Экспрессия генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3A в группах пациентов с варикозной болезнью нижних конечностей с разной протяженностью патологического рефлюкса в большой подкожной вене

Читать метаданные

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение экспрессии связанных с ремоделированием актинового филамента генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3 в стенках варикозно измененных (ВВ) и неизмененных (НВ) вен у пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в большой подкожной вене (БПВ).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследованы 26 пациентов, которых разделили на две равночисленные группы: с протяженностью патологического рефлюкса до нижней трети бедра (13 пациентов) и до нижней трети голени (13 пациентов). После выделения РНК из парных (ВВ и НВ, 26 пар) сегментов БПВ от каждого пациента методом ОТ-ПЦР в реальном времени была проведена оценка на уровне мРНК относительной экспрессии изучаемых генов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показана разница в отношениях экспрессии (в ВВ к НВ внутри пар) гена ACTA1 между группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса (p=0,03). Выявлена дифференциальная экспрессия гена PLXNA4 в ВВ в группе пациентов с протяженностью рефлюкса до нижней трети бедра (p=0,04), а также между подгруппами НВ от пациентов с протяженностью рефлюкса до нижней трети бедра и НВ от пациентов с рефлюксом до нижней трети голени (p=0,03). Показана дифференциальная экспрессия в ВВ (p=0,02) в группе пациентов с рефлюксом до нижней трети бедра для гена SEMA3A, продуктом которого является лиганд рецептора PLXNA4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показана разница в экспрессии генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3, участвующих в процессах ремоделирования цитоскелета и, как следствие, венозной стенки, в образцах вен от пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в БПВ. Таким образом, протяженность патологического рефлюкса в магистральной вене, определяющая вероятность рецидива рефлюкса после процедуры ASVAL, связана с ремоделированием стенки вены. Выявленные гены могут стать перспективными терапевтическими мишенями.

Ключевые слова:

варикозная болезнь нижних конечностей

рецидив рефлюкса

цитоскелет

экспрессия генов

Авторы:

Короленя В.А.

ORCID: 0000-0002-1016-2156

Гаврилов К.А.

ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»;
Центр новых медицинских технологий ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0002-3839-3263

Севостянова К.С.

ORCID: 0000-0002-4110-8187

Шевела А.И.

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН;
ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»;
Центр новых медицинских технологий ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН

ORCID: 0000-0002-3164-9377

Филипенко М.Л.

ФГБУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН

ORCID: 0000-0002-8950-5368

Сметанина М.А.

ORCID: 0000-0001-6080-4615

Дата поступления:

16.08.2022

Дата принятия в печать:

03.10.2022

Список литературы:

Beebe-Dimmer JL, Pfeifer JR, Engle JS, Schottenfeld D. The epidemiology of chronic venous insufficiency and varicose veins. Ann Epidemiol. 2005;15(3):175-184. https://doi.org/10.1016/j.annepidem.2004.05.015
Onida S, Davies AH. Predicted burden of venous disease. Phlebology. 2016; 31(1 suppl):74-79. https://doi.org/10.1177/0268355516628359
Tuncer Çoban P, Dirimeşe E. Evaluation of quality of life after minimally invasive varicose vein treatment. Turk Gogus Kalp Damar Cerrahisi Derg. 2019;27(1):49-56. https://doi.org/10.5606/tgkdc.dergisi.2019.16867
Brake M, Lim CS, Shepherd AC, Shalhoub J, Davies AH. Pathogenesis and etiology of recurrent varicose veins. J Vasc Surg. 2013;57(3):860-868. https://doi.org/10.1016/j.jvs.2012.10.102
Zolotukhin IA, Seliverstov EI, Zakharova EA, Kirienko AI. Short-term results of isolated phlebectomy with preservation of incompetent great saphenous vein (ASVAL procedure) in primary varicose veins disease. Phlebology. 2017;32(9):601-607. https://doi.org/10.1177/0268355516674415
Smetanina MA, Korolenya VA, Ershov NI, Arslanbekov MM, Zolotukhin IA, Filipenko ML. Genetic factors leading to recurrent varicose veins after surgical treatment. J Vasc Surg Venous Lymphat Disord. 2021;9(2):537. https://doi.org/10.1016/j.jvsv.2020.12.008
Pollard TD, Goldman RD. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2018;10(7):a030288. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a030288
Suresh R, Diaz RJ. The remodelling of actin composition as a hallmark of cancer. Transl Oncol. 2021;14(6):101051. https://doi.org/10.1016/j.tranon.2021.101051
Perrin BJ, Ervasti JM. The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken). 2010;67(10):630-634. https://doi.org/10.1002/cm.20475
Laing NG, Dye DE, Wallgren-Pettersson C, Richard G, Monnier N, Lillis S, Winder TL, Lochmüller H, Graziano C, Mitrani-Rosenbaum S, Twomey D, Sparrow JC, Beggs AH, Nowak KJ. Mutations and polymorphisms of the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Hum Mutat. 2009;30(9):1267-1277. https://doi.org/10.1002/humu.21059
Nowak KJ, Wattanasirichaigoon D, Goebel HH, Wilce M, Pelin K, Donner K, Jacob RL, Hübner C, Oexle K, Anderson JR, Verity CM, North KN, Iannaccone ST, Müller CR, Nürnberg P, Muntoni F, Sewry C, Hughes I, Sutphen R, Lacson AG, Swoboda KJ, Vigneron J, Wallgren-Pettersson C, Beggs AH, Laing NG. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 1999;23(2):208-212. https://doi.org/10.1038/13837
Crawford K, Flick R, Close L, Shelly D, Paul R, Bove K, Kumar A, Lessard J. Mice lacking skeletal muscle actin show reduced muscle strength and growth deficits and die during the neonatal period. Mol Cell Biol. 2002;22(16):5887-5896. https://doi.org/10.1128/MCB.22.16.5887-5896.2002
Smolkin T, Nir-Zvi I, Duvshani N, Mumblat Y, Kessler O, Neufeld G. Complexes of plexin-A4 and plexin-D1 convey semaphorin-3C signals to induce cytoskeletal collapse in the absence of neuropilins. J Cell Sci. 2018;131(9):jcs208298. https://doi.org/10.1242/jcs.208298
Vreeken D, Bruikman CS, Stam W, Cox SML, Nagy Z, Zhang H, Postma RJ, van Zonneveld AJ, Hovingh GK, van Gils JM. Downregulation of Endothelial Plexin A4 Under Inflammatory Conditions Impairs Vascular Integrity. Front Cardiovasc Med. 2021;8:633609. https://doi.org/10.3389/fcvm.2021.633609
Lu D, Shang G, He X, Bai XC, Zhang X. Architecture of the Sema3A/PlexinA4/Neuropilin tripartite complex. Nat Commun. 2021;12(1):3172. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23541-x
Raimondi C, Ruhrberg C. Neuropilin signalling in vessels, neurons and tumours. Semin Cell Dev Biol. 2013;24(3):172-178. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2013.01.001
Guo S, Ren J, Li Z, Fan X, Qin L, Li J. Aqueous semaphorin 3A level correlates with retinal macular oedema and ganglion cell degeneration in patients with retinal vein occlusion. Acta Ophthalmol. 2019;97(3):273-278. https://doi.org/10.1111/aos.14079
Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1(2):581-585. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83
Korolenya VA, Gavrilov KA, Sevost’ianova KS, Shevela AI, Filipenko ML, Smetanina MA. Evaluation of Advantages of Lithium Chloride as a Precipitating Agent in RNA Isolation from Frozen Vein Segments. Bull ExpBiol Med. 2022;173(3):384-389. https://doi.org/10.1007/s10517-022-05554-8
Smetanina MA, Kel AE, Sevost’ianova KS, Maiborodin IV, Shevela AI, Zolotukhin IA, Stegmaier P, Filipenko ML. DNA methylation and gene expression profiling reveal MFAP5 as a regulatory driver of extracellular matrix remodeling in varicose vein disease. Epigenomics. 2018;10(8):1103-1119. https://doi.org/10.2217/epi-2018-0001
Сметанина М.А., Сипин Ф.А., Селиверстов Е.И., Золотухин И.А., Филипенко М.Л. Дифференциально экспрессирующиеся гены при варикозной болезни нижних конечностей. Флебология. 2020;14(2):122-134. https://doi.org/10.17116/flebo202014021122
Dugina V, Khromova N, Rybko V, Blizniukov O, Shagieva G, Chaponnier C, Kopnin B, Kopnin P. Tumor promotion by γ and suppression by β non-muscle actin isoforms. Oncotarget. 2015;6(16):14556-14571. https://doi.org/10.18632/oncotarget.3989
Zhang J, Nie Q, Si C, Wang C, Chen Y, Sun W, Pan L, Guo J, Kong J, Cui Y, Wang F, Fan X, Ye Z, Wen J, Liu P. Weighted Gene Co-expression Network Analysis for RNA-Sequencing Data of the Varicose Veins Transcriptome. Front Physiol. 2019;10:278. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.00278
Miller BM, Trybus KM. Functional effects of nemaline myopathy mutations on human skeletal alpha-actin. J Biol Chem. 2008;283(28):19379-19388. https://doi.org/10.1074/jbc.M801963200
Fan L, Yan H, Pellegrin S, Morigen, Mellor H. The Rif GTPase regulates cytoskeletal signaling from plexinA4 to promote neurite retraction. Neurosci Lett. 2015;590:178-183. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2015.02.010
Suto F, Ito K, Uemura M, Shimizu M, Shinkawa Y, Sanbo M, Shinoda T, Tsuboi M, Takashima S, Yagi T, Fujisawa H. Plexin-a4 mediates axon-repulsive activities of both secreted and transmembrane semaphorins and plays roles in nerve fiber guidance. J Neurosci. 2005;25(14):3628-3637. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4480-04.2005
Мирахмедова С.А., Селиверстов Е.И., Захарова Е.А., Ефремова О.И., Золотухин И.А. 5-летние результаты процедуры ASVAL у пациентов с первичными варикозными венами. Флебология. 2020;14(2):107-112. https://doi.org/10.17116/flebo202014021107
Worzfeld T, Offermanns S. Semaphorins and plexins as therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 2014;13(8):603-621. https://doi.org/10.1038/nrd4337

Закрыть метаданные

Введение

Варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) является широко распространенной сосудистой патологией [1], которая может привести к серьезному ухудшению качества жизни больного [2]. Совершенствование малоинвазивных методов лечения ВБНК вслед за научно-техническим прогрессом способствует сокращению числа послеоперационных осложнений, а также повышает доверие пациентов к лечению [3]. Однако даже набирающие популярность методы гемодинамической коррекции сами по себе не всегда позволяют достичь желаемого результата, несмотря на тщательный отбор пациентов. Подход, основанный на совместном исследовании клинических и молекулярно-генетических данных, способен объяснить причину послеоперационных рецидивов, не связанных с тактическими или техническими ошибками лечения [4]. Тот факт, что исследователи метода ASVAL связывают протяженность рефлюкса с частотой его послеоперационного рецидива [5], приводит к предположению, что связанные с рефлюксом патологические изменения в венозной стенке способны уменьшать шанс успешного исхода лечения. Вышеперечисленное дает возможность использовать протяженность рефлюкса в качестве признака, определяющего принадлежность пациентов к одной из экспериментальных групп.

Предварительные исследования [6] показали, что в группах пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в большой подкожной вене (БПВ) дифференциально экспрессируются гены, относящиеся к состоянию цитоскелета: ACTA1 и PLXNA4. Участие цитоскелета в развитии заболеваний объясняется его функциями, связанными не только с опорой и формообразованием, но и с обеспечением путей внутриклеточного транспорта, подвижностью клеток и делением. Эта структура является совокупностью микротрубочек, актиновых и промежуточных филаментов, а также связанных с ними белков [7]. Одним из самых важных структурных белков цитоскелета является актин, который участвует в переносе везикул, процессах деления, миграции клеток и ремоделирования хроматина [8]. Актин представлен несколькими изоформами с уникальными клеточными функциями [9]. Основной функцией гена скелетного актина альфа-1 (ACTA1) является обеспечение сокращения скелетной мускулатуры [10], что и определяет его преимущественную экспрессию в скелетных мышцах. Мутации в ACTA1 могут приводить к немалиновой миопатии [11], а нокаут этого гена у мышей летален [12]. Интересно, что нарушение нормального для клетки соотношения экспрессии изоформ актина часто обнаруживается при злокачественной трансформации клеток [8].

Плексин-А4 (PLXNA4) является корецептором семафоринов класса 3, необходимым для передачи сигналов с последующим ремоделированием цитоскелета [13]. Показано, что экспрессия PLXNA4 в эндотелии сосудов снижается при воспалениях, что может быть одной из причин атеросклероза из-за изменения морфологии эндотелиоцитов и их барьерной функции [14]. Его наиболее изученным внеклеточным лигандом является семафорин-3А (SEMA3A), связывающийся с PLXNA4 в комплексе с нейропилином [15], который выполняет множество лиганд-опосредованных функций в сосудах, нейронах и опухолях [16]. Было показано, что уровень белка SEMA3A был повышен в водянистой влаге пациентов с окклюзией вен сетчатки [17].

Цель исследования — изучение экспрессии на уровне мРНК генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3, связанных с ремоделированием актинового филамента, в варикозно измененных (ВВ) и неизмененных (НВ) венозных стенках пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в БПВ.

Настоящая работа является валидацией предыдущего исследования (выполненного методом массового секвенирования РНК) [6] с помощью ген-кандидатного подхода, осуществляемого с применением метода ПЦР в реальном времени на независимой выборке пациентов.

Материал и методы

Сбор образцов венозных стенок и формирование экспериментальных групп

Исследование было одобрено Этическим комитетом Центра новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины (ЦНМТ ИХБФМ) СО РАН (протокол №03 от 06.10.19) и осуществлено в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации. Объектом исследования являлись замороженные парные сегменты ВВ и НВ вен пациентов с ВБНК. Образцы вен, информационные согласия и анкеты пациентов были собраны на базе ЦНМТ ИХБФМ СО РАН в период с марта по ноябрь 2021 г. Критериями исключения пациентов служили посттромботические изменения глубоких вен нижних конечностей и отсутствие видимого варикозного расширения вен. Характеристика пациентов, участвующих в исследовании, приведена в табл. 1.

Таблица 1. Характеристики выборки пациентов

Параметр	Рефлюкс до н/3 бедра		Рефлюкс до н/3 голени		p¹
	медиана	диапазон	медиана	диапазон
Возраст, годы	52,5	28—73	50	28—68	0,48
Возраст манифестации ВБНК, годы	40	20—40	30	20—40	0,22
Продолжительность ВБНК, годы	19,5	3—33	21	3—30	0,91
Индекс массы тела, кг/м²	28,65	18,06—43,06	26,30	18,52-39,26	0,28
Мужчины, абс.	3		4		0,69
Женщины, абс.	10		9
C2², абс.	7		7		0,76
C3², абс.	2		4
C4², абс.	4		2

Примечание. ¹ — согласно критерию Манна—Уитни; ²— клинический класс по системе классификации CEAP.

Принцип деления пациентов на группы основывался на исследовании, в котором авторы связали протяженность рефлюкса в БПВ с частотой его рецидивов после проведенной веносохраняющей операции ASVAL [5]. Группы пациентов были сформированы на основе данных о протяженности патологического рефлюкса в БПВ: 1) с протяженностью рефлюкса до нижней трети бедра (до н/3 бедра, 13 пациентов) и 2) с протяженностью рефлюкса до нижней трети голени (до н/3 голени, 13 пациентов) (см. табл. 1). Протяженность рефлюкса определяли с помощью ультразвукового ангиосканирования вен.

Формирование групп/подгрупп для статистической обработки данных описано в пункте «Статистический анализ» ниже по тексту.

Выделение РНК и обратная транскрипция

Для сохранения профиля экспрессии генов на уровне РНК образцы вен помещали в жидкий азот сразу после извлечения. До момента выделения РНК сегменты вен хранили при температуре –80 °C. Тотальная РНК была выделена из гомогенизированных венозных стенок методом фенол-хлороформной экстракции, предложенным P. Chomczynski и N. Sacchi (2006) [18]. Качество и количество выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле и спектрофотометрически.

Для получения кДНК (комплементарной ДНК) 300 нг РНК каждого образца подвергали реакции обратной транскрипции согласно протоколу, представленному в работе [19].

ПЦР в реальном времени

Уровень экспрессии целевых генов определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Для этого был выполнен дизайн систем прямого и обратного праймеров на кДНК целевых генов (табл. 2) с использованием программ OligoAnalyzer и Annhyb222, и инструмента BLAST.

Таблица 2. Системы праймеров на кДНК целевых генов

Название гена	Прямой праймер	Обратный праймер
ACTA1	5’-CTACCCGCCCAGAAACTAGA-3’	5’-GAGCCATTGTCGCACAC-3’
PLXNA4	5’-GCAGCAGTGCGCTCTTAAC-3’	5’-AGACATATGCGATGACAGACGT-3’
SEMA3A	5’-ATGTTTATCGGAACAGATGTTG-3’	5’-CTTCCAGCAGAACCTCTTCTA-3’

Каждая реакционная смесь, кроме контроля ПЦР (без матрицы) и контроля обратной транскрипции (без обратной транскриптазы), содержала кДНК в количестве, соответствующем 12,5 нг РНК. Состав реакционной смеси соответствовал протоколу, указанному в работе [19].

Амплификацию проводили в термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США) следующим образом: денатурация кДНК при температуре 96 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов при режимах, специфичных системам праймеров (табл. 3) со съемом флуоресцентного сигнала на канале SYBR.

Таблица 3. Температурный режим амплификации продуктов ПЦР с системами праймеров на кДНК целевых генов

Этапы ПЦР	Плавление цепей	Отжиг праймеров	Элонгация	Детекция сигнала
Температура, °C	96	58—65*	72	75—82*
Время, с	6	10	10	5

Примечание. * — диапазон отображает разброс значений температуры между разными системами праймеров.

Каждый образец оценивали в трех технических повторах, при стандартном отклонении значения разницы в пороговых циклах трипликатов более 0,5 выбившийся повтор исключали из анализа. Стандартную кривую для каждой системы праймеров строили с помощью кратных разведений образца кДНК, приготовленного из венозного сегмента в той же параллели, что и исследуемые образцы.

Значение количества мРНК целевого гена, полученное посредством детекции количества кДНК, нормализовывали на значения количеств мРНК генов домашнего хозяйства ACTB и GAPDH [20] в этих же образцах. Таким образом получали нормализованное значение экспрессии генов (НЗЭГ), т.е. относительное значение количества транскриптов изучаемых генов в каждом образце (ВВ или НВ), полученное методом построения калибровочной кривой и нормализованное на значение количеств транскриптов генов домашнего хозяйства (по количеству клеточного материала) в тех же образцах. Такие нормализованные значения являются отображением относительного уровня экспрессии изучаемых генов и, следовательно, не имеют единиц измерения.

Статистический анализ

Всего в исследовании участвовали 26 пациентов с ВБНК, которые были разделены на две группы по протяженности рефлюкса в БПВ. Вследствие забора у каждого пациента варикозно измененного и неизмененного сегментов венозной стенки сформированы подгруппы ВВ и НВ, соответственно. С помощью пакетов программ qBase+, Microsoft Excel и Statistica были проведены следующие сравнения:

1. Попарное (26 пар ВВ-НВ от 26 пациентов) сравнение НЗЭГ в ВВ (случай) против НЗЭГ в НВ (контроль) от каждого пациента на всей выборке пациентов (рис. 1, а) проводили с помощью парного непараметрического критерия Вилкоксона. Полученные данные представлены в виде медиан парных отношений НЗЭГ в ВВ к НВ (Me(ВВ/НВ)), а также 95% доверительного интервала (ДИ) и p-value (p). Это сравнение проводили как дополнительное для выявления дифференциальной экспрессии генов в ВВ без учета влияния протяженности рефлюкса.

Рис. 1. Представление формирования групп/подгрупп для статистической обработки нормализованных значений экспрессии целевых генов.

До н/3 бедра (голени) — группа пациентов с протяженностью патологического рефлюкса до нижней трети бедра (голени); BB_i (НВ_i) —нормализованное значение экспрессии гена (НЗЭГ) в варикозно измененном (варикозно неизмененном) сегменте венозной стенки i-го пациента; ВВ_i/НВ_i — отношение НЗЭГ в варикозно измененном сегменте венозной стенки к таковой в варикозно неизмененном сегменте у i-го пациента; * — согласно парному критерию Вилкоксона; ** — согласно непарному критерию Манна—Уитни.

2. Попарное (по 13 пар ВВ-НВ от 13 пациентов в каждой из двух групп) сравнение НЗЭГ в ВВ (случай) против НЗЭГ в НВ (контроль) в каждой из двух групп пациентов (см. рис. 1, б) выполняли с помощью парного непараметрического критерия Вилкоксона. Полученные данные представлены в виде медиан парных отношений НЗЭГ в ВВ к НВ (Me(ВВ/НВ)), а также 95% доверительного интервала (ДИ) и p-value (p) для каждой из двух групп пациентов.

3. Сравнение отношений НЗЭГ в ВВ к НЗЭГ в НВ (внутри пары от каждого пациента) между двумя группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса (см. рис. 1, в) проводили с помощью непарного критерия Манна—Уитни (13 значений отношений из одной группы против 13 из другой). Полученные данные представлены в виде p-value (p).

4. Дополнительное исследование разницы между двумя группами пациентов в экспрессии гена PLXNA4 осуществляли отдельно в варикозно неизмененных сегментах вен, а также в варикозно измененных с целью выявления закономерностей изменения уровня экспрессии этого гена в каждой из подгрупп (ВВ или НВ) в зависимости от протяженности патологического рефлюкса (рис. 1, г). Дополнительный анализ проводили исходя из предположения о возможной роли изменения экспрессии PLXNA4 в НВ при разной протяженности рефлюкса, основанного на данных вышеперечисленных сравнений. Сравнение НЗЭГ в НВ (или ВВ) между двумя группами пациентов выполняли с помощью непарного критерия Манна—Уитни (13 НЗЭГ в НВ (или ВВ) из одной группы против 13 НЗЭГ в НВ (или ВВ) из другой). Полученные данные представлены в виде p-value (p).

Критический уровень значимости (p) принимали равным 0,05.

Результаты

Скелетный актин альфа-1

1. Дифференциальная экспрессия гена ACTA1 в ВВ по сравнению с НВ на всей выборке пациентов не была выявлена: Me(ВВ/НВ)=1,3 (95% ДИ 0,65—2,60; p=0,37).

2. В группах пациентов с протяженностью рефлюкса до н/3 бедра и до н/3 голени результат анализа показал следующие значения: Me(ВВ/НВ)=0,87 (95% ДИ 0,66—1,15; p=0,38) и Me(ВВ/НВ)=1,94 (95% ДИ 0,47—8,12; p=0,13) соответственно (рис. 2).

Рис. 2. Средние нормализованные значения экспрессии гена ACTA1 в группах пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в БПВ.

Графики получены с помощью пакета программ qBase+: столбцы отображают медиану значений экспрессии гена ACTA1, нормализованных на значения экспрессии генов ACTB и GAPDH; «усы» показывают разброс значений; p* — согласно критерию Манна—Уитни; НЗЭГ — нормализованное значение экспрессии гена; НВ — варикозно неизмененные сегменты вен; ВВ — варикозно измененные сегменты вен; ВВ/НВ — отношения НЗЭГ ACTA1 в ВВ к НВ (внутри пары от каждого пациента); н/3 – нижняя треть (бедра/голени), обозначение протяженности патологического рефлюкса в БПВ.

3. При сравнении отношений НЗЭГ ACTA1 в ВВ к НВ между группами пациентов было выявлено различие: у пациентов с протяженностью рефлюкса до н/3 голени отношения НЗЭГ в ВВ к НВ оказались выше по сравнению с таковыми у пациентов с протяженностью рефлюкса до н/3 бедра (p=0,03).

Таким образом, показана разница отношений НЗЭГ ACTA1 в ВВ к НВ между группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса в БПВ.

Плексин-А4

1. На всей выборке пациентов при парных сравнениях ВВ с НВ не была показана дифференциальная экспрессия в ВВ гена PLXNA4 (Me(ВВ/НВ)=1,3; 95% ДИ 0,94—1,81; p=0,18).

2. При разделении пациентов на группы по протяженности венозного рефлюкса была показана дифференциальная экспрессия PLXNA4 в ВВ (она оказалась больше, рис. 3) в группе пациентов с рефлюксом до н/3 бедра (Me(ВВ/НВ)=1,76; 95% ДИ 1,04—2,97; p=0,04). В группе пациентов с рефлюксом до н/3 голени не было обнаружено разницы между парными ВВ и НВ: отношение НЗЭК в ВВ к НВ составляло 1,01 ( 95% ДИ 0,65—1,56; p=0,84).

Рис. 3. Средние нормализованные значения экспрессии гена PLXNA4 в группах пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в БПВ.

Графики получены с помощью пакета программ qBase+: столбцы отображают медиану значений экспрессии гена PLXNA4, нормализованных на значения экспрессии генов ACTB и GAPDH; «усы» показывают разброс значений; p* — согласно парному критерию Вилкоксона; p** — согласно критерию Манна—Уитни; НЗЭГ — нормализованное значение экспрессии гена; НВ — варикозно неизмененные сегменты вен; ВВ – варикозно измененные сегменты вен; н/3 — нижняя треть (бедра/голени), обозначение протяженности патологического рефлюкса в БПВ.

3. При сравнении отношений НЗЭГ PLXNA4 в ВВ к НВ между группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса не выявили разницу (p=0,43).

4. При сравнении групп пациентов с разной протяженностью рефлюкса наблюдали разницу в экспрессии PLXNA4 именно для НВ. На рис. 3 продемонстрировано увеличение экспрессии PLXNA4 в НВ в группе пациентов с рефлюксом до н/3 голени в 1,64 раза по сравнению с НВ в группе пациентов с рефлюксом до н/3 бедра (p=0,03). В то же время сравнение ВВ с ВВ в разных группах пациентов не показало значимой разницы в экспрессии этого гена (p=0,41).

Семафорин-3А

Исходя из того, что продукт гена SEMA3A является секретируемым во внеклеточное пространство белком, связывающимся с PLXNA4, уместно исследовать экспрессию его гена на уровне белка. Однако в данном исследовании было решено сначала провести анализ экспрессии гена SEMA3A на уровне мРНК.

1. На всей выборке пациентов не была показана разница в экспрессии SEMA3A между парными ВВ и НВ (Me(ВВ/НВ)=1,54; 95% ДИ 0,65—3,33; p=0,49).

2. В группе пациентов с рефлюксом до н/3 бедра при парных сравнениях ВВ с НВ показана дифференциальная экспрессия SEMA3A в ВВ — она оказалась выше (Me(ВВ/НВ)=1,58; 95% ДИ 0,65—3,33; p=0,02). В группе пациентов с рефлюксом до н/3 голени дифференциальная экспрессия данного гена не выявлена (Me(ВВ/НВ)=0,80; 95% ДИ 0,21—2,02; p=0,60).

3. При сравнении отношений НЗЭГ SEMA3A ВВ к НВ между группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса не было установлено разницы (p=0,18).

Обобщение полученных данных об экспрессии генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3A у разных групп пациентов представлено в табл. 4.

Таблица 4. Результаты анализа экспрессии генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3A в группах исследования

Название гена	Вся выборка		Рефлюкс до н/3 бедра		Рефлюкс до н/3 голени
	Me(ВВ/НВ)¹ (95% ДИ)	p²	Me(ВВ/НВ)¹(95% ДИ)	p²	Me(ВВ/НВ)¹(95% ДИ)	p²
ACTA1	1,30 (0,65—2,60)	0,37	0,87 (0,66—1,15)	0,38	1,94 (0,47—8,12)	0,13
			p-value³: 0,03
PLXNA4	1,30 (0,94—1,81)	0,18	1,76 (1,04—2,97)	0,04	1,01 (0,65—1,56)	0,84
			p³=0,43
			НВ (н/3 бедра) в сравнении с НВ (н/3 голени): p⁴=0,03 ВВ (н/3 бедра) в сравнении с ВВ (н/3 голени): p⁴=0,41
SEMA3A	1,54 (0,65—3,33)	0,49	1,58 (0,65—3,33)	0,02	0,80 (0,21—2,02)	0,60
			p³=0,18

Примечание. ¹ — обозначение медианы парных отношений НЗЭГ в ВВ к НВ от каждого пациента. Значение отображает направление регуляции экспрессии в ВВ (случай) относительно НВ (контроль): >1 означает повышенную экспрессию гена относительно НВ; <1 — пониженную; ² — согласно парному критерию Вилкоксона. Проводили сравнение парных НЗЭГ в разных группах пациентов; ³ — согласно непарному критерию Манна—Уитни. Проводили сравнение отношений НЗЭГ ВВ к НВ (внутри пары от каждого пациента) между группами пациентов с разной протяженностью рефлюкса; ⁴ — согласно непарному критерию Манна—Уитни. Проводили сравнение НЗЭГ в НВ (или ВВ) между разными группами пациентов.

Обсуждение

Установление причин послеоперационных рецидивов способно помочь скорректировать тактику лечения для увеличения шансов благоприятных исходов лечения. Ранние исследования, которые основывались на сравнении экспрессии генов в варикозно измененных и неизмененных сегментах вен [21], были проведены без учета протяженности патологического рефлюкса. Мы предполагаем возможную связь протяженности рефлюкса в БПВ с патологическими молекулярными процессами, такими как ремоделирование цитоскелета клеток венозной стенки и, как следствие, ее ремоделирования.

Отличающийся от нормального фенотип клеток венозной стенки при ВБНК обусловлен ремоделированием актинового цитоскелета как минимум в процессах изменения клеточной формы и миграции [8]. Исследователи обнаружили эффект компенсации сдвига экспрессии одной изоформы актина другой, что сохраняет общее количество актина в клетке на одном уровне [22]. Таким образом, при изменении экспрессии одной изоформы актина компенсаторные механизмы сдвигают экспрессию других изоформ, что может приводить к нетипичному для клетки соотношению изомеров актинового филамента. Раннее исследователи уже показали увеличение экспрессии гена сердечного актина — ACTC1 — при ВБНК [20, 23], который может служить компенсацией нарушений ACTA1 [24].

В настоящем исследовании показано, что отношения экспрессии ACTA1 в ВВ к НВ у пациентов с ВБНК отличаются в группах пациентов с разной протяженностью рефлюкса. Как видно из рис. 2, в группе пациентов с протяженностью рефлюкса до н/3 бедра наблюдается тенденция к понижению экспрессии ACTA1 в ВВ по сравнению с НВ, а в группе с рефлюксом до н/3 голени, наоборот, отмечается тенденция к повышению экспрессии этого гена в ВВ, что может указывать на вероятную разнонаправленность в экспрессии. Полученные данные указывают на процессы ремоделирования актинового цитоскелета, которые ассоциированы с протяженностью рефлюкса. Пока сложно сказать, как именно эти события связаны между собой, однако можно предполагать связь между динамикой изменения изомерного состава актинового филамента и регуляцией ремоделирования цитоскелета посредством сигналов от рецептора PLXNA4 [25]. Функции гена этого рецептора связывают с развитием нервной системы [26], а также с состоянием эндотелиоцитов и моноцитов, нарушение которого способствует атеросклерозу [14]. В настоящем исследовании продемонстрировано, что в случае большей протяженности патологического рефлюкса уровень экспрессии PLXNA4 повышается в варикозно неизмененных сегментах вен. При большей протяженности рефлюкса уровень экспрессии PLXNA4 в НВ увеличивается почти до значений в ВВ (Me(ВВ/НВ)=1,1). Такие результаты могут свидетельствовать о том, что несмотря на отсутствие морфологических изменений в НВ, процессы, связанные с передачей сигналов от PLXNA4, более выражены у пациентов с большей протяженностью рефлюкса. Это может определять вероятность рецидива рефлюкса после ASVAL [5, 27]. В предварительном исследовании [6] не было выявлено разницы в экспрессии на уровне мРНК нейропилинов, которые образуют комплексы с PLXNA4 [15], однако не исключено, что при другом подходе возможно будет установить некоторые закономерности. Эти комплексы связываются с семафоринами, которые играют роль в воспалительных и аутоиммунных процессах, в частности, SEMA3A предположительно способствует заболеваниям микроциркулярного русла. Семафорины и плексины представляют собой перспективные лекарственные мишени для профилактики и лечения различных заболеваний [28]. В настоящем исследовании выявили дифференциальную экспрессию в ВВ на уровне мРНК гена SEMA3A в группе пациентов с протяженностью рефлюкса до н/3 бедра. Поскольку продуктом этого гена является секретируемый во внеклеточное пространство белок, для более явной картины необходимо проведение анализа на уровне белка. Тем не менее проведенная работа указывает на роль семафоринов в патогенезе ВБНК и на потенциал дальнейшего исследования.

Интересно, что без разделения пациентов на группы по протяженности рефлюкса в БПВ (т.е. на всей выборке пациентов) исследуемые гены не продемонстрировали различий в экспрессии между варикозно измененными и неизмененными сегментами вен, что говорит о том, что протяженность рефлюкса связана с выраженностью экспрессии генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3A.

Заключение

Показана разница в экспрессии генов ACTA1, PLXNA4 и SEMA3A, участвующих в ремоделировании цитоскелета и, как следствие, венозной стенки, в образцах вен от пациентов с разной протяженностью патологического рефлюкса в БПВ. Таким образом, протяженность патологического рефлюкса в магистральной вене, определяющая вероятность рецидива рефлюкса после процедуры ASVAL, связана с ремоделированием стенки вены. Выявленные гены могут стать перспективными терапевтическими мишенями.

Исследование выполнено при финансовой поддержке ПФНИ РФ 0245-2021-0006 в рамках научного проекта №121031300045-2 «Фундаментальные основы здоровьесбережения».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.А. Сметанина и В.А Короленя

Сбор и обработка материала — К.А. Гаврилов, К.С. Севостьянова, М.А. Сметанина, В.А. Короленя

Статистическая обработка данных — В.А. Короленя, М.А. Сметанина

Написание текста — В.А. Короленя, М.А. Сметанина

Редактирование — М.А. Сметанина

Обеспечение материалами исследования, административная и техническая поддержка — А.И. Шевела, М.Л. Филипенко

Авторы выражают благодарность И.А. Золотухину за идейное вдохновение.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

* Статья написана на английском языке, оригинальная версия находится на сайте журнала в открытом доступе.