Настоящие клинические рекомендации устанавливают диагностические и прогностические возможности измерения активности щелочной фосфатазы в сыворотке (плазме) крови человека и ее клиническую интерпретацию в соответствии с наличием различных клинических симптомов.

Доказательной базой для составления рекомендаций явился поиск в электронных базах данных PubMed и Mеdline. Данные клинические рекомендации подготовлены на основании международных и российских обзорных статей, рандомизированных исследований и опубликованных справочников. Глубина поиска составила 15 лет.

Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:

— консенсус экспертов;

— оценка значимости в соответствии с рейтинговой системой.

Гипофосфатазия относится к редким наследственным заболеваниям, что исключает возможность проведения больших когортных и рандомизированных контролированных исследований, и для создания протоколов диагностики и терапии используются лишь тематические исследования экспертов, опубликованные в последние два десятилетия.

Клиническая информативность лабораторных исследований определятся путем расчета операционных характеристик теста (диагностической чувствительности и специфичности — ДЧ и ДС, предсказательной ценности положительных и отрицательных результатов, отношения правдоподобия положительных и отрицательных результатов — ОППР и ОПОР) и с помощью ROC-анализа. Наиболее полезными являются лабораторные тесты с ОППР >5 и ОПОР <0,2; полезными — с ОППР >2 и ≤5, ОПОР >0,2 и ≤0,5; не имеющими пользы — с ОППР ≤2 и ОПОР >0,5.

Индикаторы доброкачественной практики (Good Practice Points — GPPs)

Рекомендуемая доброкачественная практика базируется на клиническом опыте членов рабочей группы по разработке рекомендаций.

Экономический анализ не проводился, и публикации по фармакоэкономике не анализировались.

— внешняя экспертная оценка;

— внутренняя экспертная оценка.

Аналитически надежное и клинически выверенное определение биологических маркеров патофизиологических процессов является основой развития лабораторной медицины, при этом важную роль играет стратификация референтных интервалов, которые позволяют правильно интерпретировать результаты лабораторных исследований. Данные лабораторной диагностики могут оказывать значительное влияние на принятие клинического решения и качество лечения. Поэтому очень важно, чтобы медицинские лаборатории проводили согласование полученных значений с референтными интервалами, используемыми в популяции пациентов, так как это является условием обеспечения надлежащей пользы применения лабораторных исследований в целом. К сожалению, в настоящее время существуют проблемы в части точности определения и применения референтных интервалов, что затрудняет интерпретацию результатов лабораторных тестов. Такие критические пробелы, без сомнения, могут являться причиной неточной или ошибочной диагностики многих заболеваний, особенно у детей и подростков.

Вышеуказанная проблема становится особенно актуальной, когда ошибочная интерпретация всего одного показателя может повлиять на постановку диагноза заболевания, связанного с патологией определяемого метаболита. В частности, именно такая ситуация наблюдается в настоящее время с заболеванием гипофосфатазией, основным биохимическим маркером которого является низкая активность щелочной фосфатазы.

Щелочная фосфатаза (ЩФ) человека — семейство изоферментов, кодируемых 4 различными генами. Три из 4 генов кодируют по одному изоферменту ЩФ, специфичному для тонкого кишечника (IAP), плаценты (PLAP) и зародышевых клеток (GCAP) соответственно [1]. Четвертый ген, TNSALP, кодирует изофермент тканенеспецифической ЩФ (ТНЩФ), экспрессирующийся во всех тканях. Различия каталитической активности ТНЩФ в печени, почках и костях возникают вследствие неодинакового посттрансляционного гликозилирования [1]. Ген TNSALP располагается на коротком плече хромосомы (1p36.1−34) и состоит из 12 экзонов, занимающих 50 тыс. нуклеотидов [2, 3]. В настоящий момент с ГФФ связывают 267 различных мутаций и 16 полиморфизмов гена TNSALP [4]. Большинство (74,5%) мутаций относится к миссенс-мутациям.

ЩФ — это фермент, связанный с клеточной мембраной якорем в виде гликофосфатидилинозитола, и представляющий собой Zn²⁺-металлопротеиназу, физиологически активную в димерной форме, которая расщепляет несколько фосфорилированных соединений, в том числе неорганический пирофосфат (НПФ), пиридоксаль-5’-фосфат (ПЛФ) и фосфоэтаноламин (ФЭА) [1]. Обязательным кофактором данного процесса служит Mg²⁺. Недостаточная активность ЩФ приводит к накоплению в организме указанных субстратов, что ведет к нарушению минерализации костей, зубов и другим системным осложнениям [5].

ЩФ имеет оптимум pH в довольно высоком диапазоне >9. Щелочной pH характерен для поверхности двенадцатиперстной кишки и, возможно, для поверхности остеокластов в компартментах костной ткани [6]. Синтетический препарат p-нитрофенил фосфата стал наиболее часто используемым субстратом для кинетических исследований ЩФ из-за простого спектрофотометрического анализа (A) [7].

ЩФ присутствует в изобилии в сыворотке крови. Источником примерно 95% циркулирующей ЩФ у здоровых людей являются кости и печень [8]. Многочисленные исследования подтверждают клиническую значимость ЩФ в качестве маркера для различных заболеваний, включая патологии костей и болезни печени [9, 10].

Соответственно при таких заболеваниях и состояниях, как недоедание, глютеновая болезнь, дефицит фолатов/злокачественная анемия, цинк/магний дефицит, гипотиреоидизм/гипопаратиреоидизм, дефицит витамина С, избыток потребления витамина Д, ахондроплазия и кретинизм, при повторяющихся энтеритах, избыток глюкокортикоидов, недостаточность витамина В6, во время беременности при недостаточности развития плаценты, а так же при генетическом заболевании — гипофосфатазии, может снижаться активность ЩФ [11, 12].

Повышение ЩФ может быть при таких состояниях, как опухоли костной ткани, саркома, метастазы рака в кости, гиперпаратиреоз, миеломная болезнь, лимфогранулематоз с поражением костей, инфекционный мононуклеоз, рахит, заболевания печени и желчных протоков, «холестатические» состояния (цирроз, рак, инфекционный гепатит, туберкулез, опухоли желчевыводящих путей), инфаркт легкого, инфаркт почки. Повышение Щ.Ф. происходит в последнем триместре беременности, после менопаузы, при недостатке кальция и фосфатов в пище, от передозировки витамина С, а так же как следствие приема некоторых лекарственных препаратов (оральных контрацептивов, содержащих эстроген и прогестерон, антибиотиков и других) [18, 19].

Помимо патологических состояний, уровень ЩФ в плазме крови сильно отличается у здоровых людей в зависимости от возраста и пола (А). Американской ассоциацией клинической химии (AACC) были отработаны и представлены референтные значения ЩФ в зависимости от возраста и пола, начиная с новорожденных детей (табл. 2) (А) [13].

Однако основной проблемой при измерении и интерпретации активности ЩФ в отечественной лабораторной службе является частое отсутствие нижней границы референтного интервала активности Щ.Ф. Зачастую происходит сравнение полученных показателей ЩФ только с верхним значением референтного интервала, то есть внимание специалиста акцентировано на патологии, связанной с повышенным уровнем активности Щ.Ф. Такое возможно не только при недостаточной компетенции самих работников лаборатории, но и в результате не предоставления информации самими производителями диагностических наборов для определения активности Щ.Ф. Часто в инструкции к диагностическому набору указана только верхняя референтная граница, что автоматически предполагает отсутствие патологических низких значений Щ.Ф. Следствием этого является возможность пропуска патологии, связанной с низким уровнем ЩФ, например, такого тяжелого заболевания, как гипофосфатазия, где именно низкая активность ЩФ является причиной всех клинических проявлений, что указано в самом названии болезни.

Гипофосфатазия (ГФФ) — это редкое врожденное метаболическое заболевание, проявляющееся нарушением минерализации костей и зубов, а также системными осложнениями, включая нарушение дыхания, судороги, мышечную слабость, боль в костях и нефрокальциноз (табл. 3) [14, 15]. Причиной ГФФ служат инактивирующие мутации в гене ТНЩФ, в результате которых снижается ее активность [14].

Тяжесть заболевания чаще всего обратно пропорциональна возрасту начала заболевания, в наиболее тяжелых случаях смерть наступает внутриутробно или вскоре после рождения [14]. Поэтому клинические формы ГФФ разделены по возрасту проявления клинических симптомов, что привело к разделению ГФФ на перинатальную, инфантильную, детскую и взрослую формы. Дополнительно выделяют еще одну форму заболевания — одонтогипофосфатазию, которую расценивают как наименее тяжелую форму ГФФ, поражающую зубы; при этом признаки патологии скелета отсутствуют. Данная форма ГФФ проявляется спонтанным выпадением молочных зубов с неповрежденными корнями или сильным кариесом, увеличением пульповых камер и корневых каналов [16].

Основной диагностический критерий ГФФ — низкий уровень ЩФ в сыворотке [14]. В большинстве случаев диагноз можно поставить по низкой̆ активности ЩФ сыворотки в сочетании с физикальными и рентгенографическими признаками, характерными для ГФФ [14]. При оценке уровня ЩФ сыворотки необходимо учитывать возрастные и половые особенности (степень рекомендации A).

Недостаточная активность ЩФ приводит к накоплению в организме указанных ниже субстратов, что ведет к нарушению минерализации костей, зубов и другим системным осложнениям [14].

При ГФФ высокая концентрация НПФ во внеклеточном пространстве приводит к накоплению вещества вокруг мембранных везикул, где происходит его поглощение как аморфным фосфатом кальция (что предотвращает формирование нового гидроксиапатита), так и существующими кристаллами гидроксиапатита (предотвращает рост и отложение гидроксиапатита), т. е. подавляет минерализацию скелета, вызывая рахит или остеомаляцию, несмотря на нормальный или повышенный уровень циркулирующего кальция и неорганического фосфата [17]. Доказательство того факта, что повышение уровня НПФ в плазме и моче у пациентов с ГФФ возникает как прямое следствие недостаточной активности ЩФ, помогло объяснить нарушение минерализации скелета у пациентов с ГФФ [5]. Рутинное клиническое определение НПФ недоступно, в настоящее время оно применяется только в научных исследованиях.

ПЛФ — основная циркулирующая форма витамина В6, необходимый компонент многих ферментативных процессов в клетках. После попадания в организм различные формы витамина В6 (такие как пиридоксин, пиридоксаль, пиридоксамин) подвергаются всасыванию из желудочно-кишечного тракта и превращаются в печени в ПЛФ, высвобождающийся в кровоток [1, 14]. Для попадания в ткани и проникновения через гематоэнцефалический барьер ПЛФ необходимо пройти дефосфорилирование до пиридоксаля с помощью ЩФ, после чего происходит обратное рефосфорилирование до ПЛФ или конвертация в пиридоксамин-5-фосфат. Каждое из данных веществ выступает кофактором различных внутриклеточных ферментативных реакций, включая активность глутамата декарбоксилазы и синтез нейротрансмиттеров серотонина и γ-аминомасляной кислоты (ГАМК). Купируемые витамином В6 судороги, наблюдаемые у наиболее тяжелых больных ГФФ, чаще всего становятся результатом дефицита ПЛФ в ЦНС. Тот факт, что у наиболее тяжелых пациентов с ГФФ наблюдается нормальная или немного повышенная концентрация пиридоксаля в плазме, отсутствуют существенные нарушения статуса витамина В6, а также редкость возникновения судорог, свидетельствует о другом механизме дефосфорилирования ПЛФ во внеклеточном пространстве [14, 18, 19]. ПЛФ измеряется при рутинном клиническом исследовании, которое чаще всего называют определением витамина В6.

При ГФФ часто наблюдается повышение уровня ФЭА в плазме и моче [18]. ФЭА — компонент фосфатидилинозитолгликанового якоря, связывающего белки с клеточной поверхностью. Следовательно, ФЭА может накапливаться из-за деградации якоря. При другом варианте за избыток ФЭА отвечает печень, которая в норме метаболизирует ФЭА в реакции, контролируемой О-фосфорилэтаноламинфосфолипазой; при этом требуется ПЛФ в качестве кофактора [5, 14]. Определение ФЭА в моче доступно для большинства лабораторий.

В результате представленного описания биохимических маркеров, связанных с активностью ЩФ, к типичным биохимическим признакам ГФФ относятся низкая активность ЩФ в сыворотке, повышение уровня ПЛФ в плазме, НПФ в сыворотке и ФЭА в сыворотке или моче (табл. 4) (A). Интересно отметить, что в отличие от других форм рахита или остеомаляции повышение уровня ПЛФ наблюдается только при ГФФ [14]. Специфические изменения, связанные с ГФФ, и доступность в качестве рутинного клинического анализа (чаще называемого уровнем витамина B6) делают повышение уровня ПЛФ наряду с низким уровнем ЩФ в сыворотке наиболее простым тестом для лабораторной диагностики ГФФ (B).

Как правило, чем тяжелее форма ГФФ, тем ниже концентрация ЩФ в сыворотке и выше концентрация ПЛФ в плазме. Повышение уровня ФЭА в сыворотке или моче также подтверждает диагноз ГФФ; однако определение уровня ФЭА вне специализированных лабораторий не проводится; повышение уровня ФЭА может наблюдаться и при других заболеваниях, включая иные метаболические заболевания костей. Лабораторное определение уровня НПФ в настоящее время применяют только в научных исследованиях.

В отличие от практически всех других рахитоподобных заболеваний уровень кальция и неорганического фосфата (НФ) сыворотки при ГФФ не снижается. Это можно использовать при проведении дифференциальной диагностики. При инфантильной форме ГФФ нередко отмечается гиперкальциемия и гиперкальциурия, сопровождаемые нефрокальцинозом; наблюдается снижение уровня паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке, что сопровождается гиперфосфатемией. При детской форме ГФФ часто наблюдается гиперкальциурия, иногда сопровождающаяся низким уровнем циркулирующего ПТГ; уровень 25-гидрокси- и 1,25-дигидроксихолекальциферола остается без изменений. Гиперкальциемия при детской форме ГФФ встречается редко, однако при возникновении данного симптома также отмечается низкий уровень ПТГ и 1,25-дигидроксихолекальциферола в сыворотке. При детской и взрослой формах ГФФ уровень НФ ЩФ в сыворотке может повышаться относительно средних показателей у здорового человека того же возраста; гиперфосфатемия наблюдается приблизительно в 50% случаев. У пациентов с детской или взрослой формой ГФФ уровень кальция обычно не изменен.

Выявление мутаций в гене ЩФ однозначно определит вовлеченность ЩФ в развитие патологического процесса у пациента. Рекомендуется проведение полного анализа гена ALPL (ген, кодирующий фермент НТИЩФ) методом прямого секвенирования. Данное исследование является важным при постановке диагноза «гипофосфатазия», поскольку присутствует несогласованность в использовании референтных значений по активности ЩФ, а также разнообразие состояний, при которых происходит снижение ее активности, поэтому генетическое тестирование поможет поставить окончательно верный диагноз и подтвердить или опровергнуть заболевание (В). Дополнительно анализ мутаций может помочь при постановке диагноза у пациентов с легкими формами ГФФ, у которых лабораторные показатели биохимических маркеров не могут его подтвердить. Генетическое исследование может помочь при консультации родителей больных детей, которых необходимо информировать о возможном типе наследования на случай, если пара планирует рождение следующего ребенка.

Референтные интервалы позволяют получить ценную информацию, используемую медицинскими экспертами для интерпретации результатов количественных лабораторных тестов, следовательно, референтные интервалы критически важны для оценки здоровья пациентов и принятия клинического решения. Референтный интервал для анализируемого вещества соответствует статистическим границам значений, устанавливаемых при проведении исследования референтных интервалов, где учитываются 95% показателей, расположенных в центре кривой распределения, при этом в качестве данных используют результаты анализов здоровых представителей референтной популяции (степень рекомендации A) [21]. На основании полученных данных делается вывод, что результат, выпадающий за пределы референтного интервала, может представлять собой отклонение от нормы. Следовательно, референтный интервал является «стандартом» здоровья, с которым необходимо сравнивать результат теста пациента (степень рекомендации A).

Поскольку референтные интервалы активности ЩФ уже определены, а актуальность заболевания ГФФ как никогда высока, то становится очевидным использование двух основных положений, которые нужно соблюдать при измерении активности ЩФ, помимо правильного выполнения самого исследования:

1. Использовать референтные интервалы с нижним и верхним пределами (степень рекомендации A).

2. Применять соответствующие референтные интервалы согласно возрастным и половым характеристикам пациента (степень рекомендации A).