Гонорея - передаваемое половым путем инфекционное заболевание, вызванное гонококком (Neisseria gonorrhoeae). По данным ВОЗ [1, 2], ежегодно в мире регистрируют до 200 млн вновь заболевших гонореей. В России после некоторого снижения заболеваемости в 90-е годы ХХ столетия вновь отмечено увеличение количества больных до 102,2 на 100 тыс. населения [3]. Высокие темпы роста заболеваемости гонореей одновременно были отмечены в Эстонии, Болгарии, Чехии и ряде других стран. По данным литературы [4], в 2009 г. заболеваемость в странах, ведущих регистрацию гонореи, составила: в РФ - 48,1 на 100 тыс. населения, в США - 106 на 100 тыс. населения, в странах ЕС - 9,7 (от 27,6 в Великобритании до 1,0 в Греции) на 100 тыс. населения. В США в год официально регистрируют около 300–350 тыс. новых случаев заболевания[5].

Общепризнано, что заболеваемость населения, по крайней мере, в 2 раза выше официально зарегистрированной, поскольку гонорея протекает бессимптомно у 3-5% инфицированных, а также в статистические отчеты могут не попадать больные от частных врачей [6]. Учитывая то, что постановка правильного диагноза при инфекциях, передаваемых половым путем (ИППП), в том числе при гонорее, напрямую зависит от качества лабораторной диагностики, нарушения алгоритма лабораторной диагностики, а также, зачастую, несоблюдение предписаний основных регламентирующих документов вносит свой вклад в эту проблему.

Согласно определителю Берджи (1997 г.), гонококк относится к семейству Neisseriacae, роду Neisseria, виду Neisseria gonorrhoeae (Определитель Берджи, 1997). Род Neisseria представлен несколькими видами: N. canis, N. cinerea, N. denitrificans, N. elongate, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. lactamica, N. macacae, N. meningitides, N. mucosa, N. polysaccharea, N. sicca, N. subflava. Из перечисленных видов только два являются патогенными для человека - N. gonorrhoeae и N. meningitides. Патогенные микроорганизмы различных отделов урогенитального тракта представлены на рис. 1, а, б, в.

Биоматериалом для лабораторного обследования на гонококковую инфекцию является отделяемое из уретры, влагалища, шейки матки, из прямой кишки, глаз, глотки, секрет предстательной железы, моча, кровь. Прием антибиотиков и местные процедуры прекращают за 10 дней до взятия материала на исследование. У женщин рекомендуется брать материал перед менструацией. Перед взятием материала необходимо воздержаться от мочеиспускания в течение 3-4 ч и половых отношений, а также туалета наружных половых органов и спринцевания. Исследуемый материал не должен содержать примесей крови [8] .

Законодательная база лабораторной диагностики гонореи исторически представлена несколькими приказами. В настоящее время Приказ Минздрава СССР №1570 от 04.12.86 «Об улучшении выявления больных гонореей и трихомониазом в акушерских и гинекологических отделениях (палатах, кабинетах), женских консультациях и урологических кабинетах поликлиник (вместе с методическими рекомендациями) признан недействующим (приказ Минздрава РФ №398 от 23.12.02). Диагностика гонореи регламентирована приказом Минздрава СССР №535 от 22.04.85 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинической лабораторной диагностике лечебно-профилактических учреждений», приказом Минздрава РФ №64 от 21.02.2000 «Об утверждении Номенклатуры клинических лабораторных исследований», приказом Минздрава РФ №415 от 20.03.03 «Об утверждении протокола ведения больных гонококковой инфекцией». В настоящее время еще действует Приказ МЗ СССР №936 от 12.07.85 «Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза».

Согласно ныне действующим приказам, а также согласно клиническим рекомендациям (КР) Российского общества дерматовенерологов и косметологов «Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями», в перечень лабораторных исследований при подозрении на гонококковую инфекцию включены: микроскопия окрашенных препаратов и культуральное исследование (КР-2010), а в настоящее время, еще и молекулярно-биологические методы (КР-2011). Молекулярно-биологические методы (МБМ) направлены на обнаружение специфических фрагментов ДНК и/или РНК с использованием тест-систем, разрешенных к применению в России. КР-2012 впервые вводят в разряд рекомендуемых для диагностики ИППП эти методы, но не определяют порядка проведения и требований к выполнению исследований.

Оптимальным с точки зрения клинициста в лабораторной диагностике гонореи является использование простых отборочных тестов. Метод световой микроскопии наиболее удовлетворяет этим требованиям: клиницистов по причине оперативности получения результата, врачей клинической лабораторной диагностики благодаря простоте выполнения, а больных - из-за доступной стоимости. При этом не учитывается низкая чувствительность метода для биоматериала из цервикального канала (фарингиальные и ректальные пробы не используют для микроскопического исследования), а также в случаях ранней диагностики гонореи, бессимптомной инфекции и для некоторых вариантов гонококков.

Непонимание возможностей метода световой микроскопии - причина конфликта между клиницистами и врачами лаборатории. Именно на этом этапе получения квалифицированного результата микроскопического исследования и разгорается конфликт между клиницистами и врачами клинической лабораторной диагностики, поскольку для назначения соответствующего лечения клиницист требует от врача лаборатории заключение о наличии N.gonorrhoeae в исследуемом материале, несмотря на то что для видовой идентификации гонококка необходимо проведение культурального исследования, позволяющего выделить чистую культуру микроорганизма и идентифицировать ее по морфологическим и биохимическим признакам. Ответ по результатам посева выдается через 5 дней после взятия пробы. Выделение N. gonorrhoeae при культуральном исследовании является бесспорным доказательством наличия гонококковой инфекции. Огромный вклад в эту проблему внесли Приказы Минздрава СССР №1570 от 04.12.86 и №936 от 12.07.85, в которых при описании световой микроскопии как одного из методов диагностики гонококковой инфекции не совсем корректно используется термин «гонококк».

Для диагностики гонококковой инфекции применяется несколько вариантов окраски препаратов для световой микроскопии: метиленовым синим (обзорный препарат позволяет выявить признаки воспаления и описать морфотипы бактерий) и по методу Грама, для определения грам-принад­лежности диплококков. Дополнительно к классическим методам окраски при подозрении на гонококковую инфекцию согласно приказу МЗ СССР №936 от 12.07.85 используют окраску эозином с метиленовым синим (для выявления наряду с диплококками, морфологически сходными с гонококками, трихомонад и эозинофилов), а также бриллиантовым зеленым (для выявления трихомонад).

При световой микроскопии все виды рода Neisseria обладают одинаковыми морфологическими характеристиками: форма клеток - кокки, расположение клеток парами (кроме N. elongate, представленной в виде коротких цепочек, часто диплобацилл). Диплококки, морфологически сходные с гонококками, определяются в виде парных кокков, имеющих форму кофейных зерен, обращенных друг к другу вогнутыми сторонами, негативных при окраске по методу Грама. Диплококки располагаются внутриклеточно (внутри сегментоядерных лейкоцитов), в слизи, на эпителиальных клетках. Внутри лейкоцита - парами, группами, под разными углами друг к другу, а на эпителиальных клетках (внеклеточно) - в большом количестве рядами, перпендикулярно друг к другу внутри ряда (рис. 2).

Нередко в представлении врачей клинической лабораторной диагностики существует уверенность в том, что морфологическими признаками гонококковой инфекции является исключительно внутриклеточное расположение грамотрицательных диплококков. Так ли это? По данным литературы [9], для возбудителя гонореи характерно внутриклеточное расположение возбудителей в сегментоядерных лейкоцитах на всех стадиях болезни. В период первых клинических проявлений при наличии скудного слизисто-гнойного отделяемого гонококки обнаруживаются преимущественно на поверхности эпителиальных клеток в виде кокков, реже - тетракокков. В разгар заболевания, при обильном гнойном отделяемом, внутриклеточные диплококки доминируют. По мере снижения остроты процесса число внутриклеточных гонококков уменьшается и увеличивается их количество на поверхности эпителиальных клеток. Частота внутри- и внеклеточно расположенных гонококков зависит от периода заболевания. Характерным для гонореи является незавершенная фагоцитарная реакция, при которой микроорганизмы находят благоприятные условия для внутриклеточной персистенции. Кроме полинуклеаров, в фагоцитозе принимают участие макрофаги, эпителиальные клетки, а также лимфоциты. Последние обладают миграционным циклом и способствуют генерализации инфекции.

Следовательно, при световой микроскопии препаратов урогенитального тракта пациентов с подозрением на гонококковую инфекцию исследователь определяет морфологические характеристики возбудителя и его грам-принадлежность, что позволяет предположить наличие гонококковой инфекции, но не констатировать ее. Только три признака - форма (диплококки в форме кофейного зерна), локализация (преимущественно внутри лейкоцитов и на эпителиальных клетках), грам-принадлежность - позволяют предположить наличие гонококковой инфекции [10].

По данным литературы [11], чувствительность метода микроскопии препаратов отделяемого из уретры мужчин при окраске по Граму колеблется от 50 до 75% при бессимптомной инфекции - до 95% при выраженных проявлениях; у женщин - от 20% для материала из уретры до 37-50% для материала из половых путей. Чувствительность первичной микроскопии повышается до 97,3%, а специфичность - до 99,6 % при использовании комбинации метиленового синего и генцианового фиолетового, но только в отношении материала, полученного от мужчин [12]. Для снижения вероятности ложных результатов рекомендуют проведение повторной микроскопии. Микроскопия не рекомендована для материала из ротоглотки. Также метод имеет низкую чувствительность при исследовании ректальных мазков, полученных от женщин без проявления инфекции.

По данным Федеральной системы внешней оценки качества, за период с 2007 по 2010 г. ложноположительные результаты при выявлении возбудителей гонореи в препаратах отделяемого слизистой оболочки урогенитального тракта методом микроскопии наблюдались в 5,7% случаев, ложноотрицательные - в 0,5%. Причинами ошибок на аналитическом этапе являются неудовлетворительное качество мазков (43,4%), связанное с ошибками при фиксации препаратов, неравномерностью их окраски, наличием толстых участков с непрокрашенными клетками, недо- или переобесцвечиванием, а также нарушение методологии, когда часть лабораторий окрашивает препараты только метиленовым синим, хотя данный вид окрашивания не позволяет провести дифференциацию микроорганизмов по тинкториальным свойствам [13].

Согласно лабораторным критериям диагноза гонореи, принятым Европейским союзом (2002 г.), помимо обнаружения грам-отрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры мужчин, для постановки диагноза гонореи необходимо выделить N. gonorrhoeae и выявить антиген или нуклеиновую кислоту N. gonorrhoeae в клинических образцах. Для этого применяют культуральное исследование, включающее выделение и идентификацию гонококков в чистых культурах на специальных средах с обязательным проведением цитохромоксидазного теста, изучением сахаролитических свойств возбудителя, определением бета-лактамазной активности и чувствительности к антибиотикам, а согласно клиническим рекомендациям 2012 г., еще и МБМ. При исследовании выросших культур в мазках, окрашенных по модифицированному способу Грама, в случае правильной окраски в центре скоплений из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или отдельные участки мазков, окрашенные в фиолетовый цвет. Необходимо учитывать морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в скопления с более плотным центром и как бы беспорядочно рассыпанные по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в оранжево-красный цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы, а также особи неправильных округлых очертаний. Полиморфизм гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно стрептококкам и стафилококкам.

В процессе роста гонококки вырабатывают фермент - цитохромную оксидазу. Колонии гонококка окрашиваются в розовый, а затем в красный цвет и черный цвет уже через несколько минут после воздействия диметилпарафенилендиамина. Окраска происходит даже в тех случаях, когда колонии гонококка находятся под колониями других микроорганизмов.

Гонококковые колонии всегда оксидазоположительные, но оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, вырабатывающие в процессе своей жизнедеятельности цитохромную оксидазу. Поэтому такие колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать при окраске по модифицированному способу Грама.

Ошибками на аналитическом этапе при культуральном исследовании являются: сокращение алгоритма идентификации гонококков до определения оксидазной активности и окраски по Граму, а также ферментация глюкозы до кислоты. Несмотря на то что по ряду причин чувствительность однократного посева может не достигать 40%, в России однократный отрицательный ответ при микроскопии и посеве нередко служит основанием для выдачи окончательного отрицательного ответа.

При культуральной диагностике гонококковой инфекции затруднения возникают на этапе выделения штаммов, слабо ферментирующих глюкозу, а также сахарозоотрицательных штаммов N. subflava, N. meningitidis и глюкозоположительных штаммов N. cinerea. Поскольку непатогенные нейссерии, такие как N. cinerea, N. sicca, N. subflava, N. mucosa, напоминают рост N. gonorrhoeae, использование хромогенных сред не помогает в дифференциальной диагностике. Некоторые штаммы N. gonorrhoeae (они получили название ауксотипов), нуждаются в дополнительных веществах при культивировании на питательных средах. На сегодняшний день их известно около 30. Самым распространенным является ауксотип AHU, так как ему требуется аргинин, гипоксантин и урацил. Этот тип характеризуется высокой чувствительностью к пенициллину и часто бывает причиной бессимптомного инфицирования мужчин [6].

Рекомендуемые для диагностики гонореи молекулярно-биологические методы (КР-2012) также имеют ряд ограничений: полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для детекции ДНК или рРНК нельзя использовать при исследовании материала из зева и прямой кишки, а также для постановки диагноза у детей и контроля лечения; ложноотрицательный результат дают штаммы с продукцией β-лактамаз. Описаны случаи ложноположительного результата при тестировании образцов, содержащих N. subflava [14].

Тест амплификации нуклеиновых кислот (АНК) превосходит по чувствительности ПЦР и характеризуется одинаково высокой чувствительностью (более 96%) как при наличии симптомов, так и при бессимптомном течении инфекции у мужчин и у женщин [15]. Метод АНК используют для поиска возбудителя, в том числе и в моче, преимущественно у мужчин. Кроме того, доказана его эффективность для одновременной детекции гонококков и хламидий. Для исключения ложноотрицательных результатов из-за присутствия в материале ингибиторов амплификации требуется постановка контролей. Положительный результат теста в экстрагенитальном материале при низком уровне заболеваемости гонореей на территории требует подтверждения другим методом.

Анализ результатов культурального исследования отделяемого урогенитального тракта и материала из зева у пациентов Городской клинической больницы №14 им. В.Г. Короленко за 7 лет показал, что из 18 образцов, в которых были выявлены нейссерии, патогенные штаммы N. gonorrhoeae идентифицированы в 10 случаях (локализация: уретра - 5, цервикальный канал - 2, влагалище - 2, зев - 1), N. menengitidis - в 2 случаях (локализация в уретре). Непатогенные виды нейссерий выявлены в 6 случаях: N. mucosa - 1 (уретра), N. perflava - 3 (уретра), N. flava - 1 (влагалище), N. elongate - 1 (уретра). Следовательно, метод световой микроскопии препаратов, окрашенных по Граму, не может быть использован в качестве единственного для диагностики гонореи, поскольку не дает видовой идентификации микроорганизма.

Вариантов ответов о результатах микроскопического исследования, рекомендуемых Европейской ассоциацией по сексуальному и репродуктивному здоровью (2012) два. Согласно первому, в заключении указывают: обнаружены грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококками. Согласно второму: грамотрицательные внутриклеточные и/или внеклеточные диплококки, морфологически сходные с гонококками не обнаружены.

Данных анамнеза, клинической картины и положительных результатов микроскопии достаточно для установления диагноза гонореи только у мужчин с клиническими симптомами уретрита (Рекомендации Европейского союза, 2002). При исследовании биоматериала от женщин, детей, в случаях сексуального насилия, при исследовании материала из ротоглотки, конъюнктивы, прямой кишки необходимо проведение бактериологического исследования для идентификации N. gonorrhoeae.

Лабораторные критерии диагноза гонореи, принятые Европейским союзом (2002), включают обнаружение грамотрицательных внутриклеточных диплококков в мазках из уретры мужчин, выделение N. gonorrhoeae из клинического образца, выявление антигена или нуклеиновой кислоты N. gonorrhoeae. В случае обнаружения грамотрицательных диплококков препараты сохраняют в течение 3 мес.

Поскольку не существует тестов со 100% чувствительностью и специфичностью, для диагностики гонококковой инфекции необходимо проведение комплексного лабораторного обследования пациентов. Учитывая, что большинство лабораторий используют только бактериоскопию, качество диагностики гонореи находится на низком уровне.

1. Для массового скрининга на гонорейную инфекцию на сегодняшний день оптимально использование комбинации лабораторных методов: микроскопии материала с окраской по Граму и культурального исследования при условии проведения внутрилабораторного контроля качества.

2. Световая микроскопия позволяет только предположить наличие Neisseria spp. в исследуемом образце, но не позволяет провести видовую идентификацию N. gonorrhoeae.

3. Выявление диплококков, морфологически сходных с гонококками при световой микроскопии, в сочетании с данными анамнеза и клинической картиной позволяет диагностировать гонорею при наличии клинических симптомов уретрита только у мужчин.

4. Видовая идентификация N. gonorrhoeae возможна только при бактериологическом и молекулярно-биологическом исследовании.