Применение маркировочных красителей при патолого-анатомическом исследовании операционного материала

Авторы:
  • А. И. Храмцов
    Отдел патологии, Университет Розалинд Франклин, Чикаго, США
  • Г. Ф. Храмцова
    отдел онкологии и гематологии, Чикагский университет, Чикаго, США
  • З. П. Асауленко
    патолого-анатомическое отделение клинической молекулярной морфологии Клиники им. Э.Э. Эйхвальда Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
  • А. А. Селентьева
    патолого-анатомическое отделение клинической молекулярной морфологии Клиники им. Э.Э. Эйхвальда Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
  • И. Н. Спиридонов
    патолого-анатомическое отделение клинической молекулярной морфологии Клиники им. Э.Э. Эйхвальда Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
  • Р. В. Воробьев
    отдел общей патологии Патолого-анатомического бюро комитета по здравоохранению Ленинградской области, Санкт-Петербург, Россия
  • М. Н. Кузьмин
    патолого-анатомическое отделение Клинической больницы №122 им. Л.Г. Соколова ФМБА, Санкт-Петербург, Россия
  • Ю. А. Криволапов
    патолого-анатомическое отделение клинической молекулярной морфологии Клиники им. Э.Э. Эйхвальда Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
Журнал: Архив патологии. 2019;81(1): 40-45
Просмотрено: 1798 Скачано: 210

Гистологические маркировочные красители (МК) применяют для ориентации макропрепаратов и гистологических срезов, маркировки краев резекции с целью обнаружения роста опухоли в хирургическом крае, оценки расстояния от границы опухоли до границы хирургического образца и др. Перед отправлением операционного материала в патолого-анатомические отделения медицинских организаций хирурги анатомически его ориентируют с помощью лигатур, скоб, иногда с помощью красок. При макроскопическом исследовании полученного операционного материала врач-патологоанатом удаляет скобы и лигатуры, а края резекции окрашивает, чтобы они были различимы под оптическим микроскопом в гистологическом препарате [1, 2].

Производимые зарубежными компаниями МК удобны в использовании, но стоят дорого. В некоторых патолого-анатомических отделениях их успешно заменяют акриловыми красками для художников, тушью (India ink), альциановым синим (Alcian blue) [3—6]. Среди требований, предъявляемых к тканевым красителям, простота применения, высокие кроющие свойства, а также способность выдерживать гистологическую проводку ткани и сохранять первоначальный цвет при его определении под микроскопом.

Исследования, посвященные оценке точности распознавания МК при гистологическом исследовании препаратов, малочисленны [7].

Цель исследования — изучить и сравнить цвета МК зарубежного производства, экспериментальных МК и художественных акриловых красок в парафиновых блоках и гистологических препаратах, пригодность этих красителей для маркировки краев резекции.

Материал и методы

В операционном материале тестировали два набора красителей зарубежного производства: TMD, «Cancer Diagnostics, Inc», США (каталожный номер 03000), далее — «красители А», TMD, «General Data», США (каталожный номер TMD-KIT-FT-7×2), «красители Б» и одного набора ООО «БиоВитрум», Россия (каталожного номера нет), «опытные красители». Каждый из наборов включал красный, оранжевый, желтый, зеленый, синий, фиолетовый и черный цвета. Для исследования использовали ткань, полученную при тонзиллэктомии. Каждый кусочек миндалины после 24-часовой фиксации в 10% растворе нейтрального формалина высушивали бумажной салфеткой и маркировали отдельным цветом М.К. Через 5 мин на маркированный фрагмент ткани наносили 5% раствор уксусной кислоты в качестве закрепителя. В гистологическую кассету помещали 7 фрагментов миндалин, каждый кусочек был окрашен одним красителем определенного цвета из отдельного набора (рис. 1).

Рис. 1. Окрашенные разными цветами кусочки помещены в отдельные гистологические кассеты для проводки и залиты в отдельный парафиновый блок. а — кусочки ткани, окрашенные МК ООО «БиоВитрум»; б — кусочки ткани, окрашенные МК TMD, «Cancer Diagnostics, Inc»; в — кусочки ткани, окрашенные МК TMD, «General Data»; г — блок из кусочков, окрашенных МК ООО «БиоВитрум»; д — блок из кусочков, окрашенных МК TMD, «Cancer Diagnostics Inc.»; е — блок из кусочков, окрашенных МК TMD, «General Data».
Гистологическую проводку материала проводили по стандартному протоколу. Кусочки ткани, окрашенные МК из каждой кассеты, заливали в отдельный парафиновый блок и визуально оценивали цвета в застывшем парафине (рис. 2).
Рис. 2. Гистологические препараты ткани миндалины, маркированной при макроскопическом исследовании. а — желтым, б — красным, в — черным, г — зеленым, д — фиолетовым, е — синим цветом М.К. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.
Изготавливали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином.

Для изучения опытных МК и художественных акриловых красок маркировали фиксированные или нативные фрагменты скелетной мускулатуры, поджелудочной железы и толстой кишки, полученные при аутопсии. Ткани маркировали красителями до фиксации, после фиксации в 40% формалине длительностью 30 мин и 24 ч. Каждый краситель использовали для окрашивания одного образца ткани: черный, охра, синий, зеленый цвета — опытные МК (ООО «БиоВитрум», Россия); черный, синий, голубой, зеленый, желтый, охра, оранжевый, малиново-красный, фиолетовый цвета — художественные акриловые краски (DECOLA, Россия, каталожные номера: 4128810, 4128511, 4128507, 4128722, 4128220, 4128221, 4128315, 4128319, 4128334). Кусочки тканей, фиксированные в течение 30 мин, после высыхания краски на 24 ч возвращали в 10% раствор нейтрального формалина. Гистологическая обработка материала включала обезвоживание и просветление в Изопрепе (ООО «БиоВитрум», Россия, каталожный номер 06−002/M), пропитывание в парафине при 60 °C, заливку в парафиновый блок. Из парафиновых блоков на санном микротоме изготавливали срезы толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Хирургические и аутопсийные образцы анализировала группа исследователей. Каждая группа включала 7 человек, предварительно прошедших проверку цветового зрения по полихроматическим таблицам Рабкина. Участники исследования оценивали кроющую способность МК, их цвет в парафиновых блоках и гистологических препаратах.

Результаты

При исследовании хирургических образцов миндалин все эксперты безошибочно определили фиолетовый, черный и зеленый цвета. Синий цвет в каждом из трех наборов правильно распознали 6 экспертов. Желтый цвет МК из опытного набора определили безошибочно, из набора, А цвет точно назвали 5 экспертов. Красный цвет МК из опытного набора верно распознали 2 эксперта, из набора Б — все эксперты. Оранжевый цвет МК в каждом из наборов зарубежного производства правильно определили 4 эксперта. Три цвета: красный из набора А, желтый из набора Б и оранжевый опытный МК визуально выявляли после заливки ткани в парафин, но при исследовании под микроскопом все гистологические препараты оказывались обесцвеченными (см. рис. 2).

В аутопсийных образцах безошибочно определяли зеленую и малиново-красную художественные акриловые краски, во всех тканях и при любых условиях фиксации их цвет оставался неизменным. Черный и желтый цвета правильно распознали 5 и 4 эксперта соответственно.

Черный цвет в ряде случаев оценивали как коричневый или темно-коричневый, желтый — как светло-коричневый или темно-оранжевый. В тканях без фиксации черный и желтый цвета были светлее, чем в образцах, где фиксация применялась. Ни один их экспертов не смог правильно определить голубой, охру, оранжевый и фиолетовый красители, которые под микроскопом воспринимались как сине-зеленый, оранжевый или ярко-желтый, бордовый и розовый цвета соответственно. При микроскопическом исследовании на разных увеличениях определение темно-синего цвета в гистологических препаратах было затруднено из-за его слабого окрашивания. Из набора опытных красителей безошибочно определяли черный и синий цвета. Охру 6 исследователей из 7 назвали как краситель желтого цвета. Отмечены различия в восприятии тона зеленого красителя — правильно распознан 4 экспертами, в остальных случаях определялся как оттенок сине-зеленого цвета: цвет морской волны, бирюзовый, лазурный (рис. 3).

Рис. 3. Гистологические препараты, маркированные при макроскопическом исследовании художественными акриловыми красками. а — зеленый, б — малиново-красный, в — темно-синий; опытными красителями: г — черный, д — синий, е — охра. Окраска гематоксилином и эозином, а, б, в — ×200, г—е — ×100.

Обсуждение и практические рекомендации

С помощью МК возможно окрашивание оснований полипов, трассирование свищевых ходов, каналов по ходу прокола биопсийной иглой, а также перфоративных отверстий, ориентация вырезанных кусочков ткани при заливке в парафин, дифференциальная маркировка лимфатических узлов для верификации метастазов.

Результаты представленного исследования показали, что некоторые экспериментальные МК и художественные акриловые краски могут быть предложены в качестве замены МК зарубежного производства для научных исследований. Художественные акриловые краски не могут применяться в диагностической работе патолого-анатомических отделений медицинских организаций, так как не имеют государственной регистрации для использования в медицинских целях.

Цвет МК в гистологическом препарате может отличаться от цвета МК в парафиновом блоке. Поэтому, прежде чем использовать красители на клинических образцах, их необходимо протестировать.

Полезно использовать некоторые технические приемы окрашивания макропрепаратов. Перед нанесением красителя поверхность образца следует промокнуть насухо и отложить препарат на 5—10 мин до подсыхания. Для нанесения красителя часто используются деревянные палочки или палочки с накрученной на кончик ватой, художественные кисти. Для быстрой окраски больших поверхностей лучше использовать марлевые салфетки или тампоны, а для маркировки маленьких кусочков (биопсий) подходят заточенные деревянные палочки (зубочистки). Схема окраски макропрепарата должна быть подробно изложена в тексте протокола исследования.

При работе с МК неаккуратность в работе может привести к неточной или ложной интерпретации результатов исследования. Даже при соблюдении всех вышеперечисленных правил могут возникнуть ошибки при идентификации цвета МК под микроскопом, если приобретенные МК предварительно не тестировались на контрольных образцах.

Заключение

Некоторые изученные художественные акриловые красители (зеленая и малиново-красная краски) правильно распознаются под микроскопом и могут быть использованы для маркировки фрагментов тканей при гистологическом исследовании с целью их пространственной ориентации в парафиновом блоке и гистологическом препарате. Предлагаемые отечественным производителем маркировочные красители (черный и синий цвета) по своему качеству не уступают зарубежным аналогам и могут быть рекомендованы для маркировки краев иссеченных тканей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.И.Х., Г. Ф.Х., Ю.А.К.

Сбор и обработка материала: А.И.Х., Г. Ф.Х., З.П.А., А.А.С., И.Н.С., Р.В.В., М.Н.К.

Написание текста: А.И.Х., Г. Ф.Х., З.П.А.

Редактирование: Ю.А.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Асауленко Захар Павлович — e-mail: Zakhariy@list.ru; https://orcid.org/0000-0001-7062-065X; моб. тел. +7 (911) 129-36-10

Список литературы:

  1. Алиев М.Д., Бохян Б.Ю., Буров Д.А. Прогностическая роль края резекции в хирургии сарком мягких тканей. Практическая онкология. 2013;14(2):97-100.
  2. Подберезина Ю.Л., Синицын В.Е., Алексеевская Т.В., Иванов В.М. Контроль краев резекции в определении адекватности хирургического лечения «минимального» рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы. 2011;3:9-14.
  3. Birch PJ, Jeffrey MJ, Andrews MI. Alcian blue: reliable rapid method for marking resection margins. J Clin Pathol. 1990;43(7):608-609. https://doi.org/10.1136/jcp.43.7.608-b
  4. Chiam HW, Maslen PG, Hoffman GJ. Marking the surgical margins of specimens: commercial acrylic pigments are reliable, rapid and safe. Pathology. 2003;35(3):204-206.
  5. Milovancev M, Löhr CV, Bildfell RJ, Gelberg HB, Heidel JR, Valentine BA. A comparison of microscopic ink characteristics of 35 commercially available surgical margin inks. Vet Surg. 2013;42(8):901-908. https://doi.org/10.1111/j.1532-950x.2013.12069.x
  6. Salerno A, Trent R, Jackson PJ, Cook MG. A rapid and safe method to fix india ink on specimen resection margins. J Clin Pathol. 1995;48(7):689-690. https://doi.org/10.1136/jcp.48.7.689-c
  7. Williams AS, Hache KD. Recognition and discrimination of tissue-marking dye color by surgical pathologists: recommendations to avoid errors in margin assessment. Am J Clin Pathol. 2014;142(3):355-361. https://doi.org/10.1309/ajcpoxrmk15vcqtr