Вирусогенетическая теория возникновения опухолей была предложена акад. Л.А. Зильбером, и основной ее тезис состоял в том, что опухолевая трансформация клеток происходит в результате интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина, которая вследствие этого приобретает новые свойства. Л.А. Зильбер также ввел понятие «инфекционные» и «онкогенные» вирусы задолго до открытия большинства из них. Генетический материал онкогенных вирусов имеет высокую степень гомологии с участками ДНК клеток, которые являются мишенями этих вирусов; онкогенные вирусы не приводят к гибели клетки-хозяина и способны к внутриклеточной персистенции [1].

В последующем установлено, что онкогенность вируса определяют транскрипты его генов. Одним из таких транскриптов является латентный мембранный белок (LMP-1) вируса Эпшейна—Барр (EBV), способный встраиваться в мембрану клетки-хозяина и функционировать как псевдорецептор благодаря высокой гомологии с внутриклеточными доменами рецепторов TNF-α, что приводит к нарушениям процессов пролиферации и дифференцировки клеток [2]. Онкогенная роль LMP-1 считается доказанной для EBV-ассоциированных лимфомы Беркитта, лимфомы Ходжкина, экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы и др. [3]. Учитывая повсеместное распространение EBV, не исключена онкогенная роль LMP-1 и при других опухолях. Так, в классификации рака желудка был недавно выделен EBV-ассоциированный молекулярный подтип [4].

Рак желудка занимает 3-е место по смертности среди всех онкологических заболеваний в мире и Российской Федерации [5, 6]. Онкогенная роль белка LMP-1 в развитии рака желудка не доказана. Большинство исследований экспрессии LMP-1 при раке желудка было выполнено более 20 лет назад, в ходе их установлено, что LMP-1 экспрессируется в 0—5% случаев [7—11]. Последнее исследование [12] в этой области касается изучения взаимодействия LMP-1-позитивных и LMP-1-негативных клеток на культурах опухолевых клеток (линия AGS). Установлено, что экспрессия LMP-1 изменяет характер межклеточных взаимодействий при раке желудка [12].

Низкий уровень экспрессии LMP-1 при раке желудка ряд авторов [10] связывают с феноменом уклонения клеток от иммунного ответа. Также не исключена иммунологическая толерантность к LMP-1 по аналогии с таковой к поверхностному антигену гепатита B (HBsAg), персистенция которого обнаруживается и при отсутствии вирусной ДНК [13].

Не описана связь экспрессии LMP-1 с некоторыми классическими характеристиками рака желудка (глубина инвазии — T, количество метастазов в регионарных лимфатических узлах — N, наличие отдаленных метастазов — M, клиническая стадия, степень дифференцировки — G, гистологические типы); отсутствуют данные о характере экспрессии LMP-1 в прилежащих к опухоли участках слизистой оболочки обычного строения.

В исследование включены образцы операционного материала рака желудка от 67 пациентов. Важным критерием отбора парафиновых блоков было наличие в одном кусочке участков опухолевой ткани рака желудка с фрагментами железистого эпителия перитуморальной области. Половозрастные характеристики выборки пациентов представлены в табл. 1, распределение

Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, для постановки иммуногистохимических реакций использовали первичные мышиные моноклональные антитела к белку LMP-1 (клон CS1−4, «Dako», Дания). Депарафинирование и демаскировку антигенов проводили с помощью буфера Thermo Dewax и HIER BuferL (pH 6,0). Производителем рекомендован буфер с pH 9,0 для депарафинирования и демаскировки антигенов, однако при его использовании наблюдали выраженное фоновое окрашивание, вследствие чего был выбран буфер с pH 6,0. Окраску проводили с помощью иммуностейнера Autostainer 480S («Thermo Fisher Scientific», СШA).

Окрашивание на LMP-1 для всех 67 случаев осуществляли 2 раза. В качестве положительного контроля при каждой постановке реакции использовали образец назофарингеальной карциномы, который был любезно предоставлен профессором А.М. Ковригиной (патологоанатомическое отделение НМИЦ гематологии Минздрава России).

Результаты реакций оценивали с помощью светового микроскопа DM2500 («Leica Microsystems», Германия) двумя независимыми исследователями. Сканер SCN400 и микроскоп DM4000B/DFC495 («Leica Microsystems», Германия) использовали для получения микрофотографий.

Истинной положительной реакцией в эпителиальных клетках считается мембранная или гранулярная цитоплазматическая экспрессия LMP-1 [7, 14].

Использовали оригинальный метод оценки экспрессии LMP-1. Экспрессию в тканевом компартменте (опухолевая ткань или железистый эпителий перитуморальной области) считали положительной, если из выбранных 10 полей зрения при об. ×40 хотя бы в одном соотношение числа клеток с экспрессией LMP-1 и общего числа клеток превышало 10%.

Полученные результаты были сопоставлены с клинико-морфологическими характеристиками рака желудка: гистологический тип по классификации ВОЗ [15]; гистологический тип по классификации по P. Lauren [16, 17]; степень дифференцировки опухоли (G); глубина инвазии (T); количество метастазов в регионарных лимфатических узлах (N); наличие отдаленных метастазов (M); клиническая стадия опухоли; локализация опухоли.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета Statistica 10 («StatSoft Inc.», США). Для статистической обработки результатов использовали точный критерий Фишера, непараметрический U-критерий Манна—Уитни для попарного сравнения групп опухолей и критерий Краскела—Уоллиса для множественного сравнения.

По характеру экспрессии белка LMP-1 в опухолевой ткани и эпителии перитуморальной области исследуемые случаи были разделены на три группы:

— LMP-1-позитивные опухоли — 9 случаев из 67 (положительное окрашивание опухоли и отсутствие окрашивания эпителия перитуморальной области);

— LMP-1-негативные опухоли — 32 случая из 67 (отрицательное окрашивание опухоли и отсутствие окрашивания эпителия перитуморальной области);

— LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области — 26 случаев из 67 (отрицательное окрашивание опухоли и положительное окрашивание эпителия перитуморальной области) — данная группа описана нами впервые.

Ядерная экспрессия LMP-1 в опухолевых клетках встречалась часто (в 22 случаях; 32,8%). Ранее этот феномен расценивался как ложноположительная реакция вследствие кросс-реактивности антител с другими вирусными белками (EBNA-1, EBNA-2) из-за высокой степени гомологии [11, 14].

Для изучения характерных свойств трех выделенных групп результаты оценки экспрессии LMP-1 сопоставляли с клинико-морфологическими характеристиками рака желудка.

Гистологический тип рака желудка оценивали по классификации опухолей пищеварительной системы ВОЗ [15] и классификации P. Lauren [16, 17].

Исследованные случаи рака желудка были разделены на аденокарциномы (AC, ICD-O 8140/3) и перстневидно-клеточные раки (SRC, ICD-O 8490/3), отдельно выделена группа низкодифференцированных аденокарцином с наличием перстневидных клеток (AC-SRC), поскольку перстневидные клетки являются важным прогностическим признаком, влияющим на выживаемость пациентов.

Среди LMP-1-позитивных опухолей выявлено 7 AC и 2 AC-SRC (табл. 3, строки

Среди LMP-1-негативных опухолей и LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области преобладание ни одного из гистологических типов не было статистически значимо (см. табл. 3, строки № 1—4; см. рис. 1, а).

Структура распределения по гистологическим типам впервые описанной группы LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области соответствует структуре распределения LMP-1-негативных опухолей: среди обеих групп AC-SRC и SRC встречались значительно чаще, чем в группе LMP-1-позитивных опухолей, что косвенно свидетельствует о том, что эта группа имеет большее сродство с группой LMP-1-негативных опухолей, которые ассоциированы с низкой степенью дифференцировки и худшим прогнозом [18].

Классификация рака желудка по P. Lauren 1965 г. [16] включает два гистологических типа — кишечный и диффузный. Опухоли, содержащие как кишечный, так и диффузный компоненты, не редки и до 2010 г. в классификации ВОЗ выделялись в качестве отдельного промежуточного («смешанного») типа [17]. Анализ полученных результатов проводили с учетом этой ранее принятой концепции.

Среди LMP-1-позитивных опухолей и LMP-1-негативных опухолей преобладание опухолей диффузного типа не было статистически значимо (см. табл. 3, строки № 5—8; см. рис. 1, б).

Среди LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выявлены 4 опухоли кишечного типа, 19 промежуточного типа и 3 диффузного типа (см. табл. 3, строки № 5—8; см. рис. 1, б), преобладание опухолей промежуточного типа было статистически значимо.

Экспрессия LMP-1 при опухолях кишечного, диффузного и промежуточного типов представлена на рис. 2—4.

Группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выделена впервые и гистологически преимущественно соответствовала промежуточному типу. Опухоли промежуточного типа встречались в группе LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области значительно чаще, чем опухоли диффузного типа в группе LMP-1-негативных опухолей.

Можно предположить, что латентная экспрессия LMP-1 в эпителии перитуморальной области путем неизвестных межклеточных взаимодействий может оказывать влияние на формирование фенотипа прилегающих участков LMP-1-негативной опухоли, но рассуждения по этому поводу должны быть корректными, особенно вследствие убиквитарной персистенции антигенов EBV, роль которых, помимо новообразований, рассматривается также в патогенезе инфекционного мононуклеоза, синдрома Алисы в Стране чудес, острой церебеллярной атаксии у детей, дерматомиозита, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, синдрома хронической усталости и др. [3], однако точные механизмы не изучены.

С точки зрения современных представлений о канцерогенезе вирусные антигены могут оказывать либо прямое онкогенное воздействие, либо выступать в роли фонового или сопутствующего процесса.

При оценке распределения по степени дифференцировки среди LMP-1-позитивных опухолей статистически значимые различия не выявлены (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в). Среди LMP-1-негативных опухолей выявлены 14 опухолей G3 и 9 опухолей SRC (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в), отличие от групп G1 и G2 было статистически значимым. Среди LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области значимо преобладали опухоли G3 (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в).

Глубину инвазии оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]). В связи с отсутствием клинических данных по трем исследованным случаям сопоставление экспрессии LMP-1 с клиническими характеристиками рака желудка (TNM и локализация) приведено для 64 случаев. Значимых различий по глубине инвазии не наблюдали (см. табл. 3, строки № 14—20; см. рис. 1, г).

Количество метастазов в регионарных лимфатических узлах оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), однако ни в одной из групп не выявлено статистически значимых различий (см. табл. 3, строки № 21—26; см. рис. 1, д). Распределение экспрессии LMP-1 в зависимости от количества метастазов в регионарных лимфатических узлах оказалось неоднородным, требуется проведение исследования на большей выборке.

Наличие отдаленных метастазов оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), однако ни в одной из групп не выявлено статистически значимых различий (см. табл. 3, строки № 27—29; см. рис. 1, е). Опухоли с отдаленными метастазами преобладали (статистически незначимо) в группе LMP-1-негативных опухолей по сравнению с двумя другими группами, что соответствует распространенному мнению о том, что опухоли желудка, характеризующиеся отсутствием экспрессии вирусных транскриптов, как правило, ассоциированы с большим количеством метастазов и худшим прогнозом [18, 20].

Клиническую стадию определяли в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), исходя из совокупности характеристик T, N и М. Опухоли в рамках одной клинической стадии характеризовались высокой неоднородностью; статистически значимых различий между группами опухолей не получено (см. табл. 3, строки № 30—37; см. рис. 1, ж).

LMP-1-негативные опухоли встречали в кардиальном отделе желудка чаще, чем в двух других группах, хотя, по данным литературы [18], эти опухоли чаще являются EBV-ассоциированными в сравнении с другими локализациями. LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области определяли в теле желудка значительно чаще, чем LMP-1-позитивные опухоли, и чаще характеризовались субтотальным распространением (cм. табл. 3, строки № 38—43; см. рис. 1, з).

Предложены новые принципы оценки экспрессии белка LMP-1 вируса Эпштейна—Барр при раке желудка. Показано, что результаты иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к LMP-1 (клон CS1−4) непостоянны, что может быть связано с техническими особенностями, которые пока не определены, поэтому необходимы повторные постановки реакции.

Не обнаружено значимых связей между характеристиками экспрессии LMP-1 и клинико-морфологическими характеристиками рака желудка, что, вероятно, связано с высокой гетерогенностью его молекулярно-генетических свойств.

Не выявлено значимых различий экспрессии LMP-1 в зависимости от гистологического типа по классификации ВОЗ и классификации P. Lauren, однако при выделении промежуточного гистологического типа обнаружено, что большинство этих опухолей являются LMP-1-негативными с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области, что может отражать феномен персистенции антигенов EBV, однако для доказательства наличия латентной EBV-инфекции требуется верификация методом гибридизации in situ. Группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выделена впервые. Антигены EBV могут либо оказывать прямое онкогенное воздействие, либо выступать в роли фонового или сопутствующего процесса.

Работа выполнена по гос. заданию МГУ им. М.В. Ломоносова и с использованием оборудования, приобретенного по программе развития МГУ им. М.В. Ломоносова до 2020 г.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В.Д., И.А.М., П.Г.М.

Сбор и обработка материала — Н.В.Д., И.А.М., Н.А.О.

Статистическая обработка данных — И.А.М.

Написание текста — И.А.М., Н.В.Д.

Редактирование — П.Г.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Данилова Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7848-6707; e-mail: ndanilova@mc.msu.ru

Михайлов И.А. — https://orcid.org/0000-0001-8020-369X

Олейникова Н.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-8564-8874

Мальков П.Г. — https://orcid.org/0000-0001-5074-3513

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Данилова Н.В., Михайлов И.А., Олейникова Н.А., Мальков П.Г. Экспрессия белка LMP-1 в опухолевых клетках и железистом эпителии перитуморальной области при раке желудка. Архив патологии. 2019;81(6):-33. https://doi.org/10.17116/patol201981061