПЗ, неклассифицируемые.
Это сложная группа заболеваний, требующая осторожного и взвешенного применения, чтобы не превратить данную нозологию в «корзину» случаев с недостаточными для диагностики лабораторными и молекулярными данными при отсутствии анамнестических данных. Эта нозологическая форма используется при отсутствии в анамнезе у пациента признаков МПЗ (с трансформацией по типу МДС в процессе клональной эволюции), исключение других заболеваний из группы МДС/МПЗ, МПЗ и МДС (в том числе с del (5q)), исключение мутаций PDGFRA, PDGFRB, FGFR1, PCM1-JAK2.
Таким образом, новая редакция Классификации ВОЗ (2017) опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани в разделе «Миелоидные неоплазии» предполагает комплексную диагностику той или иной нозологической формы, включает новейшие данные по молекулярному патогенезу миелоидных заболеваний. В своей работе врачу-патологоанатому в связи с невозможностью использовать на практике данные таргетного секвенирования необходимо тесно взаимодействовать с клиницистами-гематологами, онкологами для анализа всей полноты анамнестических, клинико-лабораторных данных, при этом важна крайняя взвешенность патоморфологических описаний и заключений по материалу трепанобиоптатов костного мозга, биоптатов органов/тканей. При отсутствии достаточной клинической информации, или невозможности проведения гистохимических, иммуногистохимических исследований, или отсутствии опыта в патоморфологической диагностике гематологических/онкогематологических заболеваний целесообразно сделать лишь описание морфологической картины с рекомендацией дообследования пациента и повторным обследованием в динамике, уточнением характера процесса и нозологической формы в соответствующем специализированном медицинском учреждении.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Ковригина Алла Михайловна — e-mail: kovrigina.alla@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-1082-8659