Использование ацетилсалициловой кислоты (АСК) наряду с циторедуктивной терапией входит в стандартный протокол терапии при Ph-негативных миелопролиферативных новообразованиях (ХМН): истинной полицитемии (ИП) и эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ). При этом известно, что часть пациентов (до 40%) могут проявлять различную степень аспиринорезистентности. Ранее с использованием импедансной агрегометрии в пробах цельной крови была показана повышенная по сравнению с контрольной группой агрегационная активность тромбоцитов при ИП и ЭТ не зависимо от принимаемого пациентами аспирина [1].
Вместе с тем остаются неясными механизмы влияния наиболее частой соматической драйверной мутации ХМН в гене янускиназы 2 (JAK2) V617F — на регуляцию агрегационной активности тромбоцитов. Существующий стандарт лечения также не предусматривает учет индивидуальных особенностей мутационного статуса и функциональной активности тромбоцитов пациента.
Цель настоящего исследования — изучение роли мутации V617F JAK2 в развитии феномена аспиринорезистентности у пациентов с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями.
Материал и методы
Агрегационная активность тромбоцитов была исследована импедансным методом на агрегометре Chrono-Log 700 (США) в пробах цельной крови у 47 пациентов, в том числе 22 c ИП, 7 с ЭТ, у 18 пациентов с неуточненным вариантом ХМН на момент анализа. Венозную кровь забирали утром натощак в вакутейнеры с 3,2% цитратом натрия. Агрегометрию проводили в течение первых 3 ч после взятия крови. Индукцию осуществляли аденозиндифосфорной кислотой (АДФ) в конечной концентрации 5 мкМ. Для стандартизации условий агрегации тромбоцитов у принимающих и не принимающих аспирин пациентов агрегацию измеряли как исходно, так и после предварительной инкубации проб цельной крови в течение 10 мин с раствором АСК в конечной концентрации 0,1 мМ. Ранее, используя в качестве индуктора арахидоновую кислоту в конечной концентрации 0,5 мМ, мы показали, что в выбранных нами условиях in vitro АСК полностью ингибирует циклооксигеназу (ЦОГ) у подавляющего числа здоровых людей [2].
С целью исследования роли активности JAK2 в механизмах регуляции агрегационной активности тромбоцитов у 23 пациентов с мутацией V617F JAK2 у 5 пациентов с мутацией в гене CALR и у 12 человек группы контроля был использован тест предварительной инкубации проб крови с ингибитором JAK (JAK Inhibitor I, CAS 457081−03−7, «Calbiochem»). Ингибирующий эффект регистрировали в случае, если амплитуда агрегации на фоне инкубации пробы с ингибитором JAK2 составляла не более 2 Ом. Экспрессия мРНК JAK2 была исследована у 70 пациентов с ХМН методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме «реального времени» с использованием зондов TaqMan на приборе CFX96 («Bio-Rad»). Расчет относительного уровня экспрессии JAK2 осуществляли с использованием метода ∆Ct по отношению к гену домашнего хозяйства ABL1.
Для проведения статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 10.0. Для анализа статистических отличий использовали метод χ2 и непараметрический метод Манна—Уитни, отличия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Из результатов исследования, представленных на рис. 1, видно, что у 24 пациентов предварительная инкубация in vitro проб цельной крови с АСК приводит к отсутствию агрегации в ответ на индукцию арахидоновой кислотой, однако при этом агрегационный ответ на АДФ у них сохранялся — независимая от циклооксигеназы (ЦОГ) аспиринорезистентность. В то же время выявлены 19 пациентов, в пробах крови которых даже после инкубации с АСК уровень агрегационного ответа на арахидоновую кислоту был хоть и снижен, но тем не менее достаточно высок (ЦОГ-опосредованная аспиринорезистентность). Эти данные соответствуют известному факту снижения дезагрегационной активности аспирина у пациентов с ХМН [1].
Одной из причин развития ЦОГ-независимой аспиринорезистентности может являться «компенсаторное» усиление роли независимых от ЦОГ и тромбоксана сигнальных путей агрегации, инициируемых агонистом рецепторов АДФ. Теоретически в таких компенсаторных механизмах может быть задействована тирозинкиназная активность, в том числе активность JAK тромбоцитов. Для проверки данной гипотезы мы использовали тест предварительной инкубации проб крови с коммерческим ингибитором JAK2. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 2, на котором видно, что у пациентов с аллельной нагрузкой JAK2 более 50% в большинстве случаев (82% проб) наблюдалось снижение агрегации после инкубации цельной крови с ингибитором JAK2. И лишь в 29% случаев у пациентов с аллельной нагрузкой менее 50% наблюдался подобный эффект снижения. Различия между двумя этими группами были статистически достоверны (χ2=5,6; р=0,01).
Интересно, что у пациентов с мутаций в гене кальретикулина (CALR+) случаев ЦОГ-независимой аспиринорезистентности в нашей выборке не наблюдали. Это хорошо согласуется с известным фактом, что частота тромботических осложнений при данной мутации у пациентов с ХМН гораздо меньше, чем при наличии мутации в гене JAK2 [3]. Таким образом, тромбоцитарная JAK2 принимает участие в регуляции АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Наиболее вероятное объяснение может заключаться в том, что при аллельной нагрузке более 50% в костном мозге и крови будут обнаруживаться клетки с потерей гетерозиготности по V617F, имеющие оба мутантных аллеля JAK2. Вследствие потери гетерозиготности по мутантному гену JAK2 мегакариоциты будут генерировать тромбоциты, обладающие повышенной активностью мутантного варианта JAK2 и соответственно более выраженным подавлением ее функции ингибитором. Следует отметить, что факт снижения ЦОГ-независимого компонента агрегации ингибитором JAK2 в условиях 10 мин инкубации in vitro, свидетельствует о независимом от геномной регуляции механизме действия JAK2 на агрегацию тромбоцитов. Известно, что эффекты активации JAK2 могут опосредоваться сигнальными каскадами, вызывающими увеличение уровня ионизированного кальция в цитоплазме. Непосредственное участие JAK2 в оперативной регуляции функций тромбоцитов у пациентов с ХМН согласуется с описанными ранее результатами [4].
В механизмы ЦОГ-независимой аспиринорезистентности, очевидно, могут быть вовлечены и сдвиги в экспрессии мРНК JAK2. Действительно, в наших исследованиях показаны (рис. 3) статистически значимые отличия уровня экспрессии внутритромбоцитарной мРНК гена JAK2 в группах пациентов с ХМН в зависимости от ответа их тромбоцитов на индуктор АДФ в присутствии аспирина.
Как и следовало ожидать, при ЦОГ-независимой аспиринорезистентности наблюдается повышенная экспрессия мРНК JAK2.
Участие сдвигов экспрессии мРНК JAK2 в механизмах тромбоцитарного гемостаза в норме и при ХМН, а также при приеме препаратов-ингибиторов JAK2 требует дальнейшего изучения.
Заключение
Результаты настоящего исследования подтверждают гипотезу о вовлеченности JAK2 в механизмы развития независимой от ингибирования ЦОГ резистентности к АСК.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: krashemcenter@mail.ru;
ORCID: http://orcid.org /0000-0003-2311-2219