Восстановление дефектов тканей в разных областях хирургии — актуальная проблема современности. В силу ряда причин отдаленные результаты лечения остаются неудовлетворительными для хирургов. Например, в сердечно-сосудистой хирургии используемые синтетические биопротезы не интегрируются в ткани и, как следствие, являются зоной повышенного риска инфекционных осложнений, а сосудистые аллографты повышают риск патологической кальцинации и дегенерации (из-за индуцированного иммунного ответа); в травматологии ограниченные калиброванные размеры эндопротезов сухожилий и часто значительная площадь повреждения приводят к необходимости применения трансплантатов [1, 2].

С учетом того что «идеальный» графт для замещения дефектов соединительнотканных и гладкомышечных структур отсутствует, создание трансплантатов путем удаления клеток из нативных органов становится чрезвычайно актуальным с позиций клинического применения [3].

Проведено исследование на основе замещения дефекта белочной оболочки. Принимая во внимание похожее строение с соединительнотканными структурами, можно предположить возможность использования данной методики в других отраслях хирургии.

Суть экспериментальной части исследования in vivo состояла в формировании искусственного дефекта белочной оболочки полового члена, выполнении пластики дефекта с использованием ксенотрансплантатов (трупной артерии, децеллюляризированной трупной артерии), оценке лабораторных показателей на 7, 14 и 30-е сутки после операции и морфологических исследований на 14-е и 30-е сутки после операции.

Экспериментальное исследование выполнено на 60 здоровых половозрелых самцах кроликов породы шиншилла. Все животные были разделены на две группы, в каждой из которых сформированы две подгруппы.

В послеоперационном периоде после вывода из эксперимента проводилось изучение выживаемости матрикса из трупной артерии человека, морфологической структуры трансплантата, уровня С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови (наличие и выраженность воспалительного ответа).

В 1-й группе (n=30) дефект белочной оболочки полового члена экспериментального животного замещен матриксом из трупной артерии человека. В подгруппе 1.1 (n=15) исследование лабораторных показателей выполнено на 7-е и 14-е сутки, а морфологическое исследование — на 14-е сутки после операции. В подгруппе 1.2 (n=15) исследование лабораторных показателей выполнено на 7, 14 и 30-е сутки после операции, а морфологическое исследование — на 30-е сутки.

Во 2-й группе (n=30) замещение дефекта белочной оболочки полового члена экспериментального животного выполнено матриксом из децеллюляризированной трупной артерии человека. В подгруппе 2.1 (n=15) лабораторные показатели оценены на 7-е и 14-е сутки, а морфологическое исследование осуществлено на 14-е сутки после операции. В подгруппе 2.2 (n=15) исследование лабораторных показателей проведено на 7, 14 и 30-е сутки, а морфологическое исследование — на 30-е сутки после операции.

Хирургическое вмешательство. Операция состояла из двух этапов: моделирования дефекта белочной оболочки полового члена и пластики данного дефекта ксенотрансплантатом.

Методика моделирования дефекта белочной оболочки полового члена. После обработки операционного поля выполняли доступ к белочной оболочке полового члена продольным разрезом длиной около 2 см по его дорзальной поверхности. Далее острым путем производили формирование дефекта белочной оболочки размером 10×7 мм.

Методика закрытия дефекта белочной оболочки матриксом. После формирования дефекта белочной оболочки производили его укрытие сосудистым матриксом. В сроки, определенные задачами исследования, экспериментальных животных выводили из эксперимента путем введения летальной дозы золетила (20 мг/100 г). Морфологическое исследование заключалось в светооптической микроскопии гистологических препаратов.

Для объективизации морфологических изменений в области искусственного дефекта белочной оболочки полового члена, замещенного ксенотрансплантатом, выполнено гистологическое исследование соответствующих микропрепаратов непосредственно перед хирургическим вмешательством, а также на 14-е и 30-е сутки после операции. В результате исследования микропрепаратов до имплантации установлено, что при рутинной окраске гематоксилином и эозином гистологических различий между замороженным фрагментом трупной артерии человека (далее — нативная артерия) и фрагментом децеллюляризированной трупной артерии человека (далее — децеллюляризированная артерия) не обнаружено. А при окрашивании по Маллори в стенке децеллюляризированной артерии эластическая мембрана была фрагментирована (из-за агрессивного воздействия энзимов в процессе обработки). В стенке нативной артерии мембрана четко визуализировалась и просматривалась на всем протяжении. Описанная картина полностью подтверждалась гистохимической реакцией по Вейгерту. При окраске по Гомори в стенке нативной артерии просматривалась плотная ретикулярная и коллагеновая сеть, которая отсутствовала в стенке децеллюляризированной артерии. Таким образом, исходное состояние обоих потенциальных ксенотрансплантатов в целом идентично. Однако фрагмент трупной артерии человека, который не подвергался какой-либо предварительной обработке (кроме замораживания), демонстрирует лучшую сохранность структурных элементов.

Через 14 сут после операции выполнено повторное гистологическое исследование. В результате у всех подопытных вокруг имплантированного матрикса обнаружена лимфогистиоцитарная воспалительная реакция с примесью гранулоцитов. У животных обеих групп отсутствовали какие-либо достоверные морфологические различия, гистологические признаки, выявляемые как при рутинной окраске, так и при использовании дополнительных гистохимических реакций (рис. 1).

Степень выраженности воспалительной инфильтрации распределялась следующим образом. В 1-й группе у 80% экспериментальных животных она имела выраженный характер, у 20% — умеренно-выраженный. Во 2-й группе удельный вес экспериментальных животных с выраженным характером воспалительной инфильтрации составил 86,6%, а с умеренновыраженным и слабым — по 6,7%.

С течением времени ситуация изменилась. В результате гистологического исследования через 30 сут после операции выявлены достоверные различия. Вокруг имплантированного фрагмента нативной артерии у животных 1-й группы сохранялся лейкоцитарный вал, наблюдались отложения депозитов зрелого коллагена. А вокруг децеллюляризированной артерии у животных 2-й группы воспалительно-клеточная инфильтрация не носила столь выраженного характера, отмечены единичные мононуклеарные клетки, а коллагеновые волокна представлены тонкими прослойками, в целом эти волокна были распределены равномерно (рис. 2).

Степень выраженности воспалительной инфильтрации распределилась следующим образом. В 1-й группе выраженный характер наблюдался у 20,0% экспериментальных животных, умеренновыраженный — у 73,3%, слабый — у 6,7%. Во 2-й группе выраженного характера воспалительной инфильтрации не обнаружено, а удельный вес экспериментальных животных с умеренновыраженным и слабым характером воспалительной инфильтрации составил 20 и 80% соответственно.

С учетом отсутствия нормального распределения (по критерию Шапиро—Уилка) для оценки достоверности различий между группами экспериментальных животных использован непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Установлено, что различия в степени выраженности воспалительной реакции вокруг ксенотрансплантатов (по результатам гистологического исследования) на 14-е и 30-е сутки после операции полностью достоверны (r=0,74; p<0,05).

Таким образом, предварительно замороженный фрагмент трупной артерии человека, используемый как ксенотрансплантат, отличается относительно лучшей сохранностью структур, обеспечивающих стабильность морфологии. Однако репаративные процессы достоверно лучше протекают при использовании децеллюляризированного фрагмента артерии — в частности, по истечении месяца после хирургического вмешательства воспалительно-клеточная инфильтрация минимальна.

Утверждаем, что некоторое нарушение структурной целостности соединительнотканного каркаса децеллюляризированной артерии компенсируется потенциальным снижением иммуногенности имплантируемого фрагмента (а значит, минимизацией риска дегенеративных процессов, некробиоза, патологической кальцинации), но в первую очередь — достоверным уменьшением интенсивности воспаления.

Тем не менее противоречивая картина подчеркнула важность предварительно запланированного углубленного исследования трансплантатов путем электронной микроскопии. В результате сканирующей электронной микроскопии во всех случаях получены изображения с хорошо распознаваемой клеточной структурой и элементами ультраструктуры (рис. 3).

У животных 1-й группы микрорельеф эндотелия с незначительными выростами плазмолеммы клеток, среди которых отмечается адгезия форменных элементов крови и отложения фибрина. Выявленная картина свидетельствует о предрасположенности к стазу крови, сладж-феномену (т.е. адгезии, агрегации и агглютинации форменных элементов крови с последующим разделением ее на конгломераты из клеток и плазму) и, как следствие, к развитию фиброза в зоне трансплантации. У животных 2-й группы в стенке децеллюляризированной артерии люминальная поверхность сосуда сглажена, нити фибрина и элементы крови отсутствуют. На поперечном срезе виден волокнистый сосудистый каркас с пористой структурой. В участках сшивания сосудистой стенки люминальная поверхность складчатая, с микроразрывами волокон (рис. 4 и 5).

Для объективизации наличия и определения степени выраженности воспалительного ответа у экспериментальных животных после хирургического вмешательства произведено количественное определение содержания СРБ в сыворотке крови на 7, 14 и 30-е сутки после операции.

В 1-й группе на 7-е послеоперационные сутки средний уровень СРБ составил 3,86±0,43 мг/л, на 14-е — 1,17±0,2 мг/л, на 30-е — 0,73±0,16 мг/л, во 2-й группе — соответственно 0,33±0,03, 0,23±0,03 и 0,11±0,02 мг/л. Статистический анализ показал, что различия в уровне СРБ в сыворотке крови подопытных животных во все сроки измерения достоверны, t-критерий составил –46,28, –25,95 и –14,84 (p<0,0001) (рис. 6).

Следовательно, анализ динамики уровня СРБ в сыворотке крови экспериментальных животных позволяет утверждать, что при замещении искусственного дефекта белочной оболочки полового члена децеллюляризированным матриксом воспалительная реакция выражена достоверно менее интенсивно, чем при использовании трупной артерии без предварительной обработки. Меньший исходный подъем и статистически достоверная тенденция более быстрого снижения уровня СРБ при использовании децеллюляризированного матрикса минимизируют риски инфекционных и иных осложнений в постоперационном периоде.

На фоне того, что синтетические биопротезы повышают риск инфекционных осложнений, а сосудистые аллографты — риск патологической кальцинации и дегенерации (вследствие индуцированного иммунного ответа), создание трансплантатов путем удаления клеток из нативных органов становится чрезвычайно актуальным с позиций клинического применения. Децеллюляризация обеспечивает получение матриксов, которые очень близки по составу и свойствам нативным органам, к тому же такие матриксы лишены видоспецифичности. В эксперименте in vivo сравнительно изучены морфологические и лабораторные результаты пластики искусственного дефекта белочной оболочки полового члена с использованием трупной артерии без предварительной обработки, или децеллюляризированной трупной артерии. На основе анализа данных оптической и электронной микроскопии можно утверждать следующее. Использование децеллюляризированной трупной артерии человека для пластики дефекта белочной оболочки полового члена в эксперименте in vivo представляется наиболее оптимальным с позиций снижения рисков отторжения и послеоперационных осложнений. При использовании в качестве ксенотрансплантата децеллюляризированного матрикса воспалительная реакция в постоперационном периоде краткосрочна и менее интенсивна. Лабораторно подтверждается, что исходный уровень СРБ в крови экспериментальных животных ниже, а нормализация его содержания происходит более динамично (p<0,0001). Гистологически — лимфогистиоцитарная воспалительная реакция с примесью гранулоцитов минимальна к 30-м суткам после операции (p<0,05).

Исходя из полученных результатов, можно предположить возможность использования децеллюляризированного матрикса не только для замещения дефектов белочной оболочки, но и для других соединительнотканных и гладкомышечных структур. Вместе с тем полагаем, что в перспективе методика децеллюляризации должна быть несколько изменена для лучшего сохранения базовых структурных элементов артерии.

При анализе результатов пластики искусственного дефекта белочной оболочки полового члена двумя видами ксенотрансплантатов в эксперименте установлены следующие факты.

При использовании в качестве ксенотрансплантата децеллюляризированного матрикса воспалительная реакция в постоперационном периоде краткосрочна и менее интенсивна.

Применение трупной артерии без предварительной обработки, по данным электронной микроскопии, предрасполагает к локальному стазу крови, сладж-феномену и развитию фиброза.

Использование децеллюляризированного матрикса для пластики дефекта белочной оболочки полового члена минимизирует риски отторжения трансплантата, инфекционных и иных осложнений в постоперационном периоде.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Кызласов Павел Сергеевич – доцент кафедры урологии и андрологии ИППО ГНЦ ФМБЦ им. А. И. Бурназяна ФМБА России, к.м.н., г. Москва, ул. Маршала Новикова, д.23, тел: +7(963)968-71-73; e-mail: dr.kyzlasov@mail.ru, http://orcid.org/0000-0003-1050-6198

Забелин Максим Васильевич – заведующий кафедрой онкологии и радиационной медицины ИППО ГНЦ ФМБЦ им. А. И. Бурназяна ФМБА России, проф., д.м.н., г. Москва, ул. Маршала Новикова, д.23, тел.: +7(915)013-20-19, e-mail: maximzabelin@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-9816-3614

Ачкасов Евгений Евгеньевич – заведующий кафедрой спортивной медицины и медицинской реабилитации, профессор кафедры госпитальной хирургии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), проф., д.м.н., 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел.: +7(903)733-07-76; e-mail: 2215.g23@rambler.ru, http://orcid.org/0000-0001-9964-5199

Трояков Владислав Маратович – заведующий хирургическим отделением, врач-уролог Городская поликлиника №1, г. Красноярск, ул. Академика Павлова, д. 4, стр.7; тел: 89048950899; e-mail: troyakov@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-6216-4954

Паклина Оксана Владимировна – заведующая патологоанатомическим отделением ГКБ им. С.П. Боткина, д.м.н., г. Москва, тел: +7(903)624-86-69, e-mail: dr.oxanapaklina@mail.ru, http://orcid.org/0000-0001-6373-1888

Сетдикова Галия Равилевна – врач патологоанатомического отделения ГКБ им. С.П. Боткина, к.м.н., г. Москва, тел.: +7(926)904-95-68, e-mail: dr.setdikоva@mail.ru , http://orcid.org/0000-0002-9524-3798

Самчук Денис Петрович – младший научный сотрудниклаборатории фосфолипидных нанолекарств и транспортных систем ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», г.Москва, Тел.: +7(916)451-22-55, e-mail: denis.samchuk@gmail.com, http://orcid.org/0000-0002-8430-9077

Кажера Анастасия Андреевна – ассистент кафедры урологии и андрологии ИППО ГНЦ ФМБЦ им. А. И. Бурназяна ФМБА России, г. Москва, ул. Маршала Новикова, д.23, тел: +7(925)317-14-60, e-mail: kazhera@inbox.ru, http://orcid.org/0000-0002-4108-4066

Кызласов Павел Сергеевич – доцент кафедры урологии и андрологии ИППО ГНЦ ФМБЦ им. А. И. Бурназяна ФМБА России, к.м.н., г. Москва, ул. Маршала Новикова, д.23, тел: +7(963)968-71-73; е-mail: dr.kyzlasov@mail.ru, http://orcid.org/0000-0003-1050-6198

Kyzlasov Pavel S. – PhD, Associate Professor at the Department of Urology and Andrology, IPPE of A.I. Burnazyan SSC FMBC of FMBA of Russia, Moscow, Marshal Novikova, 23; phone: +7(963)968-71-73; e-mail: dr.kyzlasov@mail.ru; http://orcid.org/0000-0003-1050-6198

Zabelin Maxim V. – MD, Professor, head of Department of Oncology and radiation medicine IPPE of A.I. Burnazyan SSC FMBC of FMBA of Russia, Moscow, Marshal Novikova, 23; phone: +7(916)013-20-19, e-mail: maximzabelin@mail.ru; http://orcid.org/0000-0001-9816-3614

Achkasov Evgeny E. – M.D., D.Sc. (Medicine), Prof., Head of the Department of Sports Medicine and Medical Rehabilitation of the Sechenov First Moscow StateMedical University (Sechenov University), 8-2, Trubetskaya St., 119991, Moscow, Russian Federation. теl.: +7(903)733-07-76; e-mail: 2215.g23@rambler.ru, http://orcid.org/0000-0001-9964-5199

Troyakov Vladislav M. – head of the surgical Department, doctor-urologist Municipal polyclinic № 1, Krasnoyarsk, st. Akademika Pavlova, 4/7, phone: +7(904)895-08-99; е-mail: troyakov@mail.ru; http://orcid.org/0000-0002-6216-4954

Pakhlinа Oksana V. – MD, head, morbid anatomy Department Municipal clinical hospital of S. P. Botkin, Moscow, 2-nd Botkinsky proezd, 5/16, phone: +7(903)624-86-69, е-mail: dr.oxanapaklina@mail.ru; http://orcid.org/0000-0001-6373-1888

Setdikova Galia R. – PhD, doctor mortuaries Department Municipal clinical hospital of S. P. Botkin, Moscow, 2-nd Botkinsky proezd, 5/16, phone: +7(926)904-95-68, e-mail: dr.setdikоva@mail.ru; http://orcid.org/0000-0002-9524-3798

Samchuk Denis P. — M.D., junior research fellow Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Pogodinskaja str., 10/8, Теl.: +7(916)451-22-55, e-mail: denis.samchuk@gmail.com; http://orcid.org/0000-0002-8430-9077

Kazhera Anastasia A. – assistant of the Department of urology and andrology IPPE of A.I. Burnazyan SSC FMBC of FMBA of Russia, Moscow, Marshal Novikova , 23; phone: +7(925)317-14-60, e-mail: kazhera@inbox.ru; http://orcid.org/0000-0002-4108-4066

Author to contact:

Kyzlasov Pavel S. – PhD, Associate Professor at the Department of Urology and Andrology, IPPE of A.I. Burnazyan SSC FMBC of FMBA of Russia, Moscow, Marshal Novikova, 23; phone: +7(963)968-71-73; e-mail: dr.kyzlasov@mail.ru; http://orcid.org/0000-0003-1050-6198