Псориаз является хроническим, рецидивирующим иммуноопосредованным дерматозом, которым страдает 2—3% населения мира. Ухудшение качества жизни при тяжелом течении псориаза сопоставимо с раком, инфарктом миокарда и депрессией [1]. В связи с высокой частотой встречаемости во всем мире и особенностями клинической картины псориаз интересует многих ученых как в прикладных, так и в фундаментальных исследованиях [2].

Несмотря на постоянно совершенствующиеся методы терапии, данный дерматоз до сих пор неизлечим. К тому же ни один из множества подходов к лечению псориаза нельзя назвать идеальным [1]. При выборе метода терапии учитывают степень тяжести и локализацию кожных поражений, связанные с пациентом особенности (возраст, сопутствующие заболевания, предыдущие методы лечения, которые оказались неэффективными) и характеристики самого метода — вопросы эффективности и безопасности. Показанием для назначения системного лечения является среднетяжелая и тяжелая степень псориаза [3]. Однако длительное использование привычных системных методов ограничено в основном плохой переносимостью и кумулятивной токсичностью, включая гепатотоксичность метотрексата, нефротоксичность циклоспорина и канцерогенез кожи при фототерапии, в частности при применении фотосенсибилизаторов в сочетании с UVA-лучами (ПУВА) [4]. При тяжелом течении псориаза долгосрочное использование биопрепаратов более целесообразно из-за лучшей переносимости и безопасности, но большой проблемой остается их высокая стоимость [3]. Таким образом, актуальной остается цель поиска новых эффективных и экономичных схем системной терапии псориаза с минимальными побочными реакциями.

Фототерапия является одним из старейших методов лечения в дерматологии. За последние несколько десятилетий разработаны и внедрены многие виды фототерапии для лечения псориаза, в том числе с 1988 г. узкополосная фототерапия (NB-UVB) с длиной волны 311 нм [5]. Действие NB-UVB обусловлено тем, что ультрафиолетовый свет вызывает апоптоз кератиноцитов и Т-клеток в эпидермисе и дерме. УФ-свет также содействует иммуносупрессии, способствуя миграции клеток Лангерганса из эпидермиса, уменьшая дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина [6].

Еще один метод системного воздействия на течение псориаза — терапия препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана. Его иммуносупрессивное действие заключается в подавлении реакций гуморального и клеточного иммунитета. Он способен обратимо снижать общее количество лимфоцитов в периферической крови, а также уровни Т-хелперов и Т-супрессоров. В результате терапии данным препаратом уменьшается количество маркеров активации на лимфоцитах и подавляется пролиферация Т-клеток. Важно отметить при этом отсутствие токсичности и эффективность в низких концентрациях [7].

В настоящее время большую роль в развитии патологического процесса при псориазе отводят Т-регуляторным клеткам (Treg). В норме их функция направлена на подавление воспаления и аутоиммунных реакций. Специфичным маркером Treg является транскрипционный фактор Foxp3, посредством которого реализуется их супрессорная активность. Экспрессия Foxp3 необходима для развития и функционирования Т-регуляторных клеток [8].

По данным предыдущих исследований, оценивающих уровень экспрессии Foxp3⁺ Т-регуляторных клеток среди клеток мононуклеарного инфильтрата дермы при псориазе, он изменялся в зависимости от стадии заболевания — был наиболее выражен в прогрессирующей стадии и уменьшался уже в стационарной, а также в регрессирующей и коррелировал с PASI [9, 10, 11]. Вместе с тем существуют противоречивые данные о том, что количество Foxp3-позитивных клеток в мононуклеарном инфильтрате дермы никак не зависит от тяжести и стадийности заболевания [9] и что уровень экспрессии Foxp3⁺ возрастает после проведенного лечения [12]. Другие исследователи заявляют, что количество Foxp3⁺ Т-клеток при псориазе больше в эпидермисе, чем в дерме [13]. Полагают, что причинами этих несоответствий могут быть различия в методологии обнаружения Foxp3-позитивных клеток, количестве исследуемых пациентов, в том числе при разных стадиях заболевания, а также в проводимой терапии [10]. Это побудило нас изучить экспрессию Foxp3⁺ Т-регуляторных клеток в биоптатах кожи пациентов до и после применения различных схем лечения, сравнить результаты с данными предыдущих исследований и сделать вывод о возможности использовать этот маркер для оценки эффективности терапии псориаза.

Цель исследования — оценить экспрессию Foxp3⁺ T-регуляторных клеток в псориатических бляшках пациентов при различных иммуносупрессивных схемах лечения и на основании полученных данных сделать выводы об эффективности каждой из них.

Материал и методы

В рамках когортного открытого проспективного рандомизированного контролируемого исследования задействовали 96 больных прогрессирующей стадией вульгарного псориаза, находящихся на стационарном лечении в БУЗ Омской области «ККВД». Исследование проведено согласно разработанному и утвержденному дизайну, представленному в [7].

Тяжесть псориатического процесса и его динамику оценивали с помощью дерматологического индекса — Psoriasis Area and Severity Index (PASI). PASI также является высоковалидным инструментом оценки эффективности терапии. Для вычисления индекса применяли разработанную компьютерную программу.

У всех участников исследования выполняли биопсию кожи до лечения и на 21-й день терапии. Биоптаты кожи окрашивали гистологическим (гематоксилин-эозин) и иммуногистохимическим методами (Foxp3). Гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов кожи осуществляли на базе кафедры патологической анатомии ОмГМУ. Забор материала производили с использованием инструмента для биопсии кожи DERMO PUNCH диаметром 4 мм. Под местной инцизионной анестезией 2% раствором лидокаина выполняли биопсию (в пределах дермы) свежих элементов на границе со здоровой кожей до начала лечения и остаточных высыпаний на 21-й день терапии. Биоптаты фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (рН 7,2—7,4) в течение 12—24 ч, заливали в парафин и проводили последующую правильную ориентировку полученного образца (перпендикулярно поверхности кожи, продольно через все слои) для срезов. Парафиновые срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. В каждом микропрепарате оценивали выраженность мононуклеарного инфильтрата дермы путем количественного подсчета позитивно окрашенных клеток в 10 полях зрения (ув. 400).

Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартной методике. В качестве первичных антител использовали готовые к применению (ready to use — RTU) (не требующие разведения) кроличьи моноклональные антитела FOXP3, клон PCH 101 (Spring Bioscience, США) [14]. При 400-кратном увеличении микроскопа определяли индекс экспрессии T-регуляторных лимфоцитов (ядерная метка Foxp3) как долю (в %) положительно окрашенных клеток среди общего количества мононуклеаров в 10 полях зрения (≥1000 клеток). Микропрепараты просматривали и фотографировали на микроскопе Axioskop 40, используя камеру AxioCam 503 color и программный комплекс ZEN.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с использованием пакета программ Statistica v.6, Microsoft Office Excel 2016. Описательная статистика количественных признаков представлена медианой и стандартными отклонениями (Mе±σ), также использовали показатели минимума и максимума. Применяли непараметрические методы (критерий Уилкоксона для проверки различий между двумя выборками парных измерений, метод Краскела—Уоллиса для сравнения 3 независимых групп), коэффициент корреляции Спирмена для исследования взаимосвязи двух переменных, измеренных в метрических шкалах на одной и той же выборке (r≤0,3 — слабая связь, 0,3<r<0,7 — связь средней силы, r>0,7 — сильная связь). Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

В 1-ю группу включены 32 больных в возрасте от 19 до 60 лет, получивших узкополосную фототерапию. PASI до лечения колебался от 10,2 до 20 (медиана 16,25), после курса UVB 311 нм — от 8 до 1,2 (медиана 2,25). Во 2-ю группу вошли 32 больных в возрасте от 18 до 60 лет, получивших терапию препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана. PASI до лечения составил 10—19,5 (медиана 13,9), после текущего курса лечения — 6—1,3 (медиана 3,25). Больные 3-й группы (n=32) получили комбинированную терапию методом UVB 311 нм и препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана, возраст больных — 18—60 лет. PASI до лечения составил 10—20 (медиана 15,6), после текущего курса лечения — от 5,1 до 0 (медиана 1,75).

Изначально PASI в группах статистически значимо не различался (Н=5,83; р=0,55) (табл. 1).

В результате лечения в каждой группе показатели снизились, но больше всего — у пациентов, получивших комбинированную терапию (Н=19,65; р=0,000) (см. табл. 1, рис. 1).

Гистологические и иммуногистохимические данные

Интенсивность окрашивания мононуклеарного дермального инфильтрата гематоксилин-эозином в биоптатах кожи больных псориазом до лечения не имела статистических различий между группами, т. е. была примерно одинаковой (Н=3,14; р=0,2) (см. табл. 1, рис. 2).

В результате лечения отмечено значительное снижение количества окрашенных гематоксилин-эозином клеток в каждой группе (Т=0,00; р=0,000) (табл. 2),

но в группах это снижение было неодинаковым (Н=27,77; р=0,000) (см. табл. 1) — более всего объем клеточного инфильтрата уменьшился в 3-й группе (рис. 3).

В пораженной коже у пациентов до лечения Foxp3⁺-клетки обнаруживали в основном в сосочковом слое дермы, что согласуется с данными других исследований [8, 10, 11, 13] (рис. 4).

Экспрессия Foxp3-позитивных клеток в дерме до лечения также не имела статистически значимых различий в исследуемых группах (Н=0,47; р=0,79) (см. табл. 1). В окрашенных иммуногистохимическим методом биоптатах кожи, взятых на 21-й день лечения, отмечено значительное снижение экспрессии Foxp3-позитивных клеток в каждой группе (Т=0,00; р=0,000) (см. табл. 2), причем наиболее выраженное в 3-й группе (Н=36,84; р=0,000) (см. табл. 1, рис. 5).

Корреляция между различными параметрами

Отмечена положительная корреляция средней силы и сильная между PASI и уровнями экспрессии Foxp3⁺-клеток, т. е. чем выше PASI при псориазе, тем больше Foxp3⁺-клеток обнаружено при иммуногистохимическом анализе биоптата. Аналогичную корреляцию наблюдали между PASI и объемом мононуклеарного клеточного инфильтрата, экспрессией Foxp3 и объемом инфильтрата во всех исследуемых группах (табл. 3).

Обсуждение

Проведена сравнительная оценка динамики патологического процесса у пациентов со среднетяжелой степенью псориаза на фоне лечения различными схемами терапии. В качестве оцениваемых параметров использованы PASI, количество клеток мононуклеарного инфильтрата и уровень экспрессии маркера Т-регуляторных клеток — Foxp3.

В результате лечения PASI значительно снизился у пациентов всех групп, но наибольшим снижение было у пациентов, получивших комбинированную терапию методом UVB 311 нм и препаратом натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана.

Патогистологическое изучение кожных биоптатов, окрашенных гематоксилин-эозином, продемонстрировало значительное снижение объема мононуклеарного инфильтрата на 21-й день лечения в каждой группе, при этом снижение в 3-й группе было достоверно большим, чем в 1-й и 2-й группах.

Иммуногистохимическое окрашивание с использованием Foxp3⁺ моноклональных антител показало, что Foxp3⁺-клеточная фракция значительно уменьшается в биоптатах кожи больных, сделанных на 21-й день лечения в каждой группе, и наиболее выражено это снижение у пациентов 3-й группы.

Кроме того, выявлена положительная корреляция между PASI, количеством клеток мононуклеарного инфильтрата и уровнями экспрессии Foxp3⁺.

Выводы

1. Обнаружено статистически значимое различие динамики PASI и объема клеточного мононуклеарного инфильтрата до и после лечения в каждой исследовательской группе. Однако в 3-й группе снижение PASI и количества мононуклеарных клеток достоверно больше, чем в других группах. Полученные данные свидетельствуют о высокой терапевтической эффективности комбинированного применения узкополосной фототерапии и препарата натриевой соли синтетического дипептида гамма-D-глутамил-D-триптофана.

2. Уровень экспрессии маркера Т-регуляторных клеток Foxp3⁺ при псориазе снижается на фоне проводимой терапии, таким образом отражая ее эффективность.

3. Уровень экспрессии маркера Foxp3 имеет прямую корреляционную связь с PASI и объемом мононуклеарного клеточного инфильтрата, его оценка может рассматриваться в качестве дополнительного критерия регресса заболевания на фоне проводимой терапии.

Сведения об авторах

Новиков Ю.А. — http://orcid.org/0000-0003-0391-5372

Охлопков В.А. — http://orcid.org/0000-0002-3515-6027

Трошина Д.С. — http://orcid.org/0000-0002-3912-3863

Мозговой С.И. — http://orcid.org/0000-0001-7200-7082

Полещук Е.И. — http://orcid.org/0000-0002-6778-1089

Правдина О.В. — http://orcid.org/0000-0002-1804-6248

Автор, ответственный за переписку: Трошина Д.С. —
e-mail: kastaliya@mail.ru