Молекулярные маркеры, используемые для диагностики злокачественных новообразований, можно разделить на биохимические, иммуногистохимические и молекулярно­-генетические. Большая часть биохимических онкомаркеров, вошедших в клиническую практику (РЭА, СА­19­9, СА­72­4), представляют собой белки, которые определяют в плазме крови, что облегчает забор материала для исследования, но удаленность маркера от опухолевого очага снижает его чувствительность и специфичность. Концентрация таких маркеров также может изменяться в крови при доброкачественных новообразованиях, воспалительных процессах или при опухолях других локализаций.

Другой тип молекулярных маркеров, активно используемых в клинической практике в последнее время, - это иммуногистохимические маркеры, которые представляют собой белковые молекулы, являющиеся продуктами экспрессии генов, активно участвующих в процессе канцерогенеза. Как правило, эти маркеры определяют в опухоли, а именно, в образцах опухолевых тканей, фиксированных в парафиновых блоках. Исследование маркеров этого типа проводится патологоанатомом, визуально определяющим опухолевые клетки и интенсивность экспрессии в них белковых маркеров. Непосредственное исследование маркеров в опухоли делает их достаточно чувствительными и специфичными, что необходимо для практической работы в клинике. Однако изменение белковой экспрессии является заключительным этапом реализации генетической информации, приводящей к опухолевому процессу. Классическая передача генетической информации в клетке ДНК⇒РНК⇒белок предполагает, что до проявления аномальной экспрессии белков, повреждения затрагивают и ДНК, и РНК.

В последнее время большое значение начинают приобретать молекулярно-­генетические маркеры, основанные на использовании ДНК-и РНК-технологий. Они представляют собой структурные и функциональные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки, потому что нестабильность генома является основным свойством опухолей [4]. Подобные повреждения приводят к изменению экспрессии генов, которые регулируют клеточный цикл, метастатическую и инвазивную активность клеток. В результате таких нарушений изменяется экспрессия генов, кодирующих адгезионные белки и факторы активности неоангиогенеза, возникает инактивация генов­-супрессоров, активируется теломераза в клетках опухолей и т.д. Повреждения генома приводят к развитию как наследственных онкологических синдромов, так и спорадических опухолей.

Подобные повреждения можно использовать в качестве опухолевых маркеров, достаточно чувствительных и специфичных. Они просты в лабораторном исследовании, выявляются в биоптатах опухоли, однако их применение требует тщательной научной разработки и подготовки для внедрения в клиническую практику.

Исследование молекулярно-генетических маркеров представляет собой обширное поле научно-исследовательской деятельности и имеет принципиальное значение для клиники.

Существует несколько направлений в клинической онкологии, где уже сегодня активно применяются маркеры, выделенные с помощью геномных технологий. К этим направлениям следует отнести: 1) диагностику наследственных форм рака; 2) определение маркеров прогноза; 3) определение маркеров, свидетельствующих о начальных стадиях опухолевого процесса; 4) определение маркеров, свидетельствующих о наличии микрометастазов; 5) диагностика ДНК-маркеров, определяющих чувствительность к лекарственным препаратам, особенно к таргетной терапии.

Наследственные формы рака составляют 5-10% всех опухолей, но среди опухолей определенного типа их доля достигает 30% [10]. Наследственные онкологические синдромы характеризуются накоплением в семье случаев опухолей определенного типа, передачей заболевания от родителей к детям, проявлением множественных опухолей, а также ранней манифестацией опухолевого процесса. Герминальные (наследуемые) мутации в гене, ответственном за возникновение наследственных форм рака, возникают в гаметах родителей или de novo на ранних стадиях дробления при эмбриональном развитии. Появление таких мутаций определяет риск развития опухоли в 70-100% [2]. В табл. 1 представлены примеры онкологических синдромов, их частота выявления и генов, мутации в которых отвечают за их развитие.

К клиническим признакам, которые позволяют предположить существование наследственной формы рака в семье, относят следующие:

1) существование семейного онкологического анамнеза; заболевание имеет вертикальную передачу в родословной, наследуется от родителей детьми; 2) ранняя манифестация заболевания, возраст манифестации различается для разных синдромов. Обычно вопрос о наличии в семье наследственного рака возникает, если опухоли отмечаются у членов семьи в возрасте до 50 лет, но известны и более ранние случаи; 3) синхронное или метахронное возникновение нескольких опухолевых очагов. Опухолевое поражение обоих парных органов повышает вероятность существования наследственной формы рака; 4) существование морфологических или иммуногистохимических характеристик опухоли, свидетельствующих о высокой вероятности наследственного синдрома. Трижды негативный рак молочной железы (РМЖ) (ER–, PR– и HER2/neu–) с большей вероятностью может оказаться наследственным [1].

При подозрении на наличие наследственной формы рака в крови пациента проводится определение герминальной мутации в гене, который отвечает за развитие этого онкологического синдрома. Полное исследование гена на наличие мутаций позволяет выявить причину, приводящую к повышению частоты возникновения опухолей определенного типа в семье.

Однако недостаточно изученным остается семейный рак, который характеризуется накоплением в семье опухолей различных локализаций и который по клиническим признакам нельзя отнести к наследственным формам. Причиной этой формы рака можно считать сочетание генетических факторов риска и неблагоприятных условий внешней среды. Определение генетических факторов, приводящих к семейному накоплению опухолей, является важной задачей практической медицины, которую позволит решить использование геномных технологий.

Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что мутации в генах, отвечающих за известные наследственные синдромы, иногда приводят к появлению опухолей не типичной для этих синдромов локализации. Герминальные мутации гена CDH1 могут определять появление карцином желудка или молочной железы, а мутации гена BRCA1 могут служить причиной появления как рака молочной железы и яичников, так и семейного рака поджелудочной железы или предстательной железы [2]. Таким образом, возможно, накопление случаев рака различной локализации в некоторых семьях можно объяснить наличием герминальных мутаций уже известных генов. С другой стороны, некоторые хорошо известные наследственные опухоли могут возникать в результате герминальных мутаций в генах, которые ранее не были связаны с развитием опухолей подобного типа или этой локализации. Например, в последнее время выросло количество генов, мутации в которых могут вызывать РМЖ [1]. Теперь к таким генам кроме BRCA1, BRCA2, ТР53, PTEN, мутации которых до 20 раз увеличивают риск развития РМЖ, можно отнести гены CHEK, PALB2, ATM, мутации в них увеличивают риск развития рака в 5 раз (табл. 2).

Проведение исследования мутаций в каждом из этих генов может занять долгое время и потребовать немалых затрат. В связи с этим возникает необходимость перехода от скрининга каждого из этих генов к исследованию панели, состоящей из генов, которые могут стать причиной развития опухолей определенного типа, а лучше панели всех известных генов, участвующих в канцерогенезе [4].

В настоящее время для решения этой задачи используют технологии полногеномного секвенирования или секвенирования нового поколения (NGS). Современные методы позволяют при помощи NGS или исследования микрочипов анализировать сотни генов в одном диагностическом тесте для одного пациента. Однако проведение такого расширенного исследования требует общения с геномными базами данных и хорошее компьютерное обеспечение, что предъявляет дополнительные требования к подготовке современного специалиста-генетика и онколога.

Определение носительства герминальных мутаций в семьях, и особенно у бессимптомных носителей, является важной задачей практической медицины. Выявление мутаций позволяет контролировать манифестацию опухолевого процесса у носителей мутации. Кроме того, при некоторых типах опухолей, например РМЖ или раке почки, определение герминальных мутаций у пациента может влиять на тактику его лечения, корректируя объем хирургического вмешательства и спектр химиотерапевтического лечения [5]. Хорошее выявление мутаций сделает возможным развитие регистров, компьютерных баз для учета пациентов, имеющих наследственные мутации, что потребует разработки алгоритмов медико-генетического консультирования семей, в которых имеются бессимптомные носители и больные с мутациями [6].

Поиск маркеров прогноза напрямую связан с изучением молекулярного патогенеза опухолей и исследованием его основных этапов, которые определяют клиническое течение опухоли. Маркерами прогноза являются молекулярно-генетические изменения, определенные в опухоли, полученной в результате хирургического удаления или биопсии.

В качестве таких изменений исследуют хромосомные и геномные перестройки, мутации, делеции, транслокации, ассоциированные с развитием опухоли. Сегодня хорошо известны молекулярно-генетические повреждения в опухолевом геноме, которые можно принять в качестве маркеров опухолей различного типа.

В последнее время в связи с развитием новейших геномных технологий, например микрочипов, появилась возможность исследовать сразу тысячи генов для одного пациента. Сегодня для разных типов опухолей исследуют изменения всего экспрессионного спектра на уровне РНК, или изменение спектра регуляторных последовательностей, таких как микро-РНК. В результате этих исследований происходит накопление фундаментальных знаний о канцерогенезе и определяющих его молекулярных событиях. Для практического применения появляется возможность определить единичные или групповые изменения в экспрессии генов, которые связаны с клиническим течением опухоли, инвазией, метастазированием, ответом на лечение [4]. Для повышения чувствительности и специфичности маркеров прогноза их можно собрать в систему и исследовать сразу несколько молекулярно-генетических параметров в опухолевом материале, полученном в результате хирургического лечения пациента.

Показано, что нарушение эпигенетической регуляции генной активности имеет огромное значение для канцерогенеза. Исследование метилирования генома с помощью технологии микрочипов, как аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста, так и общего уровня метилирования/деметилирования всего генома, также может быть использовано для диагностики маркеров прогноза.

Особый интерес имеют системы маркеров, ассоциированные с благоприятным и неблагоприятным прогнозами, а также с эффективностью лечения определенными препаратами. В табл. 3 представлены примеры молекулярно-генетических нарушений, выявленных в опухолевом материале при раке мочевого пузыря (РМП), которые могут иметь прогностическое значение.

Исследуя молекулярно-генетические маркеры в опухолевом или биопсийном материале синхронных или метахронных опухолей можно определить клональное происхождение опухоли. Опухоли, имеющие единого предшественника (моноклональные), характеризуются сходным спектром молекулярных повреждений, а олигоклональные опухоли, имеющие различных предшественников, характеризуют различные паттерны генетических изменений.

В клиническом плане такое исследование позволит определить тактику применения лекарственных препаратов. Опухоли, имеющие различия молекулярного патогенеза и спектра молекулярных изменений, могут по-разному отвечать на лекарственную терапию [8].

К сожалению, молекулярно-генетические маркеры прогноза, так же как и другие (маркеры опухолей) их виды - иммуногистохимические и биохимические не являются идеальными и имеют недостатки при их использовании. Одним из главных препятствий в использовании маркеров подобного типа можно назвать наличие опухолевой клональности. Опухоль не является однородной, она может состоять из различных клонов и подтипов опухолевых клеток, которые характеризуются несколько отличным спектром генетических изменений.

В случае повышенной клональности опухоли определение молекулярно-генетических маркеров в одном сегменте опухоли, взятом для анализа, не предоставит законченной картины в плане прогноза. Существование клональных отношений внутри опухоли может исказить информацию о клиническом поведении и прогнозе, полученную в результате исследования системы маркеров.

Поиск маркеров ранней, доклинической, диагностики опухолевого роста является важной задачей практической онкологии. Прогноз и лечение большого числа опухолевых типов напрямую зависит от диагностики ранних стадий заболевания. К сожалению, определение опухолевых клеток посредством морфологического анализа обычно происходит на более поздних стадиях, когда заболевание имеет клинические проявления. Определение молекулярно-генетических и иммуногистохимических маркеров, ассоциированных с развитием опухоли, еще на стадии предопухолевых изменений является заманчивой перспективой для практической онкологии. Определение группы подобных маркеров позволит приступить к разработке ранних подходов к лечению, или осуществлять мониторинг пациентов с повышенным риском развития опухоли определенного типа. Известно, что метилирование/деметилирование генома, отдельных генов и их регуляторных районов является ранним событием канцерогенеза и может определяться еще до клинической манифестации заболевания. Поэтому в качестве маркеров ранней диагностики сегодня используют анализ метилирования генома или отдельных генов, которые исследуют в материале биопсии, полученном для проведения морфологического анализа. Также в последнее время исследуют спектр метилирования/деметилирования в лимфоцитах периферической крови, изменения которого являются реакцией организма на развитие опухоли определенного органа.

Маркеры раннего доклинического проявления опухолевого роста необходимы и для послеоперационного мониторинга пациентов с целью исключения местного рецидива или генерализации опухолевого процесса. Исследование указанных маркеров возможно не только в опухолевой ткани, но и в плазме крови, моче пациентов с опухолями различного типа. Подобные методики лежат в основе создания систем ранней неинвазивной диагностики, например для РМП [9].

В табл. 4 представлены системы эпигенетических маркеров, их чувствительность и специфичность.

Несмотря на многочисленные исследования диагностических панелей для оценки метилирования генов-супрессоров в моче и их прогностического значения, данные маркеры до сих пор не имеют столь широкого применения, как маркеры, одобренные американским агентством по надзору за продуктами питания и лекарствами (FDA). Наиболее широко используемым из них является тест UroVysion, основанный на методе флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) проб к хромосомам 3, 7, 17 и локусу 9р21. Несмотря на относительно высокую чувствительность метода (до 87%) в случае низкодифференцированных и инвазивных опухолей, она значительно ниже для высокодифференцированных опухолей и опухолей ранних стадий [11].

На рис. 1 представлены результаты применения теста UroVysion для послеоперационного мониторинга пациентов.

К другим методам, одобренным американским агентством по надзору за продуктами питания и лекарствами, относятся тесты BTA, NMP-22 и ImmunoCyt. BTA-тест основан на определении в моче антигена опухоли мочевого пузыря методом иммунопреципитации, чувствительность и специфичность метода невысоки, около 60%. Маркер NMP-22 (ядерный матричный протеин) в моче здоровых людей присутствует в незначительных концентрациях, однако его содержание значительно возрастает в моче больных РМП. Использование двух антител к двум эпитопам NMP-22 позволяет методу достичь чувствительности 71% и специфичности 90%. Тест-система ImmunoCyt использует для детекции опухолевых клеток в моче флюоресцентно меченные антитела к муцинам и раковоэмбриональному антигену. Специфичность метода возрастает до 92% при уменьшении степени дифференцировки опухолевых клеток, однако в случае высокодифференцированных клеток не достигает и 80% [11]. Таким образом, все разработанные и представленные для клинического использования тест-системы не обеспечивают должной чувствительности и специфичности и не могут быть использованы в качестве единственного метода диагностики и прогноза.

Поиск микрометастазов в крови онкологического пациента предполагает определение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови пациента, взятой для анализа. Выявление ЦОК основано на использовании специфических свойств опухолевых клеток, которые отличают их от клеток крови, особенно лейкоцитов. Циркулирующие опухолевые клетки отличаются по размеру и экспрессии некоторых белков и рецепторов, расположенных на клеточной поверхности, таких как EPCAM и цитокератины [12].

Для определения ЦОК в крови пациентов с РМЖ в настоящее время используется система CellSearch, которая одобрена FDA. Это полуавтоматическая система с использованием методов иммунофлюоресценции, иммуномагнитного разделения и проточной цитометрии. При использовании данной технологии образец крови больного РМЖ взаимодействует с магнитными частицами, покрытыми антителами к эпителиальным молекулам клеточной адгезии (EpCAM), и флюоресцентной меткой определенного цвета. Затем происходит обработка образца антителами к лейкоцитам (CD45-аллофикоциан), имеющими метку другого цвета.

В результате реакции опухолевые клетки взаимодействуют с антителами к EpCAM на магнитных частицах, а лейкоциты взаимодействуют с антителами CD45, получая различную окраску. Далее под воздействием магнитного поля опухолевые клетки прижимаются к поверхности, и автоматический сканер проводит подсчет ЦОК, не учитывая лейкоциты. Система не только отделяет лейкоциты от раковых эпителиальных клеток, но и подсчитывает их. Предел чувствительности данного прибора составил 5 и более ЦОК на 7,5 мл крови.

Чтобы признать клетку циркулирующей опухолевой клеткой, необходимо, чтобы она отвечала следующим критериям. Опухолевая клетка имеет положительное окрашивание на антитела к кератину и EpCAM, отрицательное окрашивание по СD45, а также положительную окраску на наличие ядра (DAPI) [9]. На рис. 2 представлены примеры определения ЦОК в образце крови больного РМЖ.

Обращает на себя внимание, что клетки РМЖ имеют различную экспрессию рецепторов эстрогенов (ER), что можно объяснить наличием клональной гетерогенности в опухоли [13].

Развитие индивидуальной предсказательной медицины немыслимо без исследования лекарственной чувствительности пациентов к проводимому лечению. Каждый организм имеет свои характеристики, свои индивидуальные особенности генома, определяющие вариации в спектре и активности белков и ферментов, поэтому ответ на проводимую лекарственную терапию тоже может быть различным. Молекулярно-генетические исследования позволяют определять активность ферментов, влияющих на лекарственный метаболизм, опираясь на изменения ДНК и РНК. Исследование определенных мутаций и полиморфных вариантов последовательности ДНК, модулирующих активность ферментов лекарственного метаболизма и гормонального уровня, позволит оценить ответ на лечение до его проведения и рассчитать дозу лекарственного средства, допустимую для пациента.

В последнее время активно внедряются в практику таргетные препараты, воздействующие целенаправленно на определенный этап патогенеза опухоли. Для успешного применения этих новых лекарственных средств совершенно необходимо проведение оценки определенного патогенетического звена канцерогенеза, на который и воздействует предложенное средство, иначе его использование будет неэффективно. Исследование мутаций в генах рецепторов и молекул, участвующих в передаче сигнала, стимулирующего клеточное деление, выявление амплификации рецепторов и некоторых регулирующих белков требуют применения всего арсенала молекулярно-генетических методов, от ПЦР и секвенирования до гибридизации in situ, для осуществления успешного лечения определенного типа опухоли у конкретного пациента [14].

Примерами таргетных препаратов, активно применяемых в практической медицине, являются гефитиниб и эрлотиниб, которые используют при лечении пациентов с раком легких, а также цетуксимаб и панитумумаб, используемые для лечения пациентов с колоректальным раком (рис. 3).

Гефитиниб и эрлотиниб относятся к ингибиторам тирозинкиназной активности рецептора EGFR, поэтому их применение наиболее успешно при наличии мутаций в гене EGFR, приводящих к активации тирозинкиназного домена рецептора. Наиболее частыми мутациями в гене EGFR являются делеция в 19 экзоне 746-750 кодонов, (del746-750) и аминокислотная замена Leu858Arg, они встречаются в 10-20% случаев рака легкого. При выявлении в операционном материале из опухоли этих или других мутаций в гене EGFR необходимо назначать лечение гефитинибом или эрлотинибом. Их применение приводит к увеличению продолжительности жизни пациентов с немелкоклеточным раком легкого на 1 год и более. Если в опухоли не выявлены нарушения в гене EGFR, от терапии этими препаратами следует отказаться и использовать альтернативные лекарственные средства.

Препараты цетуксимаб и панитумумаб имеют другие молекулярные мишени. К повреждениям, блокирующим эффективное применение этих лекарственных средств, относится активирующая мутация в гене K-RAS. При наличии в опухолевой ткани мутаций гена KRAS терапия цетуксимабом или панитумумабом неэффективна. Это происходит потому, что цетуксимаб и панитумумаб являются моноклональными антителами к рецептору EGFR, механизм их действия состоит в блокировании экстрацеллюлярного надмембранного домена рецептора, который при взаимодействии c фактором роста активирует клеточное деление. При наличии мутаций гена KRAS деление клетки запускается на уровне сигнальных молекул, минуя рецептор EGFR, поэтому блокирование рецептора не эффективно.

Развитие геномных исследований в молекулярной онкологии позволяет не только понять фундаментальные процессы канцерогенеза, но и принести пользу практической медицине. Хотя еще рано говорить о полном понимании механизмов злокачественной трансформации клетки, однако уже накоплено немало информации, которая может найти применение в клинической практике. Изучение предрасположенности к онкологическим заболеваниям дает прямой выход в профилактическую медицину. Определение герминальных мутаций в семьях с наследственными онкологическими синдромами, у больных и бессимптомных носителей, позволит разработать методы профилактики заболевания и контролировать его проявление. Своевременная диа­гностика опухоли приведет к повышению эффективности лечения и снижению его стоимости. Диагностика маркеров прогноза откроет дополнительные возможности для коррекции тактики лечения и улучшения показателей общей и безрецидивной выживаемости пациентов. Знания молекулярного патогенеза опухоли позволят предложить новые лекарства, непосредственно воздействующие на опухолевые клетки. В связи с этим одной из наиболее важных практических задач молекулярно-генетических исследований в онкологии является разработка систем генетических и эпигенетических маркеров, а также создание эффективных диагностических протоколов с целью повышения результативности профилактики и лечения онкологических заболеваний.