Согласно классификации ВОЗ [1], Ph-негативные хронические миелопролиферативные опухоли (ХМО) подразделяют на истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ). Большинство пациентов с ХМО являются носителями соматической мутации V617 °F в гене янус-киназы (JAK2), которая присутствует у 90—95% пациентов с ИП и у 60—70% пациентов с ЭТ и ПМФ [2]. Выявление мутации V617 °F JAK2 однозначно идентифицирует клональный характер патологии и позволяет исключить вторичные состояния, однако не помогает определить конкретную нозологическую форму ХМО. Вместе с тем соматическая мутация на другом участке гена JAK2, в его 12-м экзоне, высокоспецифична для ИП, но обнаруживается лишь у 5% пациентов с этим заболеванием. Описанные в декабре 2013 г. соматические мутации в гене кальретикулина (CALR) определяются у 20% пациентов при ЭТ и в 25% случаев при ПМФ, но не обнаруживаются при ИП [3]. Еще две более редкие «драйверные» мутации ХМО в гене рецептора тромбопоэтина (MPL) не выявляются у пациентов с ИП, но встречаются до 3 и 7% случаев ЭТ и ПМФ соответственно [1].

Обновленные рекомендации ВОЗ для диагностики ИП [4] включают три больших критерия: 1) гемоглобин более 165/160 или гематокрит более 49/48% для мужчин/женщин; 2) трехростковая гиперплазия по результатам биопсии костного мозга; 3) мутация JAK2 V617 °F или мутации JAK2 в 12-м экзоне, а также один малый критерий — субнормальный уровень эритропоэтина (ЭПО). Диагноз И.П. подтверждается при наличии трех больших или двух больших и одного малого критерия. Ключевое значение определения уровня ЭПО для дифференцировки ИП от неклональных эритроцитозов показано в ряде ранних исследований [5, 6]. После включения теста выявления мутаций в перечень больших диагностических критериев классификации (2008 г.) значимость ЭПО в диагностике ИП стала не такой критичной для постановки диагноза. До настоящего момента нет единого мнения о приоритетности проведения молекулярно-генетических исследований или определения уровня ЭПО в алгоритме диагностики ХМО. Кроме того, технические проблемы и отсутствие консенсуса в стандартизации теста препятствуют определению надежных пороговых значений уровня ЭПО, дифференцирующих пациентов с клональным и вторичным эритроцитозом.

На сегодняшний день предлагаются разные варианты диагностических алгоритмов И.П. Авторы [7] считают наиболее целесообразным всем пациентам с эритроцитозами проводить одновременное исследование уровня ЭПО и мутации V617 °F JAK2, другие исследования доказывают наибольшую эффективность первоначального тестирования всех проб на наличие мутации V617 °F JAK2 с последующим анализом уровня ЭПО [6], третьи предлагают вообще отказаться от определения ЭПО [6]. Экономическая и диагностическая целесообразность того или иного алгоритма отличается для каждой отдельной лаборатории и во многом зависит от потока проб, поступающих для анализа, и ожидаемой частоты выявления патологических сдвигов. Сравнительный анализ эффективности разных вариантов диагностических алгоритмов ХМО ранее не проводился.

Цель работы — провести сравнительную оценку диагностической эффективности использования алгоритмов, включающих тест определения уровня ЭПО в пробах крови пациентов, направляемых в лабораторию врачами-гематологами, при наличии клинических и гематологических подозрений на ХМО.

В настоящее исследование включены результаты тестирования 102 проб венозной крови пациентов (42 женщины, 60 мужчин, медиана возраста 53 года), проведенных в параллельных тестах на выявление соматических мутаций и определение уровня ЭПО. Пробы собирались в два этапа: с апреля по сентябрь 2014 г. (56 проб) и с апреля по июнь 2015 г. (46 проб). Основанием для обследования пациентов служили клинические проявления эритро- и (или) тромбоцитоза, высокие значения гемоглобина и гематокрита, а также сниженные показатели клеток периферической крови (подозрение на первичный миелофиброз). Окончательный диагноз устанавливали на основании критериев ВОЗ [4]. Сравнение двух алгоритмов тестирования (рис. 1, 2) проводили ретроспективно, сопоставляя итоговые результаты выявления отдельных нозологических форм ХМО. Гистологическое исследование костного мозга проводили специалисты лаборатории КГУЗ «Красноярское краевое патолого-анатомическое бюро». Кровь для молекулярно-генетических исследований брали из локтевой вены утром натощак в вакутейнер с ЭДТА для определения уровня эритропоэтина с активатором свертывания или цитратом натрия. Анализ уровня ЭПО проводили в сыворотке крови с использованием набора Biomerica EPO ELISA (США, референсный диапазон 3,2—31,9 мМЕ/мл) или в плазме крови с использованием набора Эритропоэтин-ИФА-БЕСТ («Вектор-Бест», Россия, референсный диапазон для мужчин 5,6—28,9 мМЕ/мл, для женщин 8,0—30,0 мМЕ/мл). Анализ параметров гемограммы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе ХТ-2000i («Sysmex Corporation»). С целью выявления мутации V617 °F в гене JAK2, мутаций c.1154_1155insTTGTC (p.K385fs*47) и c.1092_1143del (p.L367fs*46) в гене CALR и мутаций W515L/K в гене MPL (rs121913615 и rs121913616 соответственно) выполняли аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с зондами TaqMan. Данные о результатах выявления мутации в 12-м экзоне гена JAK2 получали в рамках совместной работы с сотрудниками ФБУН «Центрального НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора [8]. Для расчета трудозатрат использовали показатели лабораторных единиц (ЛЕ; 1 ЛЕ=10 мин), оцениваемых по результатам хронометража в условиях сложившегося в лаборатории потока проб.

Расчет трудозатрат (Т) на выполнение исследований получали умножением среднего времени длительности отдельной трудовой операции (М) на среднюю частоту ее выполнения за исследуемый период времени (К) (Т=М∙К) [9, 10]. Стоимость выявления одного случая ХМО рассчитывали посредством деления суммы всех затрат, использованных для выполнения всех включенных в алгоритм лабораторных исследований, на число пациентов с подтвержденным диагнозом. Коммерческую стоимость отдельных исследований определяли по прайс-листу, представленному на сайте ООО «Генотехнология» [11].

В табл. 1 представлены результаты тестирования в выбранной группе пациентов на драйверные соматические мутации ХМО (JAK2, CALR, MPL) и уровень циркулирующего ЭПО в алгоритме с одновременным тестированием. Из данных табл. 1 следует, что 75% пациентов с верифицированным диагнозом ИП имеют сниженный уровень ЭПО, у 17% пациентов этот показатель находится в пределах нормы, а 7% имеют повышенный уровень, что в целом согласуется с опубликованными данными (82, 16 и 2% соответственно) [4]. Результаты свидетельствуют, что уровень ЭПО не может служить надежным показателем, дифференцирующим реактивные и клональные эритроцитозы. Действительно, если придерживаться алгоритма (см. рис. 1), согласно которому в каждой пробе первоначально следует определить уровень ЭПО, то в 95 из 102 случаев все равно в дальнейшем будет показано проведение молекулярно-генетического анализа. С другой стороны, у 5 из 7 пациентов с повышенным уровнем ЭПО впоследствии был верифицирован диагноз ХМО, причем у 4 имелась мутация JAK2 V617 °F. Таким образом, повышенный уровень ЭПО не исключает наличия мутации JAK2 V617 °F, а использование алгоритма с первичным тестом на ЭПО могло бы пропустить около 10% (5 из 47) случаев ХМО.

Если следовать второму алгоритму (см. рис. 2) и сначала во всех образцах выполнить молекулярно-генетическое тестирование для выявления соматических мутаций, то необходимость определения уровня ЭПО для оценки вероятности вторичного характера эритроцитоза возникает в 56% случаев: из 102 пациентов у 57 мутаций не обнаружено.

Пробы с субнормальным уровнем ЭПО, но с высоким уровнем гемоглобина и гематокрита направляются на выявление мутаций в 12-м экзоне гена JAK2. В нашей выборке мутация в 12-м экзоне была выявлена у 1 (5%) из 21 пациента с ИП.

Вместе с тем, если в пробе крови пациента не обнаружено мутаций, то диагноз ХМО нельзя исключить, поскольку в отдельных случаях ИП и до 20% случаев ЭТ и ПМФ наблюдаются так называемые тринегативные варианты ХМО. Редкие наследственные заболевания, проявляющиеся стойкими эритроцитозами и тромбоцитозами, также не связаны с драйверными соматическими мутациями ХМО. Для окончательной верификации диагноза в соответствии с последними рекомендациями 2016 г. всем пациентам с высоким риском клонального процесса требуется проведение морфологического исследования трепанобиоптата. Кроме того, без качественного морфологического исследования невозможно верифицировать «латентную» форму ИП с пограничными уровнями гемоглобина и гематокрита, а также дифференцировать ЭТ и префибротическую стадию миелофиброза [4].

Вместе с тем в реальной практике врача-гематолога достаточно большую долю составляют пациенты со вторичными, маловыраженными и (или) не-стойкими гематологическими нарушениями и без явных клинических симптомов. В этом случае отрицательный результат молекулярно-генетического тестирования в комплексе с высоким или нормальным уровнем ЭПО позволяет отсрочить проведение трепанобиопсии. В нашей выборке 36% (20 из 55) пациентов соответствовали данному критерию. Еще одна ниша использования теста на ЭПО — определение резерва реактивности костномозгового кроветворения при миелофиброзе. Оценка уровня ЭПО в этой ситуации позволяет принять или отвергнуть решение о целесообразности экзогенного введения препаратов ЭПО.

В связи с более высокой частотой встречаемости мутации JAK2 V617 °F среди направляемых гематологами пациентов диагностический алгоритм ХМО целесообразно начинать с определения этой мутации, а при отрицательном результате следует провести тест на выявление мутаций в гене CALR. Исследование мутаций в 12-м экзоне гена JAK2 следует проводить тем пациентам, у которых не выявлено мутации JAK2 V617 °F, но наблюдается стойкое или значительное увеличение гематокрита и гемоглобина. В противном случае, ИП — маловероятный диагноз у пациентов без мутаций в гене JAK2 с нормальным или повышенным уровнем эритропоэтина. У пациентов с гематологическими признаками ЭТ или ПМФ после проведения анализа на наличие мутаций в генах JAK2 и CALR все отрицательные образцы следует исследовать на наличие более редких мутаций в гене MPL.

Итоговая сравнительная характеристика двух вариантов алгоритмов представлена в табл. 2. Выбор в пользу второго варианта вполне очевиден ввиду более быстрой возможности выявления клонального характера заболевания и меньших итоговых трудозатрат на выявление одного случая ХМО, прежде всего за счет затрат времени и реактивов на проведение теста ЭПО. Использование алгоритма с вторичным тестом на ЭПО позволяет более уверенно выделить группу пациентов с высокой вероятностью реактивных состояний, для которых мы предлагаем использовать тактику «отложенной трепанобиопсии». Поскольку ни один из пациентов данной группы впоследствии не поступал с морфологически подтвержденным диагнозом ХМО, можно констатировать, что в подавляющем числе этих случаев наблюдался вторичный характер выявляемых гематологических проблем без необходимости проведения срочной трепанобиопсии.

Авторы выражают благодарность руководству ЗАО «Вектор-Бест» за предоставленный набор реактивов Эритропоэтин-ИФА-БЕСТ, доценту СФУ Т.Н. Субботиной и студентке СФУ А.Е. Харсекиной, а также сотрудникам ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора К.О. Миронову, Е.А. Дунаевой за предоставленные результаты тестирования проб на мутации 12-го экзона гена JAK2.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ СО РАН и СФУ, фонд инноваций общественной организации «МедЛабДиагност».