Медицинское сообщество продолжает научные изыскания, посвященные иммунологии и прогностическим факторам рака мочевого пузыря (РМП), ведется поиск новых биомаркеров, которые в совокупности с оценкой PD-L1-статуса могли бы предоставить клиницисту наиболее достоверную картину ожидаемого клинического ответа на иммунотерапию, а также помочь уточнить прогноз заболевания.

Выраженная перитуморальная инфильтрация как следствие активного противоопухолевого иммунного ответа связана с повышенной иммуногенностью опухолевой ткани, возникновение которой возможно при наличии высокой мутационной нагрузки (tumor mutational burden — TMB). TMB представляет собой количественную меру общего числа соматических несинонимичных мутаций на область кодирования опухолевого генома. Предполагается, что новообразования с более высокой мутационной нагрузкой с большей вероятностью будут экспрессировать неоантигены и, следовательно, иметь повышенную иммуногенность [1]. По сравнению со многими другими типами рака РМП характеризуется разнообразным мутационным ландшафтом [2, 3], также примечательна его высокая вариабельность у разных пациентов: в некоторых опухолях развивается более 1000 несинонимичных мутаций, а в других — на несколько порядков меньше. Опубликованный J. Rosenberg и соавт. [4] исследовательский анализ показал, что TCGA (The Cancer Genome Atlas) подтипы РМП и мутационная нагрузка являются независимыми предиктивными факторами ответа на иммунотерапию препаратом-ингибитором иммунных контрольных точек (атезолизумаб). Исходя из потенциальной оценки TMB как прогностического биомаркера иммунотерапии, некоторые исследователи дают следующие предиктивные пороговые значения ТМВ для РМП — приблизительно 200 несинонимичных соматических мутаций, установленных путем секвенирования всего экзома (WES) [5]. Однако, несмотря на то что в ближайшем будущем оценка TMB может сыграть важную роль в иммуноонкологии, в том числе РМП, реализация исследования TMB в рутинных условиях остается непростой задачей, требующей надежной аналитической и клинической валидации и стандартизации [1].

Существует возможность определять мутационную нагрузку суррогатным методом путем оценки наличия феномена микросателлитной нестабильности (MSI). Под MSI подразумевают инсерцию или делецию короткой последовательности нуклеотидов в аллелях микросателлита — повторяющейся короткой последовательности фрагментов ДНК. MSI возникает вследствие несовершенства системы репарации неспаренных оснований ДНК — mismatch repair deficient (dMMR). За работу системы MMR отвечают 6 генов — MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 и MLH3. При наличии в этих генах герминальных мутаций (синдром Линча) или же при других ненаследственных механизмах формирования dMMR (например, гиперметилирование промотора MLH1) в опухолевой клетке нарушается стабильность системы поддержания целостности ДНК. Это приводит к целому спектру разнообразных молекулярных и биологических изменений и повышенной экспрессии неоантигенов на опухолевых клетках. Наличия в опухоли MSI/dMMR — доказательство ее генетической гипермутативности и, как следствие, иммуногенности, что способствует выраженной лимфоцитарной инфильтрации опухолевой ткани [6].

Показательная позиция FDA в отношении значимости MSI/dMMR [6], а также данные многих научных исследований дают основание полагать, что оценка MSI-фенотипа опухоли в скором будущем будет незаменимым дополнением к определению PD-L1-статуса. Морфолог может заподозрить наличие феномена MSI уже на этапе рутинной световой микроскопии по выраженности TILs. Для точной диагностики MSI-фенотипа классически используется метод ПЦР, как правило, применяется модель из 5 маркеров: BAT26, BAT25, D2S123, D5S346, D17S250. Еще один вариант определения MSI, доступный для патоморфологических лабораторий, — ИГХ-метод, который заключается в определении экспрессии белков MutL Protein Homolog 1 (MLH1), MutS Protein Homolog 2 (MSH2), MutS Protein Homolog 6 (MSH6), Postmeiotic Segregation Increased 2 (PMS2). В случае отсутствия ИГХ-окрашивания хотя бы одного белка диагностируется dMMR. Также диагностика MSI возможна с помощью секвенирования нового поколения (NGS), но данный метод на сегодняшний день еще не вошел в рутинную клиническую практику.

Связь MSI и PD-L1-статуса выявлена в ряде исследований колоректального рака (КРР) и рака эндометрия. N. Llosa и соавт. [7], исследуя различные варианты КРР, обнаружили, что в основном именно КРР с фенотипом MSI-H (высокий уровень MSI) имеет тесную связь с высокой экспрессией PD-1/PD-L1. При определении MSI ИГХ-методом при КРР отмечена гетерогенность экспрессии белков MMR, особенно MSH6, при этом ряд авторов [8] настаивают, что гетерогенность ИГХ-окрашивания белков MSI не следует рассматривать исключительно как артефакт или отсутствие dMMR, так как подчас такие ИГХ-гетерогенные участки содержат различные молекулярные аберрации. Однако клиническая значимость случаев, демонстрирующих гетерогенное ИГХ-окрашивание, требует дальнейшего изучения.

Высказываются предположения, что конечным предиктивным биомаркером иммунотерапии является не MSI и даже не мутационная нагрузка, а именно наличие на поверхности раковых клеток иммуногенных неоэпитопов, и в настоящее время статус MSI является наиболее практическим приемлемым биомаркером для определения данных эпитопов [9]. Известно, что MSI-H-фенотип — это редкое явление при РМП, встречающееся в 1% опухолей. Тем не менее снижение экспрессии белков MMR-системы (MLH1 или MSH2) наблюдается в 26 (23%) из 111 опухолей [10]. Кроме того, пациенты с синдромом Линча, имеющие мутацию MSH2, подвергаются повышенному риску рака мочевых путей, включая РМП [11].

В исследовании 69 образцов материала пациентов с инвазивным РМП A. Saetta и соавт. [12] подтвердили наличие статистически значимой корреляции между экспрессией hMLH1 и наличием MSI, отметив, что альтерации hMSH3 и hMSH6 с наличием MSI не связаны. H. Kassem и соавт. [13] ИГХ-методом в 24 образцах РМП выявили выраженную внутриопухолевую гетерогенность экспрессии двух MMR-белков: в одном случае определена потеря экспрессии MLH1 и в одном — MSH2 (1/24, 4%). Авторы отметили, что, хотя ИГХ-метод и представляется удобным и быстрым способом для скрининга dMMR в опухоли, однако нельзя исключить структурные и функциональные изменения самих белков MMR-системы. Данные J. Catto и соавт. [10] не показали наличия связи MSI с экспрессией белков MMR, определенной ИГХ-методом, но отметили, что сниженная экспрессия белков MMR в РМП чаще наблюдалась в мышечно-инвазивных опухолях, а также в high grade РМП, что позволяет предположить потенциальную прогностическую роль белков MMR.

Цель исследования, проведенного на базе кафедры патологической анатомии ДПО ФГБОУ РМАНПО — изучение MSI-фенотипа РМП ИГХ-методом и оценка его связи с прогностическими факторами заболевания и PD-L1-статусом РМП.

Материалом для исследования послужили 50 образцов операционного и биопсийного материала РМП, предоставленных кафедрой патологической анатомии РМАНПО за период с 2013 по 2018 г. Выборка проведена случайным образом, критериями отбора были достаточный объем материала, стадии процесса Т1—Т3 и только уротелиальный РМП или его варианты. Карциному in situ и неинвазивный папиллярный рак в исследование не включали. Пациенты преимущественно мужского пола — 46 (92%) из 50, средний возраст (оба пола) 62,45 года (29—87 лет). Распределение по стадиям TNM (UICC, 2018): Т1 — 50% (25/50), Т2 — 46% (23/50), при этом T2a — 47,8% (11/23), а T2b — 52,2% (12/23), T3 — 4% (2/50), T3a — 50% (½), T3b — 50% (½). Распределение по степени дифференцировки опухоли (WHO classification, 2016): low-grade — 30% (1/50), high-grade — 70% (35/50).

Исследование PD-L1-статуса проводили ИГХ-методом с использованием антитела PD-L1 SP142 с системой детекции Opti View DAB IHC Detection Kit c амплификацией сигнала (Ventana Medical Systems, Inc., США). С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один для нанесения первичных антител и второй для негативного контроля. В качестве контроля протокола исследования применяли стекла c образцами клеточных культур (NCL-H226 — позитивная клеточная линия и MCF-7 — негативная клеточная линия), образцы ткани миндалины и плаценты в каждом цикле постановки реакции. Для всех антител применялся автоматизированный метод ИГХ-исследования. Для постановки реакции с антителом SP142 (Ventana Medical Systems, Inc., США) использовали иммуногистостейнер VENTANA Bench Mark ULTRA (Ventana Medical Systems, Inc., США) по протоколам, рекомендованным в инструкциях к антителам и системой внешнего контроля качества NordiQC. PD-L1-статус опухоли оценивали по системе оценки IC: отношение площади, занимаемой иммунными клетками, экспрессирующими PD-L1, к площади опухоли, под которой понимают все жизнеспособные клетки опухоли, иммунные клетки микроокружения и гранулемы, умноженное на 100 и выраженное в процентах, пороговое значение (cut-off) 5% и более. В соответствии с рекомендациями по оценке результатов экспрессии PD-L1 оценивали только наличие мембранного окрашивания в опухолевых и иммунных клетках независимо от его интенсивности.

Исследование MSI-фенотипа проводили ИГХ-методом с использованием следующих антител в рабочем разведении (Dako An Agilent Technologies Company): MLH1 (Clone ES05); MSH6 (Clone EP49); PMS2 (Clone EP51). Время инкубации с первичными антителами 30 мин. Система детекции — EnVision FLEX для иммуноавтостейнера Dako Autostainer Link 48 (Dako An Agilent Technologies Company). В качестве хромогена использован диаминобензидин (ДАБ). Демаскировка проведена в буфере с рН 9,0 в модуле предобработки (PTModule) для иммуноавтостейнера Dako Autostainer Link 48, температура 97 °C в течение 25 мин. Каждый маркер тестировали практически в 1 постановку. В случае отсутствия ядерного ИГХ-окрашивания хотя бы одного маркера диагностировали положительный MSI-фенотип.

Интенсивность ядерного ИГХ-окрашивания оценивали по 3-балльной системе: 0 — отсутствие окрашивания; 1 — слабовыраженное окрашивание; 2 — умеренно выраженное окрашивание; 3 — интенсивное яркое окрашивание (рис. 1).

Исходя из того, какой процент всей площади опухоли занимают опухолевые клетки с окрашенными ядрами, все случаи были разбиты на четыре группы: 1-я группа — полное отсутствие или менее 1%; 2-я группа — от 1% и более, до 10% и менее; 3-я группа — от 11% и более, до 49% и менее; 4-я группа — от 50% и более, до 100% и менее.

При анализе результатов ИГХ-исследования экспрессии белков MSI выявлена высокая прямая корреляционная связь между интенсивностью ядерного окрашивания опухолевых клеток и процентом занимаемой ими площади опухоли (коэффициент корреляции для PMS2, MLH1, MSH6 составил соответственно 0,8, 0,8, 0,7). На основании этого посчитали целесообразным разбить все случаи на 4 группы таким образом, чтобы учитывались одновременно 2 показателя: интенсивность ядерного окрашивания и процент площади опухоли, занимаемый клетками с окрашенными ядрами (таблица).

Необходимо отметить, что часть случаев не вошла ни в одну из групп из-за наличия гетерогенности ИГХ-окрашивания опухолевых клеток, подобное явление отмечают при исследованиях MSI в КРР, а также в целом многие исследователи, изучающие MSI-фенотип различных опухолей.

Для белка PMS2 группа 0 составила 50% (25/50), группа I — 22% (11/50), группа II — 14% (7/50), группа III — 4% (2/50), гетерогенные случаи — 10% (5/50).

В нашем исследовании самый большой процент полного отсутствия и выраженного снижения экспрессии был отмечен у белка PMS2, хотя, по данным литературы, при РМП больше характерна потеря экспрессии MLH1.

В группе 0 в основном выявлены опухоли high grade — 72% (18/25), карциномы low grade составили 28% (7/25); мышечно-инвазивные раки также преобладали — стадия T2 отмечена в 52% (13/25), при этом T2a — в 38,5% (5/13), T2b — в 61,5% (8/13); стадия Т1 выявлена в 48% (12/25) случаев.

В группе I также преобладали опухоли high grade — 54,5% (6/11), low grade составили 45,5% (5/11); в этой группе доминировали поверхностные раки — стадия Т1 отмечена в 54,5% (6/11), T2 — в 36,4% (4/11), при этом преобладали случаи T2a — 75% (¾), T2b выявлена в 25% (¼). Также в этой группе был 1 случай рака стадии T3b.

В группе II опухоли high grade так же, как и в предыдущих группах, преобладали и составили 85,7% (6/7), low grade — 14,3% (1/7). Поверхностные карциномы T1 и мышечно-инвазивные опухоли T2 в данной группе представлены в одинаковом соотношении — 42,9% (3/7), однако среди мышечно-инвазивных карцином доминировала стадия T2b — 66,7% (2/3), стадия T2a — соответственно 33,3% (1/3), также в данной группе был 1 случай рака стадии T3a.

В группе III карциномы high grade и low grade составили по 50% (½). Поверхностные и мышечно-инвазивные раки в данной группе также представлены поровну 50% (½), при этом единственный случай мышечно-инвазивного рака ограничивался врастанием во внутреннюю часть мышечного слоя (T2a).

В группе гетерогенного окрашивания для белка PMS2 доминировали опухоли high grade — 80% (4/5), low grade составили 20% (1/5), при этом интенсивность ядерного окрашивания в данной группе колебалась от 1 до 2. Поверхностные раки преобладали и составили 60% (3/5), стадия T2 — 40% (2/5), T2a и T2b представлены в равном соотношении — 50% (½).

Резюмируя полученные данные (рис. 2),

Для белка MLH1 группа 0 составила 18% (9/50), группа I — 24% (12/50), группа II — 22% (11/50), группа III — 6% (3/50), гетерогенные случаи — 30% (15/50).

Наши результаты исследования экспрессии MLH1 ИГХ-методом продемонстрировали меньший процент полного отсутствия экспрессии, чем мы получили при исследовании PMS2, однако снижение экспрессии данного белка наблюдается более чем в ½ случаев, почти 1/3 опухолей демонстрирует гетерогенность экспрессии, что подтверждает данные литературы.

В группе 0 преобладали опухоли high grade — 88,9% (8/9), low grade составили 11,1% (1/9), мышечно-инвазивные раки также доминировали — стадия T2 выявлена в 77,8% (7/9), при этом T2a — в 42,9% (3/7), T2b — в 57,1% (4/7), стадия Т1 — в 22,2% (2/9) случаев.

В группе I также доминировали опухоли high grade — 66,7% (8/12), low grade составили 33,3% (4/12), мышечно-инвазивные раки встречались чаще, чем поверхностные, стадия T2 составила 58,3% (7/12), при этом стадия T2b — 57,1% (4/7), T2a — 42,9% (3/7), стадия Т1 выявлена в 41,7% (5/12) случаев.

В группе II количество опухолей high grade составило 81,8% (9/11), что значительно превышает количество карцином low grade — 18,2% (2/11). Стадии T1 и T2 в данной группе представлены в равном соотношении — 45,5% (5/11), среди мышечно-инвазивных опухолей доминирует стадия T2a — 60% (3/5), T2b составляет 40% (2/5), также в данной группе присутствует 1 случай рака стадии T3a.

В группе III опухоли low grade преобладали и составили 66,7% (2/3), опухоли high grade выявлены в 33,3% (1/3). Во всех случаях в данной группе диагностированы поверхностные раки стадии T1.

В гетерогенной группе для белка MLH1 доминировали опухоли high grade — 60% (9/15), low grade составили 40% (6/15), при этом интенсивность ядерного окрашивания в данной группе колебалась значительно — от 1 до 3. Поверхностные раки преобладали — 66,7% (10/15), стадия T2 составила 26,7% (4/15), T2a и T2b были представлены в равном соотношении — 50% (2/4), также в данной группе отмечен 1 случай рака стадии T3b.

Таким образом, анализируя полученные результаты (рис. 3),

Для белка MSH6 группа 0 составила всего 4% (2/50), группа I — 6% (3/50), группа II — 14% (7/50), группа III — 36% (18/50), гетерогенные случаи — 40% (20/50).

В нашем исследовании именно MSH6 продемонстрировал самую выраженную гетерогенность экспрессии, что считается характерным для данного белка MMR.

В группе 0 опухоли high grade наблюдались в 100% (2/2), стадия T2b также составила 100% (2/2).

В группе I опухоли high grade также наблюдались в 100% (3/3), мышечно-инвазивные раки встречались чаще, чем поверхностные, стадия T2 составила 66,7% (2/3), T2a и T2b представлены в равном соотношении — 50% (½), стадия Т1 встречалась в 33,3% (1/3).

В группе II опухоли high grade составили 57,1% (4/7), low grade — 42,9% (3/7). Карциномы T1 выявили в 57,1% (4/7), T2 — в 42,9% (3/7), все они врастали в наружную половину мышечного слоя стенки (T2b).

В группе III опухоли high grade преобладали — 77,8% (14/18), low grade составили 22,2% (4/18). Подавляющее большинство опухолей в данной группе было представлено поверхностными опухолями T1 — 55,6% (10/18), T2 выявлены в 38,9% (7/18), при этом T2a — в 57,1% (4/7), T2b — в 42,9% (3/7), T3a — в 1 случае.

В гетерогенной группе для белка MSH6 значимо преобладали опухоли high grade — 60% (12/20), low grade выявлены в 40% (8/20), при этом интенсивность ядерного окрашивания в данной группе колебалась от 1 до 3. Опухоли T1 составили 50% (10/20), T2 — 45% (9/20), при этом T2a — 66,7% (6/9), T2b — 33,3% (3/9), T3b — 1 случай.

Обобщая полученные результаты (рис. 4),

Необходимо отдельно упомянуть о гетерогенности экспрессии белков MSI, она наблюдалась по всем 3 исследуемым белкам: в большей степени (40%) у MSH6, почти в 1/3 случаев (30%) у MLH1 и в 10% у PMS2. При этом для всех исследуемых белков гетерогенные группы характеризовались преобладанием опухолей high grade в сочетании с превалированием поверхностных стадий T1. В 14% (7/50) наблюдений наблюдалось отсутствие экспрессии двух белков (PMS2 и MLH1) одновременно. При этом все данные опухоли имели высокий grade и подавляющее их большинство являлось мышечно-инвазивными карциномами: T2 — 85,7% (6/7), T2a и T2b были представлены в равном соотношении — 50% (3/6); опухоли T1 составили всего 14,3% (1/7). Данные случаи в 42,9% (3/7) вошли в I группу MSH6, такой же процент случаев наблюдался при гетерогенности этого белка со значительным колебанием интенсивности ядерного окрашивания от 1 до 3, еще 1 (14,3%) наблюдение соответствовало группе III MSH6. Лишь в 2% (1/50) отмечено отсутствие экспрессии всех трех исследуемых белков — опухоль имела низкую степень дифференцировки и врастала в глубокие отделы мышечного слоя (стадия T2b).

Резюмируя эти данные, хочется отметить, что белки PMS2 и MLH1 продемонстрировали схожую ассоциацию отсутствия и/или снижения экспрессии со степенью дифференцировки опухоли, а также со стадией T. Белок MSH6 в нашем исследовании не показал такой явной связи между исследуемыми параметрами, также он продемонстрировал более выраженную гетерогенность, чем остальные белки. Возможно, это может объяснить, что сочетание отсутствия экспрессии двух белков (PMS2 и MLH1) оказалось более частым событием, чем отсутствие экспрессии всех трех исследуемых белков одновременно.

При изучении характера экспрессии в исследуемых образцах обращало на себя внимание явное и значительное снижение экспрессии белков MSI в зоне инвазии, а также при снижении дифференцировки опухоли (рис. 5 и 6).

Учитывая, что позитивный PD-L1-статус опухоли в нашем исследовании выявлен всего в 3 случаях (IC 7, 5, 7% соответственно), достоверно судить о наличии или отсутствии связи между MSI-фенотипом и PD-L1-статусом нельзя. Однако необходимо отметить, что PD-L1-позитивный статус сочетался со сниженной экспрессией PMS2 (2 случая — II группа, 1 случай гетерогенный: интенсивность окрашивания 2 в сочетании с площадью 60%); cо сниженной экспрессией MLH1 (2 случая — II группа, 1 случай — I группа) и наличием выраженной экспрессии MSH6 (все 3 случая — III группа).

При анализе полученных результатов обращает на себя внимание высокая прямая корреляционная связь между интенсивностью ядерного окрашивания опухолевых клеток и процентом занимаемой ими площади опухоли. Это позволило авторам разработать свою систему интерпретации результатов ИГХ-исследования экспрессии белков MSI в уротелиальных карциномах. Также отмечена связь между отсутствием и/или снижением экспрессии PMS2, MLH1 и в меньшей степени MSH6 и градацией и стадией Т опухоли. Это подтверждает описанные в литературе предположения, что степень экспрессии белков MSI, определенная ИГХ-методом, может служить самостоятельным прогностическим фактором при РМП, что также подтверждается показательным снижением экспрессии исследуемых белков MSI в преинвазивной и инвазивной зонах опухоли. Отсутствие экспрессии двух белков (PMS2 и MLH1) оказалось более частым событием, чем отсутствие экспрессии трех белков одновременно. Отмечено наличие гетерогенности экспрессии маркеров: MSH6 (40% случаев), MLH1 (30%) и PMS2 (10%). Гетерогенные группы по всем белкам в данном исследовании характеризовались преобладанием high grade немышечно-инвазивных карцином, однако однозначно интерпретировать эти результаты в настоящий момент не представляется возможным: необходимы дальнейшие исследования. В связи с малым количеством позитивных PD-L1-карцином в данном исследовании неправомерно делать выводы о наличии или отсутствии связи между MSI-фенотипом и PD-L1-статусом РМП, однако следует отметить сочетание позитивного PD-L1-статуса со снижением экспрессии PMS2 и MLH1 и выраженной экспрессией MSH6.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А., О.А.К.

Сбор и обработка информации — Е.М.О., И.М.Т.

ИГХ-исследование — Л.Э.З., Ю.Ю.А, О.А.К., Е.М.О.

Написание текста — Е.М.О., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Редактирование — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Завалишина Л.Э. — https://orcid.org/0000-0002-0677-7991

Андреева Ю.Ю. — https://orcid.org/0000-0003-4749-6608

Олюшина Е.М. — https://orcid.org/0000-0002-7350-3552; e-mail: catya.olyushina@yandex.ru

Франк Г.А. — https://orcid.org/0000-0002-3719-5388

Кузнецова О.А. — https://orcid.org/0000-0002-9721-6355

Тележникова И.М. — https://orcid.org/0000-0002-1491-2882

Виноградов И.И. — https://orcid.org/0000-0002-4341-6992

Москвина Л.В. — https://orcid.org/0000-0001-8670-1366