Поиск новых биологических маркеров опухолевого процесса в почке находится в сфере внимания практических врачей, заинтересованных в повышении эффективности диагностики, наблюдения и оценки эффективности лечения этих опухолей. В этом смысле систему матриксных металлопротеиназ (ММП) и их тканевых ингибиторов (ТИМП) считают одной из наиболее перспективных и вовлеченных на всех этапах возникновения и прогрессии рака почки [1].
ММП, или матриксины, — семейство цинкзависимых эндопептидаз, которые играют ключевую роль в расщеплении компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ): фибриллярный и нефибриллярный коллаген, протеогликаны, гликопротеины, денатурированный коллаген, базальных мембран и ряда клеточных поверхностных белков. В физиологических условиях эти процессы активизируются в ходе эмбрионального развития, морфогенеза, репродукции, резорбции тканей, при ангиогенезе и апоптозе. Разнонаправленные изменения активности ММП наблюдают при различных патологических процессах: фиброзирующих заболеваниях сердца, легких, печени, почек; дегенеративно-воспалительных заболеваниях суставов; острых и хронических воспалительных процессах; злокачественных опухолях. Данные литературы свидетельствуют о дизрегуляции системы ММП/ТИМП при различной почечной патологии, в частности при наследственных и острых повреждениях почки, диабетической нефропатии, гломерулонефритах, хроническом интерстициальном фиброзе и тубулярной атрофии [37, 61].
ММП — внеклеточные белки. Однако исследования последнего десятилетия свидетельствуют о том, что ММП-1, ММП-2 и ММП-11 могут локализоваться и действовать внутри клетки. В основе структуры ММП лежат сигнальный пептид S, прокаталитический (Pro) и каталитический (Cat) домены, регулирующие протеолитическую активность этих ферментов. В состав большинства известных ММП, за исключением ММП-7 и -26, наряду с вышеназванными доменами входят также гемопексиноподобный домен (Hemopexin), присоединенный через шарнирный регион h. Между Pro- и Cat-доменами некоторых ММП обнаруживается фурин-чувствительный (расщепляемый фурином) регион F, фибронектинсвязывающий трансмембранный и гликозилфосфатидилинозитольный (GPI) домены, совокупность которых определяет субстратную специфичность ММП [61].
На основании различий в структуре и субстратной специфичности ММП разделены на 6 групп [42]:
— коллагеназы широкого спектра действия (ММП-1, -8, -13), содержащие гемопексиновый домен и расщепляющие коллагены I, II и III типов;
— желатиназы, А и Б (ММП-2 и -9 соответственно), в структуре которых есть фибронектинсвязывающие участки. Эти ферменты деградируют желатины (денатурированные коллагены, коллагены IV и V типов), ламинин, некоторые хемокины;
— стромелизины 1 и 2 (ММП-3 и -10 соответственно), расщепляющие такие белки стромы, как коллаген, фибронектин, ламинин, эластин, казеин;
— матрилизины (ММП-7 и -26), в составе которых имеются только пропептидный и каталитический домены. Матрилизины расщепляют различные матриксные белки, в том числе Е-кадгерин и про-α-дефензин;
— ММП мембранного типа, в структуре которых имеется трансмембранный домен или гликозилфосфатидилинозитоловый фрагмент, а также фурин-чувствительный фрагмент, взаимодействие которого с фурином приводит к активации ММП-МТ;
— другие ММП (ММР-11, -12, -19, -20, -21, -22, -23а, -23b, -28) — пептидазы, экспрессирующиеся единичными типами клеток в специфических условиях.
Ранее в литературе были представлены обзоры данных по регуляции активности ММП на уровне экспрессии генов [15]. В этот процесс вовлечены активирующие белки AP-1 и АР-2, РЕА-3, транскрипционные факторы NF-κB, Smad и STAT. Известно также, что тканевый активатор плазминогена (tPA) усиливает транскрипцию ММП-9 в фибробластах интерстиция почки, опосредованно через активацию поверхностно-клеточного рецептор LDL-связанного протеина-1 (LRP-1) и Erk-½ [22, 29].
Посттрансляционная регуляция активности ММП происходит двумя путями: 1) через активацию профермента, 2) путем взаимодействия с эндогенными ингибиторами. Перевод профермента в активную форму является результатом действия во ВКМ сериновых протеаз, плазмина, активатора плазминогена урокиназного типа (uPA), эластазы [51]. Внутриклеточная активация (например, ММП-11) происходит при участии ассоциированной с мембранами комплекса Гольджи протеазы фурина [1]. Активация проММП под воздействием окислителей была продемонстрирована в лабораторных условиях, однако значимость этого механизма в условиях in vivo не установлена.
ТИМП. Активность ММП во ВКМ регулируется их эндогенными ТИМП, эквимолярно связывающимися с цинксодержащим доменом как активных ММП, так и с их проферментами [50]. Семейство ТИМП объединяет 4 высокогомологичных по структуре белка, секретируемых в растворимой (ТИМП-1, -2 и -4) и связанной со структурами ВКМ (ТИМП-3) формах [2].
ТИМП-1 нековалентно связывается со всеми ММП, исключая МТ1-ММП, МТ3-ММП и МТ5-ММП. Высокоаффинное взаимодействие ТИМП-1 с коллагеназами ММП-1, -8, -13, -18, стромелизином-1 и желатиназой, А приводит к инактивации последних [61]. ТИМП-2 наиболее высокоспецифично ингибирует ММП-2. ТИМП-3 ингибирует преимущественно ММП-1, -2, -3, -9. ТИМП-4 в большей степени ингибирует желатиназу, А (ММП-2), связываясь с С-терминальным доменом молекулы как профермента, так и активного фермента. Наряду с ингибированием активности ММП ТИМП имеют и другие биологические функции, проявляющиеся в прямой регуляции роста и апоптоза клеток [57].
Экспрессия ММП и ТИМП в почечной ткани. Компоненты системы ММП/ТИМП обладают уникальным профилем экспрессии на протяжении нефрона. Экспрессия широкого спектра ММП (-2, -3, -9, -13, -14, -24, -25, -27, -28) и ТИМП (-1, -2, -3) иммуногистохимическими методами выявлена в мезангиальных, эндотелиальных, гладкомышечных, эпителиальных клетках и фибробластах почечной ткани человека и животных, что свидетельствует о значимой роли этих ферментов в функционировании почечной ткани [43].
ММП-2, -3 и -9 экспрессируются на протяжении всего нефрона (в клубочках, в проксимальных и дистальных канальцах, петле Генле, собирательных трубочках), а ММП-13, -14 — в основном в клубочках, ММП-24 локализована преимущественно в канальцах почки человека. В клубочках почки человека выявляются также ТИМП-1 и -2. И только отдельные представители ММП, связанные с клеточной мембраной, так называемые ММП мембранного типа (МТ-ММП), секретируются в функционально активной форме, все остальные ферменты семейства секретируются в форме неактивных проферментов. Активация латентных про-ММП происходит в результате отщепления от них пропептидного домена с помощью плазмина или других ММП [1].
Механизм реализации эффектов ММП при заболеваниях почек. Так как ренальный фиброз является общим исходом для различных почечных патологий, ММП считают перспективными антагонистами развития фиброзных изменений в почке. Выявление новых субстратов для ММП позволяет предположить, что эффекты этих ферментов не ограничены только деградацией компонентов ВКМ. Высказано предположение, что развитие ренального фиброза проходит через серию фаз, включая воспаление, активацию фибробластов/миофибробластов, перестройку матрикса и собственно фиброз [34]. Известно, что ММП работают на всех стадиях этого патологического процесса, а также принимают участие в процессах апоптоза, ангиогенеза и эпителиально-мезенхимального перехода [25]. ММП играют важную роль в активации клеток воспаления, регулируя таким образом воспалительный ответ. Например, ММП-13 и -14 расщепляют мембраносвязанную молекулу ICAM-1, промотирующую миграцию лейкоцитов из сосудистого русла в ткани, оказывая тем самым противовоспалительный эффект, а трансгенный ТИМП-1 повышает экспрессию ICAM-1 в проксимальном тубулярном эпителии [62]. MMP-9, по-видимому, играет определенную роль в поддержании воспалительного процесса, разрушая коллаген и приводя к генерации фрагментов коллагена, являющихся хемоаттрактантами для нейтрофилов и стимулирующих выработку нейтрофилами ММП-9 [65]. Кроме того, ММП-9 опосредует повышение миграционной способности дендритных клеток, а также может связываться с ко-стимулирующими молекулами на поверхности клеток [66]. MMP-14 также, по-видимому, оказывает стимулирующий эффект на миграцию дендритных клеток [17]. MMP-7 расщепляет синдеканы, усиливая воспаление путем создания градиента хемоаттрактантов [59]. MMP-7 также провоцирует воспаление, активируя выброс TNF-α макрофагами [20], расщепляя Е-кадгерин и регулируя миграцию дендритных клеток, экспрессирующих рецептор Е-кадгерина, CD103 (αEβ7-интегрин) [40].
Влияние ММП на пролиферацию и апоптоз клеток в почке. Система ММП/ТИМП вовлечена в регуляцию процессов пролиферации и апоптоза интерстициальных фибробластов и мезангиальных клеток клубочков [5, 31, 35, 44, 56]. Пролиферативный эффект ММП опосредован расщеплением мембраносвязанных белков-предшественников и выбросом ЭФР-подобных лигандов, которые в свою очередь связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (ЭФР) [47]. Сходным образом ММП могут секвестрировать ТИМП-1, который опосредует ингибирование пролиферации фибробластов через p-Act-путь [35]. Общее ингибирование ММП провоцирует остановку клеточного цикла и апоптоз мезангиальных клеток при анти-Thy1.1 нефрите, в то же время ТИМП-1 подавляет апоптоз мезангиальных клеток, подверженных стрессу в условиях in vitro [11].
ММП-7 может стимулировать апоптоз путем расщепления и генерации активного растворимого Fas-лиганда [48]. ММП-9, с другой стороны, защищает от апоптоза при остром повреждении почки через высвобождение растворимого фактора стволовых клеток (SCF), являющегося лигандом c-kit-тирозинкиназного рецептора [5].
ММП способны также модулировать апоптоз через другие нетривиальные механизмы, не связанные с выключением эктодоменов. Так, у ММП-8-дефицитных мышей наблюдали редукцию апоптоза нейтрофилов, связанную со снижением активности каспаз [10]. Интересно, что ММП-3 может транслоцироваться в ядро клеток млекопитающих и стимулировать апоптоз, этот эффект зависит от ее каталитической активности [56]. ММП-1 также может локализоваться в митохондриях и ядрах клеток различных типов, а выключение ММП-1 короткими интерферирующими РНК (siRNA) активизирует апоптоз клеток [31].
Деградация внеклеточного матрикса. Избыточное накопление элементов ВКМ также, по-видимому, связано с аберрациями в уровнях и активности ферментов ММП/ТИМП. Известно, что у пожилых людей с развитием почечного фиброза снижается уровень ММП-1 [16]. При фиброзе также наблюдается гиперэкспрессия TИМП-1, что приводит к активизации пролиферации фибробластов независимо от ингибирования ММП [35]. Дефицит ТИМП-1 не предотвращает развитие фиброза, что может быть связано с компенсирующим эффектом других ТИМП [63].
Деградация базальной мембраны, которая образована главным образом коллагеном IV типа и ламинином, под воздействием ММП, в частности ММП-2 и -9, оказывает пагубное действие на целостность структуры почечной паренхимы и таким образом прогрессирующее влияние на развитие фиброза при хронических заболеваниях почек, а также является частью процесса инвазии и метастазирования злокачественных новообразований почки [19, 22, 29]. Обобщая эти данные, можно сделать вывод о том, что вклад ММП/ТИМП в процессы деградации ВКМ в почке при различных патологических процессах является очень комплексным и может давать как стимулирующий, так и подавляющий эффект на прогрессирование заболевания в зависимости от субстратной специфичности ферментов, модели заболевания и стадии патологического процесса.
Влияние ММП на ангиогенез почечных сосудов. Увеличение экспрессии ММП является значимым фактором индукции злокачественного неоангиогенеза [6]. Понятно, что не только количество, но и процессы активации предшественников и ферментативная активность ММП рассматриваются в качестве лимитирующих факторов, определяющих их ангиогенные эффекты.
Первоначальные исследования ММП в солидных опухолях человека и в моделях in vivo на мышах были сфокусированы на опухолевых клетках. Повышенная экспрессия многих ММП, главным образом на границе опухоль-строма, показана различными методами, включая иммуногистохимический и гибридизацию in situ. По мере выяснения значения процессов неоангиогенеза в опухоли появились более детальные исследования экспрессии ММП в ассоциации с кровеносными сосудами — в клетках стромы, клетках воспаления, периваскулярных клетках. Двойное окрашивание клеточно-специфическими маркерами позволило выявить экспрессию ММП-9 клетками моноцитарно-макрофагального ряда в карциноме яичников [24], а также ММП-9-позитивные нейтрофилы в опухолях молочной железы, легкого, опухолей островков поджелудочной железы у трансгенных мышей [13].
ММП играют важную роль в регулировании функционирования клеток эндотелия и в прочности/упругости сосудистой стенки [23]. Хорошо известно, что продукты ММП-опосредованного протеолиза коллагена, в частности эндостатин, являются ключевыми медиаторами ангиогенеза [64]. Ангиостатин, который также является продуктом ММП-индуцированного протеолиза коллагенов, проявляет антиангиогенные свойства, что особенно сказывается при ишемических повреждениях почки [4], которые сопровождаются снижением плотности перитубулярных капилляров в наружном мозговом веществе после острой почечной недостаточности [3]. Установлена также достоверная позитивная корреляция (r=0,4096; р<0,01) между интенсивностью экспрессии ММП-9 и VEGF и их синергетическими эффектами на ангиогенез в опухоли при карциноме почки [67].
Впервые участие ММП в процессах инвазии и метастазирования опухолей установили L. Liotta и соавт. в 1980-х годах, обнаружившие протеолиз колагена IV типа под воздействием ММП-2 и/или ММП-9 при метастазировании меланомы кожи [33]. Данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что ММП экспрессируются как опухолевыми, так и стромальными клетками. Продукция ММП соединительнотканными клетками (фибробластами, клетками воспаления) связана с ответом на возникновение опухоли [1]. Ассоциация повышенной экспрессии ММП опухолевыми и/или стромальными клетками с ангиогенезом, инвазией и метастазированием продемонстрирована в экспериментальных исследованиях [13, 44]. Гиперэкспрессия различных ММП и ТИМП выявлена в опухолях различного происхождения у 70—90% пациентов [1, 18].
Паракринная регуляция системы ММП/ТИМП происходит при участии различных цитокинов и факторов роста, которые секретируются клетками, инфильтрирующими опухолевую ткань — макрофагами и лимфоцитами, а также клетками стромы опухоли [12, 44]. В некоторых ретроспективных клинических исследованиях отмечают взаимосвязь гиперэкспрессии различных ММП с такими клинико-морфологическими характеристиками опухолевого процесса, как степень дифференцировки опухоли и глубина инвазии, развитие отдаленных метастазов, а также с неблагоприятным прогнозом заболевания и низкой общей выживаемостью при различных злокачественных новообразованиях [14]. В частности, ММП-2 и -9 ассоциированы с более злокачественным фенотипом опухолевых клеток. По данным [36], полученным на шестидесяти парных образцах опухолевых и гистологически неизмененных тканей почки, подавление активности ММП-9 ингибирует инвазивную способность клеток светлоклеточной карциномы почки. Показано, что снижение экспрессии ММП-9 и в конечном итоге ингибирование инвазии опухолевых клеток может быть связано с ингибированием Ras/MAPK/ERK-сигнального каскада [58]. Следует отметить, что эффекты ММП-7 и -9, например, регулируются через канонический Wnt/β-катенин-сигнальный путь, который участвует в процессах онтогенеза и при острых повреждениях в почке [15, 21, 60, 61, 68].
Результаты исследования клинического значения уровня экспрессии ММП-9 клетками почечно-клеточной карциномы в 249 образцах от пациентов и в клеточной линии почечно-клеточного рака человека Caki-2 продемонстрировали статистически значимую корреляцию (р<0,01) между выраженной экспрессией ММП-9 в клинических образцах и неблагоприятным прогнозом (низкой общей выживаемостью). Имеются сообщения об успешной попытке ингибирования транскрипции ММП-9 мРНК с последующим снижением инвазивной способности клеток Caki-2, что позволяет рассматривать ММП-9 как потенциальную мишень противоопухолевой терапии [27, 30, 32, 35, 44, 53].
Исследование дифференциальной экспрессии ММП-7 в эпителии и строме почечно-клеточной карциномы (95 образцов) и гистологически неизмененной ткани почки позволило установить, что достоверно более высокие уровни ММП-7 выявлены в почечном эпителии по сравнению со стромой (р≤0,01), а также в окружающей опухоль неизмененной ткани при почечно-клеточной карциноме по сравнению с доброкачественными неоплазиями почки (ренальная папиллярная опухоль, онкоцитома). Наиболее высокая экспрессия ММП-7 обнаружена в хромофобной почечно-клеточной карциноме, ниже выраженность иммуногистохимического окрашивания на ММП-7 обнаружена в светлоклеточной и хромофильно-папиллярной карциномах, наименьший уровень экспрессии наблюдали в наиболее агрессивных гистотипах (веретеноклеточной и карциноме собирательных трубочек). Наиболее выраженная экспрессия ММП-7 отмечена в опухолях более высокой степени дифференцировки и на более высоких стадиях заболевания. Эти наблюдения подтверждают важную роль MMP-7 в развитии и прогрессировании рака почки, а дифференциальная экспрессия ММП-7 в различных гистологических типах, по-видимому, отражает более злокачественный фенотип и соответственно более агрессивное поведение почечно-клеточного рака [45].
При исследовании 232 образцов опухолей была выявлена статистически значимая высокая корреляция между экспрессией ММП-2 и ММП-9 в опухолевой ткани и такими клиническими характеристиками карциномы почки, как размер опухоли более 40 мм и ее инвазия в кровеносные сосуды, и было предложено использовать их для оценки прогноза заболевания [26].
Показано, что экспрессия ММП-2-белка значительно выше в ткани карциномы почек по сравнению с нормальной тканью почки [8]. Обнаружена достоверно (р≤0,05) более высокая экспрессия ММП-2 в опухоли у больных с высокодифференцированной карциномой почки при размере опухоли более 5 см, с метастазами в лимфоузлах на 3—4-й стадии в сравнении с пациентами, у которых размер опухоли не превышал 5 см, без метастазов с умеренно и низкодифференцированной карциномой почки на стадии I—II. Статистически значимые различия в показателях 5-летней выживаемости между ММП-2-позитивными и ММП-2-негативными пациентами подтверждают возможное использование экспрессии ММП-2 в качестве маркера прогноза при раке почки [8].
В результате метаанализа 17 исследований (проведенного китайскими учеными в 2015 г.) подтверждено, что повышенная экспрессия ММП-2 положительно коррелирует с такими клинико-морфологическими характеристиками карциномы почки, как стадия по системе TNM, степень дифференцировки и размер первичной опухоли, метастазы в регионарных лимфатических узлах, и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом заболевания. Выявлено также, что уровень ММП-2 достоверно выше у пациентов с несветлоклеточной карциномой почки по сравнению с пациентами со светлоклеточной карциномой (p<0,05) [9].
Все большее количество данных свидетельствуют о том, что уровни циркулирующих ММП-2 и/или ММП-9 могут служить маркерами прогноза или диагностики рецидива различных злокачественных новообразований [44]. Исследование на клеточной линии почечно-клеточной карциномы человека CAL 54 выявило гиперэкспрессию ММП-7. Содержание профермента было также проанализировано в 30 образцах сыворотки крови пациентов с почечно-клеточным раком и в 30 образцах сыворотки здоровых людей в контрольной группе, в результате чего было установлено, что при почечно-клеточном раке уровень проММП-7 в сыворотке крови достоверно выше, чем в контрольной группе (чувствительность 93%, специфичность 75%, р=0,0001) [52].
Перспективно также исследование уровней сывороточных ТИМП-1 и ММП-9. Так, показано, что базовые уровни ММП-9 в сыворотке крови пациентов, резистентных к сунитинибу, были значительно выше, чем у пациентов, чувствительных к терапии этим препаратом [38]. В то же время базовые сывороточные уровни ТИМП-2, напротив, были достоверно ниже у сунитиниб-резистентных пациентов. Различий между сывороточными уровнями ММП-2 и ТИМП-1 у респондеров и нон-респондеров не выявлено. Важно, что соотношение базовых уровней ММП-9/ТИМП-2 у резистентных к сунитинибу пациентов достоверно выше, чем у респондеров. Статистический анализ показал, что именно соотношение ММП-9/ТИМП-2 в сыворотке крови коррелировало с безрецидивной выживаемостью и служило независимым фактором прогноза при почечно-клеточном раке [38]. Представлено сообщения о возможном использовании сывороточной ММП-7 в качестве маркера метастазирования и оценки прогноза при почечно-клеточном раке [49].
Таким образом, по данным экспериментальных и клинических исследований, при карциноме почки наблюдается дизрегуляция системы ММП/ТИМП, а также отмечены гиперэкспрессия ММП-1−3, -9, -14−16, и снижение экспрессии ТИМП-1 и ТИМП-2 [7]. При раке почки выявлена также высокая экскреция ММП с мочой [55]. Повышенная экспрессия ММП-13 отмечена в ткани метастазов рака почки в костях [28, 29].
ММП в таргетной терапии рака почки. В последние годы быстрыми темпами развивается таргетная терапия метастатического рака почки. В рандомизированной III фазе клинических исследований сунитиниба и комбинации бевацизумаба и интерферона при метастатической карциноме почки продемонстрировано преимущество этих препаратов над монотерапией интерфероном в качестве терапии 1-й линии [40, 46]. Темсиролимус также был более эффективен, чем интерферон, у пациентов с неблагоприятным прогнозом [54]. И наконец, сорафениб и эверолимус показали эффективность как терапевтические агенты 2-й линии [14, 39]. Даже несмотря на клинические алгоритмы, которые рекомендуют наиболее подходящие в каждой клинической ситуации агенты, а также уже существующие методы лечения, каждому пациенту необходимы прогностические маркеры активности для определения наиболее подходящего лечения с целью достижения максимального клинического эффекта и минимизации токсичности и финансовых затрат [41]. Выбор прогностических маркеров ответа — это весьма непростая задача, учитывая большое количество потенциальных объектов для анализа. Современные методы анализа позволяют одновременно оценить большое количество молекулярных факторов, но интерпретация результатов и перевод их в клиническую практику является довольно длительной процедурой. Так, с помощью Human Cytokine Array, включающей 174 цитокина, у пациентов, получавших сунитиниб, удалось выявить наиболее информативные маркеры неблагоприятного прогноза: ФНО-α и ММП-9, базовые уровни которых были значительно увеличены у нон-респондеров, и что в значительной степени связано со снижением общей выживаемости и временем до прогрессирования соответственно. Базовые уровни ФНО-α и ММП-9, таким образом, при расширении группы пациентов могут стать прогностическими маркерами активности сунитиниба при почечно-клеточной карциноме [67].
Таким образом, исследование спектра, концентраций и соотношения экспрессии различных ММП и ТИМП, их биологических функций и прогностического значения может также оказаться полезным для разработки и эффективного применения новых ингибиторов ММП, специфичных для опухолей определенной локализации и/или для конкретного больного.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов и источника финансирования.