Как повысить эффективность бактериоскопической диагностики микозов стоп?

Авторы:
  • А. П. Малярчук
    Медицинский институт непрерывного образования ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств», Москва, Россия
  • К. Росель
    Медицинский институт непрерывного образования ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств», Москва, Россия
  • Т. В. Соколова
    Медицинский институт непрерывного образования ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств», Москва, Россия
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2019;18(4): 428-436
Просмотрено: 767 Скачано: 36

Микозы стоп (МС) — инфекционные заболевания кожи и ногтей, требующие обязательного лабораторного подтверждения клинического диагноза. Среди возбудителей МС преобладают дерматомицеты: Trichophyton rubrum и Trichophyton mentagrophytes [1, 2]. T. rubrum за последние 15 лет в России верифицировался у больных МС в 65,7—92% случаев, в странах СНГ — в 93,6% [3—7]. В европейских странах соотношение T. mentagrophytes/T. rubrum составляет 1:10 [8, 9]. В Москве в 2005—2012 гг. в структуре дерматофитий в целом доля дерматофитии стоп (ДС) составила 82% [10].

Реформирование российского здравоохранения затронуло и микологическую службу. Основными методами диагностики МС по-прежнему считают бактериоскопический и бактериологический (культуральный). Централизация бактериологических лабораторий привела к значительному сокращению посевов для диагностики М.С. Врачи в своей практической деятельности зачастую используют только бактериоскопический метод.

В большинстве случаев материал с очагов поражения на коже берется для исследования путем соскоба скальпелем или предметным стеклом. Реже используют метод скотч-проб [11, 12]. Кусочки ногтей отрезают бритвой, маникюрными ножницами или кусачками. Место забора материала при онихомикозах напрямую зависит от формы заболевания, но всегда ногтевую пластинку следует срезать с захватом всей ее толщины, а исследуемый кусок ногтя должен находиться как можно дальше от свободного края. При выраженном подногтевом гиперкератозе роговые массы извлекают выскабливанием их из-под ногтевой пластинки. Материал направляют в лабораторию в бумажных пакетах из темной бумаги или в сухих закрытых микропробирках.

Микроскопическое исследование на грибы выполняют в нативных и окрашенных препаратах. Выделяют прямую (исследование патологического материала) и непрямую (исследование культуры гриба) микроскопию. Для прямой микроскопии готовят нативные препараты путем измельчения и заливки патологического материала 10—30% раствором щелочи (КОН или NaОН). Этот процесс называют мацерацией патологического материала [11]. Прямая микроскопия в практической деятельности врача обладает рядом преимуществ: простота исполнения, экономичность (нет необходимости использовать дорогостоящее обору-дование), быстрое подтверждение клинического диагноза, своевременное начало лечения и решение вопроса о выборе среды для культуральной диагностики. Чувствительность КОН-теста составляет 83,9% [11].

Для просветления препаратов можно использовать 10% раствор дисульфида натрия в этаноле, хлораллактофенол по Аману, лактофенол [13]. Сочетание КОН с димексидом нарушает структуру гриба [11]. При микроскопии препаратов можно получить как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты. Это зависит от качества взятия материала, сроков его хранения и особенностей транспортировки [11, 14—16]. Положительные результаты микроскопической диагностики подтверждаются культуральным методом в 28—60% случаев [17].

В НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина разработан и внедрен в практику метод микроскопии нативных препаратов с окраской калькофлюором белым — флюорохромным красителем, имеющим сродство к хитину и целлюлозе. При его смешивании с КОН в препарате происходит поглощение красителя фрагментами гриба [18]. При люминесцентной микроскопии видно зеленое свечение гифов, дрожжевых клеток, псевдомицелия. Краска флюоресцирует в ультрафиолетовом свете. Обнаружение грибов увеличивается на 10% по сравнению с КОН-тестом. Однако этот метод можно использовать только в лабораториях, где имеется флюоресцентный микроскоп с набором фильтров.

При ДС для взятия патологического материала можно использовать метод скотч-проб. Его эффективность при ДС изучена А.П. Малярчуком в 2016 г. [12]. Для этой цели прозрачный скотч размером с предметное стекло многократно с усилием прикладывают к очагу поражения до потери липкости (8—10 раз). Кусочки ногтя, обрывки пузырей приклеивают к скотчу, который помещают на предметное стекло с 30% раствором щелочи с глицерином липкой стороной книзу. Скотч заменяет покровное стекло. Препарат, приготовленный из тонких чешуек кожи, микроскопируют через 20—30 мин. Кусочки ногтя, обрывки пузырей помещают в щелочь на нес-колько часов. Приготовленный препарат может храниться несколько часов и даже суток.

В ходе выполнения кафедральной научно-исследовательской работы «Проблемы инфекционной патологии кожи», одной из задач которой было определить частоту ДС у больных, госпитализированных в стационары многопрофильного лечебного учреждения, возникла необходимость в совершенствовании бактериоскопического метода диагностики. Медико-экономические стандарты регламентируют сроки пребывания больных в стационаре, а обследование и лечение проводится только с учетом профильного для отделения диагноза (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29 декабря 2012 г. № 1706). Для разработки алгоритма дерматологического сопровождения больного с ДС, протекающей на фоне сопутствующей соматической патологии, потребовалось быстрое и эффективное подтверждение диагноза микотической инфекции.

Цель исследования: усовершенствовать метод бактериоскопической диагностики ДС и сравнить его эффективность с традиционным методом и методом скотч-проб.

Материал и методы

Диагностика ДС осуществлялась бактериоскопическим методом. Результат считали положительным при обнаружении нитей истинного септированного мицелия.

В стационарах многопрофильного лечебного учреждения обследованы 402 больных. Методами бактериоскопической диагностики ДС выявлены у 221 (54,9%) пациента. Использованы методы: традиционный (n=34), скотч-проб (n=44) и щелочное препарирование (ЩП) в шприце (авторский, n=51) и все три метода одновременно у одного пациента (n=92). На каждого больного с лабораторно подтвержденным диагнозом ДС заполняли унифицированную индивидуальную регистрационную карту «Клинико-эпидемиологические особенности ДС у больных в стационарах». Статистическая обработка материала проведена методами описательной и аналитической статистики, позволяющей определить различия между значениями показателей в выборках (р<0,05).

Результаты

На первом этапе исследования у 34 (15,4%) больных был использован традиционный метод забора материала. Сразу был отмечен ряд недостатков для его применения у больных в соматических стационарах:

1. Отсутствие специального помещения для забора материала. Процедура выполнялась в палате и нередко вызывала негативную реакцию со стороны других больных. В связи с этим необходимо было за минимальный срок получить достаточное количество материала.

2. Обычно препарат для микроскопии готовится на предметном стекле с использованием 10, 20, 30% раствора КОН. Щелочь быстро кристаллизуется, что сильно затрудняет процесс микроскопии, в связи с этим препарат обычно просматривается однократно после короткого времени экспозиции в щелочи.

3. Транспортировка материала в лабораторию и его подготовка к микроскопии обычно занимают 1—3 дня и зависят от организационных моментов и характера материала (кожа или ногти). За время исследования некоторые больные выписывались из стационара, результат исследования не попадал в выписной эпикриз и в лучшем случае сообщался пациенту по телефону или электронной почте. Кроме того, при перемещении патологического материала из пробирки/пакета на предметное стекло происходили его частичная потеря и рассеивание в помещении. В соответствии с этим был оптимизирован метод забора материала и процесс его подготовки к микроскопии.

На втором этапе у 44 (19,9%) больных забор материала с пораженных участков кожи стоп осуществляли методом скотч-проб, который в эпидемиологическом плане менее опасен для пациентов, находящихся в одной палате с больным. Однако он был не совсем удобен для исследования кусочков ногтевых пластинок. При их неравномерном растворении в щелочи толщина препарата была различной, что создавало трудности при микроскопии.

С учетом высокой частоты поражения ногтевых пластинок, наличия выраженного гиперкератоза (что требует более длительного растворения патологического материала в щелочи) предложен метод, названный нами щелочным препарированием (ЩП) в шприце.

Описание метода. Материал для исследования с очагов поражения на стопах (соскобы чешуек, мацерированного эпидермиса, обрывки покрышек пузырей, фрагменты гиперкератоза с кожи и из-под ногтей и т. д.) помещают в шприц (5 мл) после извлечения из него поршня. Затем вставляют поршень в шприц, плотно прижимая материал.

Для просветления и растворения патологического материала готовят специальный состав: КОН 30 г, глицерин 10 мл и дистиллированная вода до 100 мл. Через иглу в шприц набирают небольшое количество этого раствора, обычно 0, 5—1 мл. Патологический материал должен быть полностью погружен в жидкость. Время экспозиции зависит от плотности материала, взятого для исследования, и соответствует времени, которое необходимо для его растворения. Оно определяется визуально при периодическом встряхивании шприца. Затем иглу снимают и 1—3 капли взвеси из шприца помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, прижимают для равномерного распределения взвеси, удаляют вытекающую из-под стекла лишнюю щелочь (промакивают). Микроскопируют под малым (ув. 10), затем средним (ув. 40) увеличением микроскопа. При отрицательном результате выполняют повторную микроскопию оставшегося в шприце материала.

Метод ЩП в шприце был применен нами у 51 (23,1%) больного. Недостатки, имевшие место при традиционном методе и методе скотч-проб, были устранены.

Четвертый этап исследования был посвящен сравнительному анализу эффективности трех перечисленных выше методов у 92 (41,6%) больных. Для этого у каждого пациента брали материал одновременно тремя методами. Онихомикоз имели 78 (84,8%) больных.

Сравнительный анализ эффективности трех методов лабораторной диагностики (традиционный, скотч-проб, ЩП в шприце) соскобов эпидермиса у 92 больных ДС отражен в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительный анализ эффективности различных методов лабораторной диагностики при исследовании соскобов эпидермиса у больных с ДС (n=92) Примечание. * — зависело от топики процесса (подошвы, межпальцевые складки, боковая поверхность стоп и т. д.); ** — проводилось до получения положительного результата.

Наибольшее число положительных результатов зарегистрировано при использовании метода ЩП в шприце (91,1%). Традиционным методом диагноз подтверждали в 1,5 раза реже (60,9%; р<0, 05), методом скотч-проб — в 1,3 раза реже (68,5%; р<0,05). Достоверных отличий при сравнении последних двух методов не выявлено (p>0,05).

Определенный интерес представляла оценка эффективности трех рассматриваемых методов диагностики при различных клинических формах Д.С. Для получения достоверных статистических данных в одну группу объединены больные со сквамозной и сквамозной + интертригинозной формами (n=48), в другую — с изолированной интертригинозной, дисгидротической формами и их сочетанием (n=19).

При сквамозной форме ДС (рис. 1)

Рис. 1. Формы Д.С.: сквамозная (а); сквамозная + интертригинозная (б).
наилучшие результаты показали методы скотч-проб (91,6%) и ЩП в шприце (95,8%) (рис. 2).
Рис. 2. Сравнительный анализ эффективности бактериоскопической диагностики ДС различными методами с учетом клинических форм заболевания (n=92).
Положительный результат при использовании традиционного метода зарегистрирован в 66,7% случаев. При сквамозно-гиперкератотической форме (рис. 3)
Рис. 3. Сквамозно-гиперкератотическая форма ДС.
эффективность методов распределялась в следующей последовательности: ЩП в шприце (96%), скотч-проб (80%) и традиционный (44%). При вариантах ДС, протекающей с наличием экссудативных морфологических элементов и эрозий (дисгидротическая, интертригинозная и их сочетание), метод скотч-проб был менее эффективным (21,1%) (рис. 4, 5).
Рис. 4. Интертригинозная форма ДС.
Рис. 5. Дисгидротическая форма ДС.
Традиционный метод и метод ЩП в шприце по эффективности практически не отличались (78,9 и 73,7% соответственно).

Сравнительный анализ эффективности двух методов лабораторной диагностики (традиционный и ЩП в шприце) срезов ногтевых пластинок у 65 больных ДС отражен в табл. 2.

Таблица 2. Сравнительный анализ эффективности двух методов лабораторной диагностики при исследовании срезов ногтевых пластинок у больных с ДС (n=65)

Метод ЩП в шприце оказался в 1,4 раза эффективнее (70,8% против 50,7%; р<0,05). Результаты исследования напрямую зависели от толщины ногтевых пластинок. При нормотрофическом и гипертрофическом типах, но с минимальным гиперкератозом ногтевых пластинок оба метода давали положительный результат. При выраженном подногтевом гиперкератозе преимущество было у метода ЩП в шприце.

На рис. 6 представлены

Рис. 6. Эффективность метода ЩП в шприце (посуточно).
данные об эффективности метода ЩП в шприце при исследовании соскобов эпидермиса и фрагментов ногтевых пластинок с учетом сроков растворения патологического материала в щелочи. Из 82 больных с ДС при положительном результате исследования методом ЩП в шприце диагноз в 1-е сутки был подтвержден в 85,5% случаев. На 2-е сутки возбудитель был обнаружен еще у 9,7% больных, на 3-и — еще у 14,8%. При исследовании срезов ногтевых пластинок на 2-е сутки число положительных результатов было в 1,7 раза больше (56,5% против 32,6%; р<0,05). На 3-и сутки еще у 10,9% больных обнаружены нити мицелия.

Результаты исследования наглядно свидетельствуют о преимуществе метода ЩП в шприце. При минимальных затратах получен оптимальный результат.

Сравнительный анализ двух методов лабораторной диагностики при ДС отражен в табл. 3.

Таблица 3. Преимущества методов скотч-проб и ЩП в шприце при ДС

Вывод

Для бактериоскопической диагностики патологического материала при ДС разработана новая методика ЩП в шприце. Ее эффективность при исследовании соскобов эпидермиса (91,1%) в 1,5 раза выше, чем при традиционном методе (60,9%; р<0,05), и в 1,3 раза выше, чем при методе скотч-проб (68,5%; р<0,05). При исследовании срезов ногтевых пластинок новая методика в 1,4 раза эффективнее традиционного метода (70,8 и 50,7%; р<0,05). Число положительных результатов при всех методах бактериоскопической диагностики зависит от клинической фор-мы ДС и максимально при использовании метода ЩП в шприце. Эффективность последнего метода возрастает посуточно, особенно при исследовании срезов ногтевых пластинок.

Список сокращений

Дерматофитии стоп — ДС

Микозы стоп — МС

Щелочное препарирование — ЩП

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.В. Соколова, А.П. Малярчук

Подбор литературы — А.П. Малярчук, К.В. Монтес Росель

Работа с больными, сбор и обработка материала — К.В. Монтес Росель

Подготовка иллюстраций — Т.В. Соколова, А.П. Малярчук, К.В. Монтес Росель

Написание текста — Т.В. Соколова, К.В. Монтес Росель

Редактирование — А.П. Малярчук

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — T.V. Sokolova, A.P. Malyarchuk,

Selection of literature — A.P. Malyarchuk, K.V. Montes Rosel

Working with patients, collecting and interpreting the data — K.V. Montes Rosel

Preparation of illustrations — T.V. Sokolova, A.P. Malyarchuk, K.V. Montes Rosel

Drafting the manuscript — T.V. Sokolova, K.V. Montes Rosel,

Revising the manuscript — A.P. Malyarchuk

Сведения об авторах

Малярчук А.П. — https://orcid.org/0000-0003-2559-846X

Монтес Росель К.В. — https://orcid.org/0000-0002-8480-4297

Соколова Т.В. — https://orcid.org/0000-0002-5450-4218

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Малярчук А.П., Монтес Росель К.В., Соколова Т.В. Как повысить эффективность бактериоскопической диагностики микозов стоп? Клиническая дерматология и венерология. 2019;18(4):-435. https://doi.org/10.17116/klinderma201918041

Список литературы:

  1. Кожичкина Н.В. Этиология микозов стоп и онихомикоза. Вестник дерматологии и венерологии. 2013;1:9-13.
  2. Сергеев Ю.В., Баранова М.О., Савченко Н.В., Сергеев А.Ю. Аморолфин и современная практика лечения онихомикозов. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2016;1:84-94.
  3. Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматомикозы: руководство для врачей. СПб.; 2003.
  4. Хисматулина И.М. Микоз стоп: рационализация терапии. Дис….. канд. мед наук. М.; 2009.
  5. Захарченко Н.В. Заболеваемость военнослужащих микозами стоп. Современные иммунологические показатели, роль их коррекции. Дис… канд. мед. наук. Новосибирск; 2009.
  6. Савенко Е.Л. Особенности клиники и течения сочетанных поражений кожи стоп. Дис. …канд. мед наук. Новосибирск; 2012.
  7. Усубалиев М.Б. Клинико-эпидемиологический мониторинг дерматомикозов в Кыргызской Республике, совершенствование лечения и профилактики. Автореф. дис… докт. мед. наук. Бишкек; 2014.
  8. Mügge C, Haustein UF, Nenoff P. Onychomykosen — eine retrospektive Studie zum Erregerspektrum. J Dtsch Dermatol Ges. 2006;(4):218-228. https://doi.org/10.1111/j.1610-0387.2006.05877_1.x
  9. Drakensjö IT, Chryssanthou E. Epidemiology of dermatophyte infections in Stockholm, Sweden: a retrospective study from 2005—2009. Med Mycol. 2011;49:484-488. https://doi.org/10.3109/13693786.2010.540045
  10. Сергеев Ю.В., Савченко Н.В., Сергеев А.Ю. Возможности и перспективы местной и комбинированной терапии онихомикозов во второй декаде XXI века. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012;3:73-80.
  11. Сергеев А.Ю., Сергеев В.Ю. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. М: Бином; 2008.
  12. Малярчук А.П. Использование метода скотч-проб для диагностики микозов стоп. Дерматовенерология и косметология: Синтез науки и практики, IV межрегиональный форум. 2016:51.
  13. Родионов А.Н. Грибковые заболевания кожи. Руководство для врачей. 2-е издание. СПб.: Из-во Питер; 2000.
  14. Лещенко В.М. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. М.: Медицина; 1982.
  15. Рукавишникова В.М. Микозы стоп. М.: Эликс Ком; 2003.
  16. Зачиняева А.В., Москалев А.В., Андреев В.А., Cбойчаков В.Б. Медицинская микология. Руководство для врачей. М.: ГЕОТАР-Медиа; 2018.
  17. Котрехова Л.П. Этиология, патогенез, клинические формы микоза стоп и основные методы его лечения. РМЖ. Дерматология. 2010;18(12):770-773.
  18. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Разнатовский К.И. Дерматомикозы, или поверхностные микозы кожи и ее придатков — волос и ногтей. Лабораторная диагностика. Проблемы медицинской микологии. 2008;10(1):27-34.