Впервые в Классификации ВОЗ опухолей ЦНС (5-е изд., 2021 г.) в разделе мезенхимальные неменинготелиальные опухоли как опухоли неопределенной дифференцировки выделены: интракраниальная мезенхимальная опухоль со слиянием FET::CREB, CIC-саркома и первичная интракраниальная саркома с мутацией DICER1. В 2021 г. после внедрения в рутинную практику нового метода исследования метилирования ДНК в нашем центре удалось диагностировать 2 случая CIC-саркомы и 1 первичной интракраниальной саркомы; с интракраниальной мезенхимальной опухолью со слиянием FET::CREB в нашей практике мы пока не сталкивались.
Удивительно, но BCOR-саркома, включенная в Классификацию ВОЗ опухолей мягких тканей и детских опухолей совместно с CIC-саркомой в раздел опухолей неопределенной дифференцировки, в Классификации ВОЗ опухолей ЦНС отнесена в раздел эмбриональных опухолей [1—3].
Клиническое наблюдение №1. (CIC-саркома)
Девочка 15 лет заболела остро в октябре 2021 г., жалобы на резкую головную боль, тошноту и рвоту, быстро стала вялой и сонливой. По месту жительства при компьютерной томографии выявлено кровоизлияние объемом 40 см3 в левой теменно-затылочной области. Ребенок оперирован по экстренным показаниям, удалена гематома и частично — обнаруженное на операции объемное образование. Гистологически диагностирована глиобластома. Через 1 мес после операции вновь возникла идентичная клиническая ситуация: резко ухудшилось состояние, повторно произведено удаление гематомы и частичное удаление опухоли. Еще через 1 мес при МРТ головного мозга с контрастным усилением выявляется больших размеров опухоль левой теменно-затылочной области с перифокальным отеком. Девочка госпитализирована в НМИЦ нейрохирургии, удалена растущая из фалькса серая мягкая опухоль с обширными некрозами и кровоизлияниями.
Гистологические препараты от произведенных по месту жительства операций не удалось получить.
При гистологическом исследовании материала, удаленного в нашем центре, определяется злокачественная опухоль со следами кровоизлияний различной давности и обширными некрозами. Опухоль представлена двумя компонентами: мономорфными мелкими клетками со скудной светлой цитоплазмой и гиперхромным ядром и крупными клетками со светлой или эозинофильной цитоплазмой, крупным светлым ядром с базофильным ядрышком, формирующими солидные поля. Отмечаются многочисленные фигуры митозов, опухолевые клетки имеют тенденцию к периваскулярному расположению (рис. 1).
Рис. 1. Клиническое наблюдение №1. Гистологическое исследование опухоли.
а — мелкоклеточный компонент опухоли, требующий дифференциального диагноза с астроцитарной глиомой; б — построение опухолевыми клетками периваскулярных структур; в — крупноклеточный компонент опухоли, местами имеющий альвеолярное строение. Окраска гематоксилином и эозином, а, б — ×100, в — ×200.
Проведен анализ метилирования ДНК с использованием набора Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit на приборе Illumina NextSeq 550. Анализ результатов выполнен на платформе molecularneuropathology.org с использованием Version 12.5 of the brain classifier и Sarcoma classifier.
Выявлены метиляционный класс CIC-саркомы с коэффициентом соответствия 0.99; делеция в коротком плече первой хромосомы и неметилированный MGMT (рис. 2).
Рис. 2. Клиническое наблюдение №1. Молекулярное исследование опухоли методом оценки метилирования ДНК.
На горизонтальной оси абсцисс обозначены количественные изменения хромосом от 1 до 22. Красным цветом отмечена делеция 1p.
С февраля 2022 г. девочка наблюдается у онкологов.
Клиническое наблюдение №2. (CIC-саркома)
Изменение диагноза после проведения анализа метилирования ДНК в данном случае явилось для нас полной неожиданностью. Мы планировали использовать данную опухоль как позитивный контроль анапластической эпендимомы и были уверены в диагнозе с момента его постановки в 2016 г.
Мальчик поступил в Центр нейрохирургии в 2016 г. в возрасте 1 года 11 мес. Заболевание манифестировало с пароксизмального приступа в виде замирания, приступы повторялись, нарастали по частоте. Проведена МРТ головного мозга, при которой выявлена опухоль левой затылочной области. Мальчик оперирован, опухоль тотально удалена до внешне интактной мозговой ткани. На операции установлено, что опухоль инфильтративно поражала твердую мозговую оболочку. Гистологически диагностирована анапластическая эпендимома с периваскулярными псевдорозетками, микроваскулярной пролиферацией, отложением кальцификатов, местами опухоль имела альвеолярное строение. В настоящий момент при подобной гистологической картине дифференциальный диагноз принято проводить между анапластической эпендимомой и нейробластомой (рис. 3, а, б). При иммуногистохимическом исследовании выявлены ядерная экспрессия INI1, выраженная позитивная экспрессия GFAP, точковая экспрессия ЕМА и индекс мечения пролиферативного маркера Ki-67 до 20%. Иммуногистохимическое исследование четко указывало на анапластическую эпендимому.
Рис. 3. Клиническое наблюдение №2. Гистологическое исследование опухоли.
а — типичная картина анапластической эпендимомы; б — гистологическая картина, требующая дифференциального диагноза между анапластической эпендимомой и нейробластомой; в — появление саркоматозного компонента в локальном рецидиве; г — появление саркоматозного/мелкоклеточного компонента в локальном рецидиве. Окраска гематоксилином и эозином, а — ×200, б—г — ×100.
Проведена лучевая терапия в суммарной очаговой дозе 54 Гр. Проводился контроль заболевания с использованием МРТ всех отделов ЦНС. Данных, подтверждающих локальный рецидив или дистантное метастазирование, не выявлено. Однако через 16 мес на МРТ головного мозга выявлен локальный рецидив и мальчик был оперирован повторно. Гистологически опухоль изменилась: появились мелкие округлые голоядерные клетки, местами формирующие протоковые структуры, клетки с округлыми ядрами и светлой цитоплазмой. Таким образом, был установлен не распознанный вовремя саркоматозный компонент (рис. 3, в, г).
Следующий очередной локальный рецидив произошел через 6 мес, ребенок был оперирован, гистологически опухоль демонстрировала особенности типичной анапластической эпендимомы — периваскулярные псевдорозетки и истинные розетки. Однако также имелись и нейробластические розетки, клетки с округлыми ядрами и светлой цитоплазмой, а также тонкие извитые непролиферирующие сосуды.
Через 6 мес пациент был снова оперирован по поводу уже третьего по счету локального рецидива, при гистологическом исследовании среди мозговой и фиброзной ткани определялась злокачественная полиморфно-клеточная опухоль.
Из замороженной опухолевой ткани, полученной во время первой операции, извлечена ДНК, проведен анализ метилирования ДНК. Выявлен метиляционный класс CIC-саркомы с коэффициентом соответствия 0.99; в опухоли имеются делеция в коротком плече первой хромосомы, дополнительный материал в хромосоме 8 и неметилированный MGMT (рис. 4).
Рис. 4. Клиническое наблюдение №2. Молекулярное исследование опухоли методом оценки метилирования ДНК.
Красным цветом обозначена делеция 1p, зеленым цветом — дополнительный материал хромосомы 8.
Мальчик умер через 2,5 года после первой операции.
Клиническое наблюдение №3. (Первичная интракраниальная саркома с мутацией DICER1)
Молодая женщина 23 лет в течение месяца жаловалась на прогрессирующее развитие головокружений, тошноты, головной боли и двоения в глазах. По данным МРТ с контрастным усилением у пациентки диагностирована опухоль правой ножки мозжечка, неравномерно накапливающая контрастное вещество, достигающая намета мозжечка. На операции выявлено, что опухоль располагается в оральных отделах мостомозжечкового угла, имеет бугристую поверхность, мягкую консистенцию, серую окраску, смешанный характер роста — экзофитно распространяется из боковой поверхности ствола и инфильтративно проникает в толщу мозговой ткани ствола.
Гистологическое исследование выявило гетерогенную опухоль с выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. Ядра клеток крупные, светлые, с четкими ядрышками. Обнаруживаются многочисленные патологические фигуры митозов. Клеточный состав представлен веретеноклеточным, светлоклеточным и эпителиоидным компонентами. Наблюдаются многочисленные фокусы псевдопалисадных некрозов, а также участки с незначительным гиалинозом стромы. Проводился дифференциальный диагноз между злокачественной глиомой, медуллобластомой, злокачественной опухолью оболочек периферического нерва, метастазом меланомы (рис. 5).
Рис. 5. Клиническое наблюдение №3. Гистологическое исследование опухоли.
Злокачественная полиморфноклеточная веретеноклеточная опухоль с псевдопалисадными некрозами. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.
Иммуногистохимическое исследование выявило положительную экспрессию виментина; убедительных данных, подтверждающих экспрессию GFAP, синаптофизина, S-100 и SOX10 в опухолевых клетках, не выявлено.
Проведено прямое секвенирование по Сенгеру на приборе 3500 Genetic Analyzer Applied Biosystem, полученные результаты оценены с помощью программы Sequencing Analysis Software 6 для визуализации электрофореграммы и программы MegAlign для выравнивания исследуемого фрагмента на референсный геном.
В результате исследования мутаций генов H3F3A (K27 и G34), CTNNB1 (T41X, S33X), SMO (L412F, W535L, D473H) и DDX3X (R534X) не выявлено.
Проведена флюоресцентная гибридизация in situ на приборе Hybridazer DAKO. Полученные результаты оценены под флюоресцентным микроскопом Axio Imager A2 с помощью программы Isis. В результате исследования амплификаций генов MYC, MYCN и изохромосомы i17q не выявлено.
Выполнено высокопроизводительное секвенирование (NGS) со следующей панелью для выявления мутаций генов (ACVR1, AKT1, APC, ATRX, BCOR, BCORL1,BRAF, CDK6, SUFU, TERT, TP53, CDKN2A, CDKN2B, CIC, CTNNB1, DDX3X, EGFR, FGFR2, FGFR3, FUBP1, GNAQ, H3F3A, HIST1H3B, HIST1H3C, IDH1, IDH2, KDM6A, KLF4, KRAS, MLH1, MSH2, MSH6, MYB, MYBL1, MYC, MYCN, NF1, NF2, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, PTCH1, PTCH2, PTEN, PTPN11, RAF1, RB1, SETD2, SMARCA4, SMARCB1, SMO, SUFU, TERT, TP53) и со следующей панелью для выявления слияний генов (KIAA1549::BRAF, AFAP1::NTRK2, AGBL4::NTRK2, ATG7::RAF1, BCAN::NTRK1, BTBD1::NTRK3, c11orf95::RELA, C8orf34::MYBL1, CLIP2::MET, ETV6::NTRK3, EWSR1::PATZ, FGFR1::TACC1, FGFR3::TACC3, FYCO1::RAF1, JPX::FOXR2, LOC550643::FOXR2, MN1::BEND2, MN1::CXXC5, MYB::ESR1, MYBL1::MMP16, MYB::PCDHGA1, MYB::QKl, NAB2::STAT6, NACC2::NTRK2, NAV1::NTRK2, NFASC::NTRK1, PTPRZ1::MET, QKI::NTRK2, QKI::RAF1, SRGAP3::RAF1, SRGAP3::RAF1, TFG::MET, TPM3::NTRK1, VCL::NTRK2, YAP1::MAMLD1, BCOR (internal tandem duplication)).
Установлены мутации генов TP53 (c.818G>A (p.R273H)) и NF2 (c.716dupT (p.239L/LX) со сдвигом рамки считывания). Амплификаций и слияний генов нет.
Проведено исследование метилирования ДНК с анализом результатов на платформе molecularneuropathology.org с использованием Version v11b4.
Однако установить метиляционный класс опухоли не удалось, выявлен несбалансированный генотип со множественными добавками и делециями хромосом, в том числе делеция в локусе 14q32, где локализуется ген DICER1. Промотер гена MGMT не метилирован (рис. 6).
Рис. 6. Клиническое наблюдение №3. Молекулярное исследование опухоли методом оценки метилирования ДНК.
Зеленым цветом обозначены добавки хромосом, красным цветом — делеции хромосом.
После получения результатов исследований и длительных обсуждений нейроморфологов и биологов принято решение поставить диагноз злокачественной глиомы, наиболее вероятно глиобластомы, WHO Grade IV, H3K27M-дикий тип с мутациями генов TP53 (c.818G>A (p.R273H)) и NF2 (c.716dupT (p.239L/LX) со сдвигом рамки считывания).
Спустя полгода после очередного обновления метиляционного классификатора до версии 12.5, обезличенные IDAT-файлы, полученные при исследовании на приборе Illumina NextSeq 550, были снова анализированы, установлен метиляционный класс первичной интракраниальной саркомы с мутацией DICER1 и коэффициентом соответствия 0.95.
Пациентка умерла спустя 4 мес от начала проявления заболевания и 3 мес после удаления опухоли. Окончательно диагноз был верифицирован лишь через 6 мес после смерти пациентки.
Обсуждение
В настоящий момент мы становимся свидетелями того, как определение молекулярных характеристик опухолей различных органов и тканей прочно входят в рутинную практику патологов. Все чаще сталкиваемся с названиями опухолей, производными от ключевой иммуногистохимической особенности, генетической поломки, повторяющейся мутации или патогномоничного слияния: CD-34 фибробластическая опухоль, нейробластома с активацией FOX, десмопластическая миксоидная опухоль с мутацией SMARCB1, PATZ1-саркома и др. Благодаря молекулярным исследованиям наш кругозор расширяется, и первичное развитие мягкотканной CIC-саркомы в ЦНС уже не кажется невероятным. Для успешной диагностики подобных опухолей прежде всего нужно помнить, что первичные саркомы могут встречаться в ЦНС, и при возможности использовать современные молекулярные методики для диагностики и исследования.
В последние два года (2020—2022 гг.) впервые в 5-е издание Классификации ВОЗ опухолей ЦНС, в 5-е издание Классификации ВОЗ опухолей мягких тканей и в 1-е издание Классификации ВОЗ детских опухолей как самостоятельная нозологическая единица в раздел опухолей неясной дифференцировки была включена CIC-саркома (все классификации ВОЗ доступны по ссылке https://tumourclassification.iarc.who.int) [1—7].
CIC-саркома — злокачественная недифференцированная преимущественно мелкокруглоклеточная опухоль, развивающаяся у детей и взрослых, однако также может встречаться и в пожилом возрасте. Ранее из-за своего морфологического сходства с саркомой Юинга CIC-саркому относили к Юингоподобным саркомам или опухолям семейства саркомы Юинга. CIC-саркома показывала не только морфологическое сходство с саркомой Юинга, но и сходный иммунофенотип: позитивная экспрессия CD99 и FLI, но в отличие от саркомы Юинга CIC-саркома была иммунонегативна для NKX2-2 и не имела слияния EWSR1 с различными партнерами. Выявление характерного слияния CIC со следующими партнерами: DUX4, FOXO4, LEUTX, NUTM1 и NUTM2A, а также позитивная иммуногистохимическая экспрессия ETV4, WT1 и NUT позволили окончательно выделить CIC-саркому в самостоятельную нозологическую единицу. Для диагностики CIC-саркомы исследователи рекомендуют начинать с высокомолекулярных методов, например NanoString, или высокопроизводительного секвенирования; при отсутствии РНК-секвенирования можно использовать флюоресцентную гибридизацию in situ, а также применять иммуногистохимическое исследование для оценки ядерной экспрессии DUX4 [8, 9]. Мы, в свою очередь, при возможности рекомендуем после гистологической оценки с выявлением мелкоклеточной опухоли с округлыми ядрами и светлой цитоплазмой изучать метилирование ДНК, которое позволяет определять метиляционный класс опухоли, количественные изменения на хромосомах и статус метилирования гена MGMT (неметилированный во всех трех случаях описываемых сарком). Разумеется, по двум случаям делать выводы преждевременно, но в обоих наших наблюдениях CIC-сарком имелась делеция на локусе 1p; возможно, это является характерной особенностью данной опухоли и определение делеции 1p могло бы помочь в диагностике CIC-сарком.
Наиболее частыми транслокациями при CIC-саркоме становятся t(4;19)(q35;q13) и t(10;19)(q26;q13), однако никаких выраженных количественных изменений, за исключением небольших потерь, на длинном плече хромосом 4, 10 и 19, которые могли бы косвенно указывать на транслокацию, мы не обнаружили.
Аналогично тому, как CIC-саркома при накоплении новых знаний об особенностях опухоли, была выделена из опухолей семейства сарком Юинга, обособлена и первичная интракраниальная саркома с мутацией DICER1 (DICER1-саркома), вначале отнесенная к саркомам с мышечной дифференцировкой. И только в 2018 г. благодаря использованию в качестве метода исследования анализа метилирования ДНК она была признана самостоятельной нозологической единицей [10]. Мутация DICER1 характерна не только для первичной интракраниальной саркомы, но и для множества других опухолей ЦНС (пинеобластома, эмбриональная опухоль с многорядными розетками, бластома гипофиза, медуллоэпителиома глаза), а также опухолей легких (бластома легких), почек, щитовидной железы, яичников, шейки матки. Мутация DICER1 может возникать как в спорадических опухолях, так и при наследственном DICER1-синдроме [1, 11, 12]. Наиболее частым проявлением DICER1-синдрома является метастазирование плевропульмональной бластомы в головной мозг. Так, P. Roy и соавт. [13] отмечают фенотипическое сходство морфологической картины DICER1-сарком различной локализации с плевропульмональной бластомой.
Имея достаточно узкую специализацию в области нейроморфологии, впервые столкнувшись с первичной интракраниальной DICER1-саркомой и зная о возможном метастазировании DICER1-мутантной плевропульмональной бластомы в головной мозг, мы обратились к Классификации ВОЗ опухолей грудной полости [14] и обнаружили у нашей пациентки гистологическое сходство DICER1-саркомы с плевропульмональной бластомой. Однако при компьютерной томографии органов грудной клетки, сделанной в период пандемии COVID-19 перед госпитализацией в наш центр, у пациентки было исключено новообразование легких.
Анализируя гистологическую картину опухоли, мы, в отличие от J. Lee и соавт. [15], не нашли эозинофильных гранул. При мутационном анализе были выявлены мутации генов TP53 и NF2, в то время как C. Koelsche и J. Lee описали мутацию гена NF1 [10, 15], что указывает на разнообразие редчайшей первичной интракраниальной DICER1-саркомы.
К сожалению, не удалось получить кровь пациентки и мы не смогли оценить возможный наследственный характер мутации DICER1.
Как же заподозрить и диагностировать первичную интракраниальную DICER1-саркому?
Подобная злокачественная опухоль может развиваться в любом возрасте, она затрагивает оболочки мозга, макроскопически относительно ограничена, плотная, со следами кровоизлияний, характеризуется наличием соматической или наследственной мутации гена DICER1. Гистологически выглядит как злокачественная плеоморфная или веретеноклеточная опухоль, возможна мышечная или хрящевая дифференцировка, наличие эозинофильных гранул и миксоидной стромы, кровоизлияний и некрозов. Иммуногистохимически может быть позитивна на коллаген IV типа, строма опухоли богата ретикулином, а эозинофильные гранулы могут окрашиваться при PAS-реакции. Возможна позитивная экспрессия десмина, гладкомышечного актина, миогенина, а также ядерная экспрессия TLE1. Экспрессии GFAP, OLIG2, цитокератинов, EMA, S100, SOX10 и SOX2 быть не должно. Дифференциальный диагноз следует обязательно проводить с плевропульмональной бластомой (на основании клинических данных), а также с анапластической менингиомой, солитарной фиброзной опухолью, глиосаркомой и другими типами сарком (рабдомиосаркомой, фибросаркомой и синовиальной саркомой). В опухоли не должно быть следующих слияний и мутаций: слияния солитарной фиброзной опухоли NAB2::STAT6, альвеолярной радбомиосаркомы PAX3::FOXO1 и/или PAX7::FOXO1 и мутаций менингиом (NF2, TRAF7, KLF4, SMO, AKT1, SMARCB1) [1]. Однако в нашем случае при диагностировании первичной интракраниальной DICER1-саркомы с использованием анализа метилирования ДНК как раз и была выявлена мутация гена NF2, что демонстрирует, как мы еще мало знаем об этой опухоли.
Заключение
Таким образом, с появлением 5-го издания Классификации ВОЗ опухолей ЦНС, сложившееся мнение об опухолях ЦНС как о закрытой отдельной группе опухолей постепенно меняется, мы сталкиваемся с ситуацией «глобализации» опухолей, молекулярные исследования четко демонстрируют, что первичные саркомы не имеют однозначную локализацию и должны быть правильно диагностированы как в мягких тканях, так и в ЦНС. Наиболее многообещающим, простым в применении, но, к сожалению, дорогостоящим методом диагностики и исследования сарком на сегодняшний день является анализ метилирования ДНК [16]. Однако у этого метода есть существенное ограничение: метиляционный классификатор разработан только для опухолей ЦНС и сарком любой локализации. Изучив метиляционный профиль опухоли, мы возвращаемся к гистологической оценке, постепенно обучаясь оценивать клетки с округлыми ядрами и светлой цитоплазмой не только как возможную глиальную опухоль, но и как саркоматозный компонент, понимая, что опухоли с подобной гистологической картиной не так уж и редки, и вопрос выбора протокола лечения и ожидаемого ответа опухоли очень важен. Попутно следует ориентироваться и на клинические особенности, такие как отграниченность опухоли от прилежащей мозговой ткани, ее экспансивный экзофитный характер роста и связь с твердой мозговой оболочкой, что также может помочь заподозрить саркому. Текущее положение вещей, безусловно, заставляет искать новые методы диагностики и исследования опухолей. применять новые антитела и FISH-пробы, подбирать праймеры для оценки новых и новых мутаций и слияний генов, а также все шире использовать РНК-секвенирование и анализ метилирования ДНК в изучении метиляционного класса опухолей ЦНС и сарком.
Авторы сердечно благодарят Благотворительные фонды Константина Хабенского и «Подари Жизнь» за помощь в финансировании исследований по метилированию ДНК.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.