EMMPRIN — индуктор экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП), или СД 147 (кластер дифференцировки 147), или базигин, является полифункциональным гликопротеином, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов. Он экспрессируется во многих типах клеток в виде как мембранной, так и растворимой формы [1—3]. EMMPRIN принимает участие в ряде нормальных физиологических процессов, таких как эмбриогенез, сперматогенез, ангиогенез, формирование сети нейронов, а также в развитии целого ряда заболеваний и патологических процессов, таких как вирусные инфекции, болезнь Альцгеймера, ишемия и канцерогенез [4, 5]. Многочисленные исследования показали, что EMMPRIN является индуктором опухолевой прогрессии [4, 5]. В некоторых работах [6—8] есть данные о связи повышения экспрессии EMMPRIN с худшим прогнозом, прогрессированием и ранним метастазированием, индукцией неоангиогенеза в карциномах различных локализаций. EMMPRIN индуцирует экспрессию и секрецию ММП-1, 3, 9, 14, что сопровождается деградацией базальных мембран и соединительнотканного матрикса и приводит к облегчению процессов инвазии и метастазирования [8]. Экспрессия ММП, и в частности ММП-9, которая участвует в активации VEGF (эндотелиального фактора роста сосудов), являющегося основным индуктором ангиогенеза, приводит к васкуляризации опухоли и ее прогрессии. EMMPRIN регулирует взаимоотношения опухоли с эндотелиальными клетками через компоненты, которые находятся в микроокружении опухоли и являются проангиогенными факторами: ММП и VEGF. Его повышенная экспрессия способствует увеличенной экспрессии этих компонентов, развитию процесса ангиогенеза и канцерогенеза [7, 8]. Механизмы действия EMMPRIN на различные процессы онкогенеза недостаточно изучены. Однако имеющиеся сегодня данные, возможно, откроют новые перспективы для разработки таргетной терапии.

ММП-1 относится к семейству цинковых кальцийзависимых ММП, к тканевым коллагеназам. В тканях человека и высших животных обнаружены три ММП, относящиеся к этим ферментам: ММП-1, ММП-8, ММП-13. Они являются секретируемыми, индуцируемыми ММП, уровень которых в нормальных условиях очень низкий [9, 10]. Деградативная функция тканевых коллагеназ связана с их специфической способностью запускать гидролиз фибриллярных коллагенов I, II, III типов, при этом гидролизуется одна пептидная связь, находящаяся на расстоянии ¼ длины полипептидной цепи молекулы коллагена с С-конца. Образующиеся фрагменты способны денатурировать в физиологических условиях и далее подвергаться действию широкого спектра протеиназ, тем самым коллагеназы обеспечивают инициацию и развитие деструктивного процесса, а также разрушение соединительнотканного барьера при развитии инвазивных процессов [9—12]. ММП-1 выполняет и важные регуляторные функции: наряду с другими протеиназами с помощью ограниченного протеолиза ММП-1 активирует, инактивирует и модифицирует свойства ряда биологически активных молекул. Это приводит к прогрессированию онкологического процесса [10, 12, 13]. Следует подчеркнуть, что нередко в строме наблюдается более высокая экспрессия ММП и в более широком спектре этих ферментов [10, 12, 13].

Настоящая работа посвящена исследованию экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в тканях матки (включая миометрий и эндометрий) при плоскоклеточном раке шейки матки (ПРШМ). Рак шейки матки занимает 2-е место среди онкогинекологических заболеваний. Этиологическими факторами рака шейки матки являются вирусы папиллом (HPV), среди которых вирусы типа HPV16 и HPV18 являются наиболее распространенными и агрессивными [14, 15]. Данные, полученные нами на клетках, трансформированных онкогеном E7 HPV16, и коммерческих линиях клеток ПРШМ, трансформированных онкогенами вирусов типа HPV16 и HPV18, показали увеличение экспрессии ММП-1 и ММП-9 при чрезвычайно низком уровне или отсутствии экспрессии тканевых ингибиторов ММП (ТИМП). Эти результаты представляют интерес, так как в тканях опухоли при ПРШМ происходят те же процессы экспрессии белковых компонентов, что и в трансформированных теми же генами клетках и линиях клеток, полученных от пациенток с ПРШМ, и показывают вклад ММП и ТИМП в инвазивный потенциал опухоли.

Получены предварительные данные об экспрессии ММП и их регуляторов не только в карциномах шейки матки, но и в прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани [11, 13, 16]. Однако данные по экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в морфологически нормальной ткани матки при ПРШМ в литературе отсутствуют.

Цель исследования — изучить особенности экспрессии индуктора экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в тканях шейки и тела матки при ПРШМ. Эти исследования позволяют оценить уровень экспрессии EMMPRIN и ММП-1, а также возможную связь экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в опухоли и морфологически нормальных тканях матки, ее опосредованное влияние на биологическую агрессивность опухоли. Подобные исследования являются попыткой ответить на вопрос о дистанционной передаче сигналов в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей.

В работе использовали операционный материал, полученный при экстирпации матки у 4 пациенток с диагнозом: плоскоклеточный рак шейки матки II—III стадии. Материал получен в патологоанатомическом отделении Московского научно-исследовательского онкологического института (МНИОИ) им. П.А. Герцена. Согласие на использование материала для научных исследований было получено от всех пациенток. Исследования проводили в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинкской декларации. В работе использовали фрагменты ткани, полученные из удаленной матки в виде ленты от стенки влагалища до дна полости матки. Тканевые ленты разделили на фрагменты с соответствующей маркировкой зон, немедленно заморозили и хранили в жидком азоте. Стадия установлена по клинической классификации опухолей TNM в соответствии с требованиями Международного союза по борьбе с раком (UICC). Все образцы исследовали гистологически для определения характера изменений и границ опухоли по препаратам, окрашенным гематоксилином и эозином. Данные о наличии опухоли в образцах представлены в табл. 1.

Иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию проводили по стандартному методу [17, 18]. В работе использовали замороженные срезы толщиной 5 мкм, изготовленные на криостате Leica CM 1510S, и монтировали на высокоадгезивных стеклах. Затем срезы фиксировали в 10% нейтральном формалине 15 мин при комнатной температуре. Восстановление антигенной активности проводили в модуле предобработки автостейнера при температуре 97 °C в течение 20 мин в цитратном буфере, рН 6,0 (для антител к ММП-1) или в стандартном трис-ЭДТА-буфере, рН 9,0 (для антител к EMMPRIN). Использовали моноклональные антитела к ММР-1 и EMMPRIN фирмы «LabVision» в готовом разведении. ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногистостейнере Avtosteiner («Dako»). В качестве детекционной системы использовали систему Envision («Dako»), в качестве хромогена — диаминобензидин. Затем срезы докрашивали гематоксилином.

Микроскопирование проводили на анализаторе изображения Leika Q 550. Интенсивность реакции оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность реакции: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — сильная.

Исследование экспрессии генов EMMPRIN и ММП-1 проводили методом полуколичественной ОT-ПЦР [19, 20]. Выделение РНК осуществляли при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, Z 3100), обратную транскрипцию — набора MMLVRTkit (Evrogen, SK021). Нормировку результатов проводили по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства — GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) и HPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы).

Для подбора специфических праймеров использовали данные Gene Bank Nucleotide Sequence Database. Для оценки структуры праймеров применяли компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Последовательность праймеров и условия проведения реакции представлены в табл. 2. Продукты ОТ-ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромида этидия [20]. Денситометрический анализ фореграммы проводили с использованием программы ImageJ.

Исследование экспрессии генов EMMPRIN и ММП-1 при ПРШМ проведено на четырех тканевых лентах, полученных от стенки влагалища до дна полости матки. В качестве примера приведены данные по экспрессии генов в двух лентах, состоящих из пяти (лента 1) и четырех (лента 2) фрагментов (рис. 1, а,

ИГХ-исследование экспрессии EMMPRIN и ММП-1 при ПРШМ проведено на фрагментах четырех тканевых лент от стенки влагалища до дна полости матки. На рис. 2 и в

Экспрессия ММП-1 также была ярко выражена в опухолевой ткани и отсутствовала в морфологически нормальной ткани тела матки.

Данные ИГХ-реакции, представленные в табл. 2, показывают выраженные индивидуальные особенности исследованных четырех образцов тканевых лент по экспрессии EMMPRIN и ММП-1. Обнаружено, что экспрессия EMMPRIN и ММП-1 выявляется во всех фрагментах опухоли всех четырех образцах ткани. Однако экспрессия EMMPRIN отмечена и во фрагментах морфологически нормальной ткани, как это следует из данных, представленных в табл. 1 (ленты 1, 2, 4). Экспрессия ММП-1, хотя и на достаточно низком уровне, также обнаружена во фрагментах морфологически нормальной ткани (ленты 1, 3, 4). Прямой зависимости между экспрессией EMMPRIN и ММП-1 не наблюдалось ни в одной из четырех тканевых лент как в опухолевых, так и в морфологически нормальных фрагментах ткани.

При ПРШМ установлено наличие высокой экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в опухолевой ткани и строме, также она обнаружена и в морфологически нормальной ткани тела матки. Экспрессия генов EMMPRIN в опухолевой и морфологически нормальной ткани существенно не различалась, в то время как экспрессия ММП-1 резко снижалась в морфологически нормальной ткани. Уровень экспрессии EMMPRIN и ММП-1 в тканях матки при ПРШМ не только отражает деструктивные (инвазивные) свойства опухоли, но и свидетельствует о начальных нарушениях в морфологически нормальной ткани как непосредственно вблизи опухоли, так и на достаточном удалении от нее (ткани тела матки). Полученные результаты важны для понимания механизма инвазии и метастазирования опухолей.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка материалов — О.С.Т., Т.А.Г. Е.В.К., Л.Э.З.

Статистическая обработка данных — О.С.Т., Т.А.Г., Е.В.К.

Написание текста — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З.

Редактирование — Н.И.С., Л.Э.З. Ю.Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Тимошенко О.С. — https://orcid.org/0000-0001-7226-3043

Гуреева Т.А. — https://orcid.org/0000-0003-4614-0386

Кугаевская Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-0693-9786

Завалишина Л.Э. — https://orcid.org/0000-0002-0677-7991

Андреева Ю.Ю. — https://orcid.org/0000-0003-4749-6608

Соловьева Н.И. — https://orcid.org/0000-0002-6254-8528; e-mail: Nina.Solovyeva@ibmc.msk.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Тимошенко О.С., Гуреева Т.А., Кугаевская Е.В., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Соловьева Н.И. Экспрессия EMMPRIN и матриксной металлопротеиназы ММП-1 в шейке и теле матки при цервикальной плоскоклеточной карциноме. Архив патологии. 2019;81(6):-40. https://doi.org/10.17116/patol201981061

Тimoshenko O.S. — https://orcid.org/0000-0001-7226-3043