Расстройства аутистического спектра (РАС) в детском возрасте являются одной из актуальнейших проблем современной психиатрии в связи с их высокой распространенностью (62:10 000 детского населения), трудностями диагностики, а также недостаточной изученностью патогенетических механизмов развития этих состояний [5].

Результаты многочисленных исследований показали вовлеченность иммунных (как воспалительных, так и аутоиммунных) реакций в патогенез аутистических расстройств [2, 12, 15, 16]. В крови пациентов выявлены различные маркеры воспаления: повышенный уровень провоспалительных цитокинов [7, 8], белков острой фазы воспаления [9]; изменение активности протеолитических ферментов, ответственных за сосудистую проницаемость [3, 6], а также повышенный уровень аутоантител к нейроантигенам [6, 11, 13]. Признаки нейровоспалительных реакций — активация микроглиальных клеток, увеличенная экспрессия провоспалительных цитокинов, нарушения микрососудистого русла — наблюдаются также в мозге пациентов [17, 20].

В целом в фундаментальной иммунологии воспалительные и аутоиммунные реакции рассматриваются как санационные, направленные на восстановление нарушенного гомеостаза вследствие того или иного патологического процесса, в том числе и в мозге. Однако в ряде случаев расстройства функционирования каждого из указанных компонентов иммунной системы могут привести к появлению патологических иммунных реакций [14].

Механизмы выявляемых иммунологических отклонений при РАС в настоящее время не вполне ясны. Однако эта проблема помимо фундаментального, патогенетического аспекта имеет также важное прикладное значение: количественная оценка уровня воспалительных маркеров и (или) аутоантител к нейроантигенам в крови пациентов может улучшить надежность диагностики и обеспечить лабораторный мониторинг развития заболевания.

Целью настоящего исследования явилось количественное определение воспалительных и аутоиммунных маркеров: активности лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) и α1-протеиназного ингибитора (α1-ПИ), уровня аутоантител (аАТ) к S-100b и основному белку миелина (ОБМ) в сыворотке крови пациентов с РАС во взаимосвязи с особенностями их клинического состояния для потенциального использования в качестве дополнительного дифференциально-диагностического инструмента при клиническом обследовании пациентов.

Настоящее исследование выполнено в лаборатории нейроиммунологии (руководитель — д.м.н., проф. Т.П. Клюшник) и отделе детской психиатрии (руководитель — д.м.н. Н.В. Симашкова) ФГБНУ НЦПЗ (дир. — проф. Т.П. Клюшник). Исследование проведено с соблюдением современных норм биомедицинской этики.

Обследованы 135 пациентов детского возраста с разными типами РАС:

1-я группа — непсихотический эволютивно-конституциональный аутизм (ЭА) при синдроме Аспергера (F84.5) и детский эволютивно-процессуальный аутизм Каннера (F84.0) — 11 детей (11 мальчиков в возрасте — медиана [25-й; 75-й перцентили] = 7 [6; 7] лет);

2-я группа — инфантильный психоз — ИП (F84.02) — 83 человека (57 мальчиков и 26 девочек в возрасте 5 [4; 6] лет);

3-я группа — атипичный детский психоз — АДП (F84.11) — 41 человек (33 мальчика и 8 девочек в возрасте 7 [6; 7] лет).

Контрольную группу составили 67 соматически и психически здоровых детей, сопоставимых по возрасту и полу с пациентами исследуемых групп.

Критериями включения в исследование пациентов служили: наличие психотического приступа (или становление ремиссии) с преобладанием нозологически неспецифических кататонических расстройств и когнитивных нарушений; при непсихотических формах — отсутствие способности к социальному взаимодействию, стереотипность поведения, наличие когнитивного дефицита; необходимость проведения больным фармакотерапии; информированное согласие родителя или опекуна ребенка на участие в исследовании.

Критериями исключения являлись клинические и лабораторные признаки воспалительной, инфекционной или аутоиммунной патологии, выявленной в течение 1—2 мес, предшествующих обследованию, а также поствакцинальный период.

При клиническом обследовании пациентов с РАС в качестве дополнительного инструмента использовали шкалу количественной оценки выраженности детского аутизма (Childhood Autism Rating Scale — CARS) [18]. Оценка по шкале CARS основывается на анализе 15 аспектов поведения, каждый имеет оценку от 1 до 4 баллов; возможные итоговые суммарные оценки могут варьировать от 15 до 60 баллов. Итоговая оценка в диапазоне от 15 до 29 баллов соответствует отсутствию клинической картины аутизма, 30—36 баллов — легкому/умеренно выраженному аутизму, 37—60 баллов — тяжелому аутизму.

По шкале кататонии BFCRS [10] оценивали выраженность кататонических расстройств, что позволяло оценить их динамику по мере течения приступа. Кататония менее 25 баллов определялась как легкая; 25—35 баллов — умеренная; и более 35 баллов — тяжелая.

Тяжесть клинической симптоматики оценивали по шкале общего клинического впечатления (Clinical global impression scale — severity СGI-S) [19]. По шкале CGI-S баллы 1 и 2 соответствовали легким, баллы 3 и 4 — умеренным, баллы 5, 6 — тяжелым; балл 7 — крайне тяжелым расстройствам.

Иммунологические показатели определяли в сыворотке периферической крови, забор которой осуществляли из пальца в сухую пробирку типа Эппендорф. Форменные элементы после свертывания крови осаждали центрифугированием при 750 g в течение 15 мин при 22 °C, затем отбирали сыворотку, которая использовалась для анализа либо сразу после получения, либо хранилась при 2—8 °С не более суток или в замороженном состоянии при температуре от –18 до –24 °С в течение 1 мес до проведения анализа.

Энзиматический метод определения активности ЛЭ. Эластазную активность сыворотки крови, обусловленную на 90% присутствием в сыворотке комплекса эластазы нейтрофилов (ЛЭ) с α1-ПИ, определяли ферментативным методом, предложенным В.Л. Доценко [1]. Активность Л.Э. измеряли по скорости расщепления эластазой специфического хромогенного субстрата N-терт-бутоксикарбонил-L-алaнин-паранитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp; «ICN Biomedical Inc.») в условиях, подобранных для полного высвобождения фермента из комплекса ЛЭ—α1-ПИ, при 25 °C. Регистрировали изменение оптической плотности с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 Reaction Kinetics (Version 2.03, «Biochrom Ltd») на спектрофотометре Ultrospec 1100 («Amercham») в течение 3 мин при длине волны 347 нм, соответствующей максимуму поглощения продукта реакции. Активность эластазы выражали в нмоль/мин∙мл. Чувствительность метода 40 нмоль/мин∙мл, коэффициент вариации результатов определения активности ЛЭ в одном и том же образце (10 повторений) не превышает 8%.

Метод определения активности α1-ПИ. Измерение активности α1-ПИ в сыворотке крови проводили с помощью спектрофотометрического метода [4]. Метод основан на взаимодействии этого ингибитора с трипсином при использовании в качестве субстрата N-α-бензоил-L-аргининэтиловый эфир гидрохлорид (BAEE; «ICN Biomedical Inc.»): α1-ПИ образует с трипсином комплекс, не гидролизующий BAEE. Активность α1-ПИ в сыворотке определяли по степени торможения BAEE-эстеразной активности трипсина определенным количеством исследуемой сыворотки. Регистрировали изменение оптической плотности с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 Reaction Kinetics (Version 2.03, «Biochrom Ltd») на спектрофотометре Ultrospec 1100 («Amercham») в течение 3 мин при длине волны 253 нм. Активность α1-ПИ выражали в ингибиторных единицах на мл (ИЕ/мл). Чувствительность метода 5 ИЕ/мл, коэффициент вариации результатов определения функциональной активности α1-ПИ в одном и том же образце не превышает 5%.

Определение уровня аАТ к S-100b и ОБМ в сыворотке крови проводили методом стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Для активации иммунологического планшета («Costar», США) использовали белок S-100b или ОБМ («Sigma», США). Для идентификации связавшихся аАТ использовали конъюгат кроличьих антител, меченных пероксидазой хрена к IgG и IgM человека («ИМТЕК», Россия). Измерение оптической плотности проводили через 2—3 мин после остановки реакции при длине волны 492 нм на спектрофотометре Multiskan RC («Labsystems», Финляндия). Уровень аАТ оценивали в единицах оптической плотности (ОП), прямо пропорциональной интенсивности окраски.

В качестве контроля были использованы две пулированные сыворотки с «нормальным» («1») и «высоким» («2») значением уровня аАТ. Пул «1» состоял из сывороток 10 здоровых доноров в возрасте от 20 до 50 лет без признаков инфекционных и аутоиммунных заболеваний. Средний уровень аАТ в этой сыворотке составил 0,5—0,8 О.П. Пул «2» состоял из сывороток 10 пациентов с разными нервно-психическими заболеваниями в возрасте от 20 — 50 лет. Средний уровень аАТ в сыворотке составил 0,9—1,1 О.П. Оба пула были получены путем сливания сывороток доноров/больных в один день и были разлиты по аликвотам 0,05 мл для дальнейшего хранения при температуре –20 °С. Измерения образцов проводили в дублях. Чувствительность метода — 0,2 ОП, коэффициент вариации результатов определения уровня аАТ в одном и том же образце (10 определений) не превышает 5%.

На основе определения обозначенных выше воспалительных и аутоиммунных маркеров проводили также комплексную оценку состояния иммунной системы пациентов, учитывающую корпоративное взаимодействие врожденного и приобретенного иммунитета в ходе иммунной активации [14]. Условно было выделено 3 уровня состояния иммунной системы: 1-й уровень — «нормальный» (активность/уровень определяемых иммунных показателей в диапазоне значений контрольной группы); 2-й уровень — «активация врожденного иммунитета» (повышение активности ЛЭ и α1-ПИ выше 75-го перцентиля контрольной группы); 3-й уровень — «активация врожденного и приобретенного иммунитета» (повышение активности ЛЭ и α1-ПИ, а также уровня аутоантител выше 75-го перцентиля контрольной группы).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью непараметрического статистического программного обеспечения Statistica-7 (для Windows, «StatSoft Inc.», США). Межгрупповые различия определяли с использованием теста Манна—Уитни. Для оценки клинико-иммунологических связей использовали корреляции по Spearman. Данные представлены в виде медианы — М [25-й перцентиль; 75-й перцентиль]. Использовали уровень достоверности: p<0,05.

В табл. 1 приведены психометрические показатели обследованных групп больных по соответствующим психометрическим шкалам, в табл. 2 иммунологические показатели, включая уровень активации иммунной системы.

Приведенные результаты свидетельствуют (см. табл. 1), что все рассмотренные типы РАС характеризуются умеренно выраженным или тяжелым аутизмом по шкале CARS.

Как видно из табл. 2, при ЭА исследуемые иммунологические показатели сыворотки крови не отличались от контроля. У пациентов с ИП и АДП в психозе выявлено статистически значимое повышение активности ЛЭ, α1-ПИ и уровня аутоантител к S-100b (p<0,0001, p<0,0001, p<0,05 соответственно) по сравнению с контролем. При этом активность ЛЭ в психозе при АДП выше (p<0,05), чем при И.П. Таким образом, в психозе при ИП и АДП выявлена активация как врожденного, так и приобретенного иммунитета, однако доля сывороток с выраженным аутоиммунным компонентом при ИП (14%) меньше, чем при АДП (39%) (χ²=7,93, р=0,0049).

В ремиссии наблюдали достоверное снижение иммунологических показателей как при ИП, так и при АДП. Однако при АДП активность α1-ПИ остается достоверно выше контрольных значений (p<0,05).

По уровню активации иммунной системы (комплексная оценка) пациенты распределились следующим образом.

У 29 пациентов исследуемые иммунологические показатели не отличались от контроля (р>0,05) (1-й уровень): активность ЛЭ в группе пациентов — 200,9 [176; 213], в контрольной группе — 205,2 [173; 222,5] (р=0,53); активность α1-ПИ — 35,0 [31; 37,5]), в контрольной группе — 33,4 [28,0; 37,0] (р=0,34); уровень аАТ к S-100b — 0,69 [0,59; 0,75], в контроле — 0,69 [0,6; 0,77] (р=0,98); уровень аАТ к ОБМ 0,66 [0,5; 0,79], в контроле — 0,66 [0,58; 0,70] (р=0,74).

У 84 пациентов имелся 2-й уровень активации иммунной системы: активность ЛЭ — 259,2 [243; 274,3] и α1-ПИ — 44,0 [37,3; 48,3] достоверно превышала контрольные значения (р<0,0001); а уровень аАТ к S-100b — 0,7 [0,59; 0,77] и ОБМ 0,62 [0,52; 0,72] не отличался от контрольного (р=0,47 и р=0,39 соответственно).

У 22 пациентов был 3-й уровень активации иммунной системы: активность ЛЭ — 253,8 [218; 261,4] и α1-ПИ — 43,0 [37,3; 47,8], а также уровень аАТ к S-100b — 0,96 [0,92; 1,08] и к ОБМ 0,86 [0,67; 0,95] достоверно превышал контрольные значения (р<0,0001, р<0,0001, р<0,0001, р<0,001 соответственно).

При сопоставлении психометрических данных выраженности аутизма (см. табл. 1) с комплексной оценкой состояния иммунной системы пациентов (см. табл. 2) можно отметить как умеренно выраженный, так и тяжелый аутизм при эволютивно-конституциональных аутистических расстройствах, представляющих собой преимущественно непрогредиентные формы, характеризующиеся иммунными показателями, статистически не отличающимися от контрольной группы (р>0,05, см. табл. 2). Вместе с тем при психотических прогредиентных формах аутистических расстройств (ИП и АДП) в острой фазе заболевания тяжелый и умеренно выраженный аутизм сопровождается статистически значимым повышением иммунологических показателей и активацией иммунной системы различной степени. Наблюдается снижение уровня активации иммунной системы в стадии ремиссии заболевания, не достигающее, однако, контрольных значений по активности α1-ПИ при наиболее тяжелой форме — АДП. Однако необходимо отметить, что в ремиссии как при эволютивно-конституциональных формах, так и при психотических формах аутистические расстройства в различной степени сохраняются (см. табл. 1).

Совокупность полученных результатов свидетельствует, что аутистические расстройства, не сопровождающиеся активацией иммунной системы (при эволютивно-конституциональных формах РАС или в ремиссии прогредиентных психотических форм), являются, вероятно, отражением сформировавшегося ранее дефекта и могут быть отнесены к негативным расстройствам. Вместе с тем обострение заболевания при психотических формах РАС сопровождается активацией иммунной системы и углублением имеющихся аутистических и кататонических расстройств. Отмеченные закономерности подтверждаются выявлением клинико-биологических корреляций. Так, показана прямая связь между уровнем активации иммунной системы (комплексная оценка) и стадией заболевания (обострение или ремиссия) (r=0,49, р<0,05), а также с тяжестью клинического состояния пациентов с психотическими формами РАС: с выраженностью аутистических расстройств по шкале CARS (r=0,48, p<0,05), с выраженностью кататонических расстройств по шкале BFCRS (r=0,42, p<0,05), с оценкой по шкале CGI-S (r=0,61, p<0,05).

Таким образом, сопоставление клинических и иммунных показателей при различных формах РАС показывает, что иммунная система вовлечена лишь в обострение заболевания, а сформированные ранее нарушения в мозге, находящие отражение в той или иной клинической симптоматике различной степени тяжести, не сопровождаются иммунными реакциями.

В целом и по уровню активации иммунной системы, и по тяжести клинической симптоматики рассмотренные нозологические состояния представляют континуум расстройств, на одном полюсе которого находится синдром Аспергера, на противоположном — атипичный детский психоз. Таким образом, можно заключить, что степень активации иммунной системы (по показателям активности ЛЭ, а1-ПИ и уровня аАТ к нейроантигенам) в крови пациентов с РАС может служить критерием остроты и тяжести патологического процесса в мозге.

На этапе ремиссии при психотических формах РАС наблюдается относительное снижение определяемых иммунных показателей, не достигающее, однако, нормальных значений при тяжелых формах этих расстройств (при атипичном детском психозе), что хорошо согласуется с данными клинических наблюдений о ремиссии низкого качества при этой форме расстройств.

Итак, на основе анализа полученных результатов можно заключить, что данные иммунологические показатели могут использоваться в качестве дополнительных диагностических критериев при клиническом обследовании для дифференциальной диагностики РАС и объективизации тяжести патологического процесса в мозге, а также определения качества ремиссии пациентов и мониторинга их состояния.

К онфликт интересов отсутствует.