Введение

Автоматические счетчики клеток крови, или гематологические анализаторы (ГА), с аналитической и технологической точек зрения являются сложными автоматизированными приборами [1—3]. Данные анализаторы используются для выполнения общего анализа крови (ОАК). ОАК состоит из нескольких параметров, определение которых выполняется единовременно, результаты выдаются в формате количественных значений, концентраций (в случае гемоглобина) и некоторых дополнительных (описательных) характеристик различных клеток крови (табл. 1).

ОАК проводится ежедневно практически во всех клинических лабораториях мира для скрининга и диагностики различных патологий, а также в ходе мониторинга при всех видах медицинских процедур (включая хирургию, трансфузиологию, лекарственную терапию и др.) [4, 5]. В связи с этим аналитические данные, выдаваемые ГА, являются основанием для разнообразных медицинских манипуляций, и потому достоверность результатов ОАК приобретает исключительно важное значение. По этой причине при введении в рутинную эксплуатацию нового ГА следует обязательно выполнить верификацию, чтобы удостовериться в соответствии аналитических характеристик определенному стандарту.

Итак, верификация является обязательной процедурой перед введением в эксплуатацию новых Г.А. Тем не менее выбор стандарта и допустимых значений остается в компетенции специалиста клинической лабораторной диагностики. Настоящая работа предлагает практическое руководство по верификации и контролю качества автоматических ГА, а также мнение экспертов относительно того, каким стандартам по своим рабочим и аналитическим характеристикам должны соответствовать ГА современного поколения.

Приводятся сводные данные:

1) текущего состояния (state-of-the-art) для рабочих характеристик ГА по параметрам общего анализа крови;

2) о проблемах разработки плана верификации;

3) относительно установки референсных пределов;

4) по методам и подходам к контролю качества исследований, выполняемых на ГА (в формате обзора).

Следует отметить, что изначально производители проводят валидацию диагностических анализаторов перед их запуском в коммерческий оборот в соответствии с требованиями различных национальных (например, FDA в США) или международных (маркировки CE в Европейском Союзе) стандартов. Она обычно производится в неких «идеальных» условиях. В условиях же реальной лаборатории аналитические характеристики могут меняться. Некоторые международные руководства и стандарты, например ICSH [6], CLSI [7], а также ISO 15189 [8], указывают на то, что лаборатория должна проводить верификацию Г.А. Помимо прочего, данные руководства перечисляют несколько параметров для верификации, которые также включают диапазоны воспроизводимости, правильности, сопоставимости и линейности. При этом следует отметить, что минимальные требования к аналитическим характеристикам на разных уровнях концентрации, как правило, не приводятся, и специалист клинической лабораторной диагностики вынужден самостоятельно решать этот вопрос. Помимо соблюдения рекомендаций стандартов, важно иметь информацию относительно достоверности лабораторных результатов, особенно для критических значений и принятия верных клинических решений по диагностике и лечению. Если требования к аналитическому качеству в области критических значений неопределенны, либо их колебания в этой области слишком велики, новый метод или анализатор следует использовать с предельной осторожностью. Настоящая публикация предлагает практические рекомендации по верификации и контролю качества ГА, а также мнение экспертов по стандартам, которым должны соответствовать указанные значения.

Согласно требованиям ISO 15189, лаборатория должна использовать только те ГА, которые были валидированы для выполнения соответствующих задач [8]. Например, согласно CLSI [7], валидация должна выполняться производителем соответственно области применения анализатора, и достаточно подтверждения лабораторией заявленных производителем характеристик. Поскольку не все ГА валидированы для исследования различных биологических жидкостей (синовиальной, перитонеальной, плевральной, перикардиальной, спинномозговой или раневого отделяемого), следует соблюдать определенные предосторожности, равно как при использовании разных пробирок (гепарин, цитрат вместо ЭДТА). Полная валидация также может потребоваться для модифицированных или измененных методик и проведения измерений вне установленных аналитических пределов. В ходе валидации перед производителем ГА возникает ряд трудностей:

1. Некоторые параметры ОАК должны сравниваться с референсным методом, тогда как большинство референсных методик на текущий момент устарели (в частности, для гематокрита, подсчета количества эритроцитов, дифференцировки лейкоцитов) [9]. В таких случаях лучшие характеристики нового метода сравниваются или калибруются по относительно низкому стандарту. Это в свою очередь приводит к худшим результатам, чем реально достижимо аналитически или технически. К сожалению, в некоторых странах регистрационные органы требуют сравнения именно с референсными методами и/или с анализатором текущего поколения. Подобное требование может, таким образом, привести к ухудшению аналитических показателей, а не к инновациям.

2. Трудности сравнения патологических показателей, отмечаемых так называемыми флагами. Образцы с флагами необходимо повторно измерить в другом режиме, провести дополнительные исследования (микроскопия мазка, проточная цитометрия). Алгоритмы, согласно которым генерируются «флаги» в новом и используемом ГА, могут кардинально различаться, что делает их сравнение трудной задачей. Обычно производители стараются удостовериться, что все патологические образцы, к примеру, содержащие бласты, выявлены. Чтобы предотвратить пропуск подобных патологических образцов, алгоритм генерирует флаги с так называемой положительной прогностической ценностью (PPV) и с отрицательной прогностической ценностью (NPV). Это приводит к тому, что большое количество образцов без патологии помечается флагами и требуют дополнительной микроскопии, увеличивая без надобности рабочую нагрузку на персонал лаборатории.

3. Определение референсных значений также может представлять определенные трудности для производителя ГА, особенно в педиатрии. Популяционные референсные интервалы для детей обычно основываются на публикациях десятилетней давности. Данные этих исследований были получены с помощью устаревших технологий, и это делает сомнительной целесообразность применения таких интервалов в настоящее время; либо предлагаются новые параметры, используются новые аналитические методы, для которых опубликованных референсных интервалов нет [14]. В связи с этим производители вынуждены прилагать значительные усилия при определении референсных пределов у подобных групп пациентов для новых моделей ГА.

В ИСО 15189 указано, что при установке и перед запуском в рутинную работу лаборатория должна объективно подтвердить, что ГА соответствует заявленным производителем характеристикам и соответствует требованиям для всех выполняемых на нем исследований [8]. И ICSH, и CSLI разработали собственные руководства по верификации ГА [6, 7, 9], согласно которым верификация должна выполняться в отношении сходимости, межсерийной воспроизводимости, правильности (сравнение методик), аналитической чувствительности (предел детекции), аналитической специфичности, включая оценку влияния интерферирующих веществ, референсные интервалы, корреляционные исследования проб пациентов, линейность, пределы измерения, полноту элюирования, и аналитический диапазон измерения. Однако ни ICSH, ни CSLI не предоставляют критерии приемлемости результатов таких исследований для различных параметров [9]. Также в указанных документах отсутствуют данные относительно минимального диапазона, в котором должна быть установлена надежность параметров. Масштабы проведения верификации зависят от наличия доступных независимых требований (предпочтительно, опубликованных в рецензируемой литературе); параметров ОАК, выдаваемых конкретной лабораторией; количества образца, достаточного для выполнения исследования. Поскольку Г.А. также проводят дифференцировку клеточных элементов и выдают результаты по клеточным индексам, некоторые преаналитические характеристики отличаются от таковых в лабораторных исследованиях, выполняемых в плазме или сыворотке крови. В связи с этим для интерпретации данных верификации ГА требуются специфические знания в области гематологии.

Перед началом верификации следует установить клинически допустимую ошибку. Комбинация различных аналитических характеристик теста формирует общую аналитическую ошибку, которая отражает аналитическую надежность результата. Если лаборатория желает подтвердить, что выдает надежные результаты с клинической точки зрения, возникают определенные нюансы. Во-первых, рекомендуется установить уровни клинической значимости. В табл. 1 предложено несколько пределов принятия решения для различных параметров ОАК. Поскольку некоторые из них разделяют пациентов на различные группы, значимость надежности результатов в области этих значений особенно велика. Например, если переливание тромбомассы производится при значении содержания тромбоцитов менее 10·10⁹/л, важно подтвердить аналитические характеристики теста именно в области данной концентрации. Во-вторых, общая аналитическая ошибка в области принятия клинического решения должна быть приемлема. Значение клинической допустимой ошибки может зависеть от ожиданий и требований клиницистов, биологической вариации или от достигнутого уровня качества (текущее состояние — state of the art).

Для проведения оценочного исследования необходимо использовать образцы цельной крови человека с K₂EDTA (или K₃EDTA) в качестве антикоагулянта в течение 4—8 ч после взятия при хранении при комнатной температуре [9, 15]. Если образцы хранятся в холодильнике, гематологические показатели сохраняют стабильность на более длительный промежуток времени [16—18]. Особое внимание следует уделить тому, чтобы в верификационное исследование были включены все типы пробирок, используемые в конкретной лаборатории. Если используются микропробирки (педиатрические пробы, капиллярная кровь), это должно быть отражено при проведении верификации, поскольку относительно низкий объем образца в этих случаях усложняет измерения на ГА (например, неправильное перемешивание; проблемы, связанные с «мертвым объемом»). Также следует удостовериться, что верификация охватит весь спектр патологий, значения исследуемых показателей на всем аналитическом диапазоне, т. е. в нее войдут образцы с низким содержанием тромбоцитов и/или лейкоцитов, гиперклеточные образцы, пробы с бластами и известными интерферентами (криоглобулинами, гипербилирубинемией, гипертриглицеридемией).

Сходимость (repeatability) — степень близости друг к другу значений повторных измерений одного и того же образца (см. рисунок)

[9, 15]. Сходимость или величина внутрисерийной воспроизводимости обычно определяется посредством 20 измерений показателя из одного и того же образца в одной аналитической серии и выражается в виде коэффициента вариации (CV). Величина межсерийной воспроизводимости (также в формате CV) определяется с помощью единичных измерений, проводимых в течение 20 дней, и она подвержена влиянию случайной и систематической ошибок (например, сдвиг или дрейф). Обычно для определения межсерийной воспроизводимости применяются стабилизированные образцы контрольного материала. Задача производителя — подтверждение величин как внутри-, так и межсерийной воспроизводимости. Однако помимо этого всегда следует стремиться к достижению CV на уровне, по меньшей мере соответствующем текущему современному состоянию, с целью предоставления клиницистам наиболее достоверной информации, обеспечивающей возможность совершенствования принятия клинических решений, и в конечном счете — улучшения качества оказываемой медицинской помощи. Текущие показатели воспроизводимости для основных параметров ОАК представлены в табл. 2.

Таким образом, клинические лаборатории тоже способствуют развитию и внедрению новых технологий на рынке ГА, в том смысле, что у производителей есть стимул к выпуску новых моделей, способных соответствовать по своим техническим возможностям нынешнему состоянию аналитического качества.

Для внесения ясности в формулировки перед переходом к рассмотрению данного аспекта приводятся основные определения в соответствии с принятыми в нормативной документации РФ.

Согласно ГОСТ Р ИСО 5725−1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения» [прим. перев. 1]:

3.6 Точность (accuracy): Степень близости результата измерений к принятому опорному значению

Следует особо отметить, что приводимый ГОСТ обращает внимание:

«…Термин «точность», когда он относится к серии результатов измерений (испытаний), включает сочетание случайных составляющих и общей систематической погрешности (ИСО 3534−1)» [1].

3.7 Правильность (trueness): Степень близости среднего значения, полученного на основании большой серии результатов измерений (или результатов испытаний), к принятому опорному значению.

Примечанием отдельно указывается, что «…показателем правильности обычно является значение систематической погрешности».

Также, «…в рамках обеспечения единства измерений термин «правильность (trueness)» — степень близости результата измерений к истинному (действительному) значению измеряемой величины или в случае отсутствия эталона измеряемой величины — степень близости среднего значения, полученного на основании большой серии результатов измерений (или результатов испытаний), к принятому опорному значению» [прим. перев. 1].

Исходя из вышеуказанного, принципиальным различием между понятиями «правильности» и «точности» является то, что правильность оценивается с помощью сравнивания среднего (бесконечно большого) количества измерений, а точность — конкретного результата, — с неким истинным (или, в его отсутствие, принятым опорным) значением.

Следует принять данный факт во внимание при изучении настоящего материала. Приведение автором статьи «правильности» как описания степени близости результата измерения к некоторому истинному значению (см. далее) подразумевает, что данный результат измерения получается в ходе рутинной лабораторной процедуры многократно, т. е. речь идет об «общей» правильности выдаваемых ГА результатов.

Термин «правильность» используется для описания степени близости результата измерения к некоторому истинному значению (см. рисунок) [9, 15]. При этом в рутинной лабораторной практике получить «истинное значение» для параметров ОАК затруднительно, поскольку референсные методики существуют лишь для ограниченного числа параметров и они крайне непрактичны [9]. Так, для результатов подсчета лейкоцитарной формулы референсным методом является ручной счет 400 клеток с помощью микроскопии мазка периферической крови [33]. Однако данная методика имеет существенные недостатки: подверженность влиянию статистических ошибок, ошибок, связанных с распределением форменных элементов в мазке и особенностями их морфологической интерпретации. Существует альтернативный подход: в ходе верификации новый ГА сравнивают с инструментом, находящимся в рутинном использовании. При сравнении обоих ГА с использованием проб пациентов следует анализировать как можно больше образцов: обычно 400 и более по каждому параметру. Более того, нормальные и патологические образцы необходимо включить в данное исследование примерно в равных количественных соотношениях. Разница показаний вводимого в эксплуатацию и используемого ГА (или референсного метода) должна быть минимальной (табл. 3, а).

Результаты по каждому параметру оцениваемого ГА сравниваются с применяемым анализатором методом линейной регрессии. Идеально сопоставимыми считаются результаты с коэффициентом корреляции (r), равным единице. Следует, однако, принять во внимание, что новый (вводимый в эксплуатацию) ГА может быть гораздо более точным, чем используемый, и это окажет отрицательное влияние на величину r; поэтому данный показатель следует интерпретировать с осторожностью и предельным вниманием. Кроме того имеются показатели, известные своей «плохой» корреляцией, например количество базофилов.

Клиническая чувствительность и специфичность при флагировании результатов измерения с помощью ГА может быть определена сравнением с результатами референсного микроскопического исследования с подсчетом и определением морфологии 400 форменных элементов [33]. Однако необходимо учитывать, что не все морфологические отклонения одинаково значимы с клинической точки зрения. Предполагается, что надежность флагирования устанавливается по меньшей мере для бластов, промиелоцитов, миелоцитов, промоноцитов, атипичных (потенциально злокачественных) лимфоцитов, фрагментов клеточных элементов, тромбоцитарных сгустков, агрегатов эритроцитов и (в зависимости от исследуемой популяции пациентов) эритроцитов с признаками поражения малярийными плазмодиями. Соответствующие величины специфичности (% образцов без флагов от всех нормальных с морфологической точки зрения) и чувствительности (% образцов с флагами среди всех с морфологическими отклонениями) должны быть рассчитаны математически. Текущие требования по некоторым параметрам даны в табл. 3, б, но в настоящее время не все лаборатории смогли достичь их выполнения.

Величина чувствительности важна для выявления всех патологий и выдачи достоверных результатов. Высокая специфичность в большей степени необходима для снижения числа излишних ручных микроскопических исследований и в конечном счете для повышения эффективности работы лаборатории. Для определения ориентировочных значений и общей эффективности флагов в клинической лабораторной практике следует выбрать случайные образцы, воспроизводящие рутинный рабочий процесс, поскольку именно такие пробы могут случайным образом оказаться морфологически патологическими. Величины NPV, PPV и общей эффективности рассчитываются по приведенным ниже формулам [15]. Не имеет смысла рассчитывать относительную чувствительность и специфичность для всех типов флагов на огромной выборке образцов, предлагается ограничить расчет наиболее значимыми из них.

где TN — количество истинно отрицательных результатов (нормальная морфология без флагов);

FP — количество ложноположительных результатов (нормальная морфология с флагом);

ТР — количество истинно положительных результатов (патологическая морфология с флагом);

FN — количество ложноотрицательных результатов (патологическая морфология без флага).

Как было указано ранее, величина PPV характеризует флаги с так называемой положительной прогностической ценностью, NPV — с отрицательной прогностической ценностью.

Эффект переноса рассчитывается на основании данных результатов исследования аналита, определяемого ГА, в ходе единичных последовательных измерений [6, 7, 9]. При наличии эффекта переноса результат в ходе последовательных измерений может искажаться (обычно в сторону завышения). Учитывать этот эффект особенно важно при определении концентраций гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов на низких и высоких значениях. В процентах эффект переноса устанавливается с помощью последовательного трехкратного измерения образца высокой концентрации аналита (Н1, Н2, Н3) сразу после трехкратного измерения образца низкой концентрации (L1, L2, L3). Итоговый показатель рассчитывается по следующей формуле:

Следует принять во внимание, что даже если величина составляет 2%, это может оказывать серьезное влияние на конечный результат исследования. Например, для образца с истинным содержанием тромбоцитов 1000·10⁹/л (Н3) показатель, равный 2%, означает, что можно ожидать ложного завышения результатов при последовательном измерении пробы с истинным содержанием тромбоцитов 5·10⁹/л (L3), вплоть до 25·10⁹/л (L1), т. е. на 500%. Этот эффект можно предотвратить, проводя измерения подобных образцов в дублях. Если же эффект переноса составляет 0,5% в том же примере, второй образец покажет результат 10·10⁹/л вместо истинного значения, равного 5·10⁹/л.

Фон (предел холостой пробы) — любой сигнал («шум»), который фиксируется анализатором, не относящийся при этом к искомому параметру. Фон может быть вызван интерферентами, например сигналы, фиксируемые при измерении самой реагентики без образца цельной крови или электронные «шумы» ГА [36]. В идеальном случае фон должен определяться как нулевое значение. Наличие даже незначительного фона особенно важно при исследовании биологических жидкостей с низким содержанием клеточных элементов (например, СМЖ). Нижний предел определения — это наименьшая концентрация аналита, которая формирует сигнал, различаемый анализатором от фонового. Данный показатель основан непосредственно на величине фона и воспроизводимости на низких концентрациях; с практической точки зрения хорошо, когда нижний предел детекции ниже определяемых рабочих диапазонов. Согласно CLSI [7] нижним пределом определения является тот уровень аналита, на котором CV для лейкоцитов составляет 15%, для тромбоцитов — 25%. Тогда, в идеале, нижний предел определения должен составлять <0,1·10⁹/л для лейкоцитов и <1,0·10⁹/л для тромбоцитов. Он должен использоваться для установления нижнего предела измерений для того или иного параметра (табл. 4).

Линейность (диапазон аналитического измерения) — способность ГА выдавать результаты, пропорциональные концентрации аналита, измеренной на установленном диапазоне значений [6, 7, 9]. Линейная зависимость определяемого параметра должна сохраняться на широком диапазоне концентраций для различных разведений. Естественно, эта формулировка относится к аналитам, определяемым в плазме или сыворотке крови, но никак не для клеточных индексов. Для определения линейности образец высокой (или искусственно доведенный до необходимой) концентрации разводится дилюентом, либо АВ-плазмой, и искомый параметр измеряется дважды. В оптимальном случае линейная регрессия будет представлять график, в котором свободный член уравнения регрессии окажется равным нулю, а тангенс угла наклона — равным единице. Коэффициент корреляции (r) должен также стремиться к единице. Поскольку сама линейность для современных ГА не является существенной проблемой, при ее определении наибольшие трудности могут возникнуть в ходе постановок четких повторных серий разведений.

На показатели ОАК могут оказывать влияние различные факторы: возраст, пол, этническая принадлежность пациента и пр. В связи с этим особую важность приобретает правильность и тщательность установки референсных интервалов для каждого параметра. В рекомендациях ICSH указывается на необходимость исследовать по меньшей мере 120 образцов (60 мужских и 60 женских) с целью подтверждения референсных интервалов для ГА [6]. Строго говоря, следует таким же образом провести верификацию и для педиатрических образцов, хотя на практике повсеместно распространено использование референсных интервалов из научных публикаций либо представленных производителем ГА. С другой стороны, если при введении в эксплуатацию нового ГА он показывает хорошую сопоставимость результатов с уже используемым прибором, необходимость дополнительной верификации референсных интервалов выглядит весьма сомнительно.

Для проведения внутрилабораторного контроля качества обязательно проводить ежедневные (или более частые) измерения контрольных образцов [7]. Обычно контрольные образцы коммерческого производства представлены двумя или тремя уровнями концентраций (низкий, средний/нормальный, высокий). При использовании контрольных материалов коммерческого производства имеется ряд особенностей. Во-первых, подобные контрольные образцы обычно подвергаются специальной обработке для продления срока годности и в связи с этим в анализе они могут вести себя отлично от реальных проб пациентов. Во-вторых, «целевые» пределы или приписанные значения (assigned values), указанные в инструкции производителя, обычно достаточно широки, а потому небольшие изменения в рутинной работе анализатора могут быть упущены из вида. В связи с этим лаборатории рекомендуется устанавливать собственные пределы допустимых значений (величины среднего и среднеквадратичного отклонения, Х_ср±2SD) в ходе проведения установочной серии. Преимуществом использования коммерческих контрольных материалов является возможность оценки воспроизводимости в течение некоторого промежутка времени (т.е. возможного сдвига показателей) с помощью графиков Леви—Дженнингса; при этом также следует учитывать, что по мере приближения к истечению срока годности контрольного образца его качество может ухудшаться [38, 39].

Привлекательной альтернативой видится применение так называемой методики плавающего среднего. Данный статистический метод основан на предположении, что аналитические параметры ОАК в большой выборке достаточно стабильны во времени, а потому резкое изменение среднего значения может указывать на наличие аналитической проблемы или ошибки. Такой способ контроля качества зарекомендовал себя как достаточно надежный и дешевый, однако он не может в полной мере заменить применение контрольных материалов [38, 39].

Если лаборатория располагает несколькими ГА и/или для определения одного и того же параметра применяются разные методики, необходимо проводить сравнение результатов контроля качества между анализаторами (анализ «межприборного» контроля качества), таким образом, чтобы вне зависимости от техники выполнения результат исследования одного и того же образца был одинаков на всех Г.А. Если в ходе измерения с помощью разных методик возникают неожиданные несоответствия между полученными данными, это может привести к ошибкам их клинической интерпретации и возможным неоправданным лечебным действиям [40, 41]. Гармонизация результатов, полученных на разных анализаторах и с помощью разных методик, подразумевает регулярный анализ «межприборного» контроля качества. Обычно процедура гармонизации результатов включает измерение образцов пациентов (во избежание так называемого «матрикс-эффекта» стабилизированных образцов контрольных материалов коммерческого производства) на применяемых тест-системах и сравнение полученных результатов. Рекомендуется выполнять подобные сличения на разных ГА по меньшей мере 1 раз в неделю и с применением 3 образцов и более [38, 39].

Участие в системе внешней оценки качества (ВОК) является обязательным [38, 39]. Образцы программы ВОК должны подвергаться тем же процедурам, что и образцы пациентов для достижения максимального сходства с рутинным ходом исследования. В ВОК обычно включаются пробы, соответствующие различным видам патологии (например, с экстремально высоким или низким содержанием клеточных элементов). При этом сами образцы подвергаются специальной обработке для продления срока годности и снижения влияния различных внешних факторов при транспортировке (изменения температуры, тряска и пр.). В связи с этим абсолютного сходства между подобными пробами и образцами реальных пациентов достигнуть невозможно. Лаборатория должна в обязательном порядке оценивать свои результаты в соответствующей группе сравнения или с референсными значениями. Это способствует улучшению качества измерений и гармонизации результатов с группой сравнения. Следует также учитывать, что в отсутствие референсной методики сличение необходимо проводить с теми типами ГА, которые используют одну и ту же методику измерения, поскольку данные групп сравнения могут быть подвержены систематическим сдвигам за счет особенностей конкретной диагностической системы [42]. Образцы ВОК нельзя использовать в качестве калибровочного материала, поскольку среднее в конкретной группе сравнения и «истинное значение», присвоенное калибратору, могут быть разными. В некоторых странах регулирующие органы злоупотребляют результатами ВОК при оценке качества работы конкретной лаборатории. Это однозначно оказывает негативное влияние на стремление лаборатории к развитию и совершенствованию [38, 39].