В 1988 г. в Стокгольме на 5-й Международной конференции по опухолевым маркерам человека было использовано следующее определение: «Биохимические опухолевые маркеры — это вещества, образуемые опухолевыми клетками и секретируемые в биологические жидкости, в которых они могут быть количественно определены неинвазивными методами». Для использования какого-либо биомаркера в клинической практике необходимо прежде всего четкое понимание природы его происхождения [1]. В настоящее время активно изучают диагностический потенциал такого биомаркера, как внеклеточная ДНК (вкДНК). Принципиальным для понимания роли вкДНК и перспектив ее использования в лабораторной диагностике онкологических заболеваний является источник ее происхождения. Если вкДНК происходит из соматических клеток в результате апоптоза и некроза, то по уровню вкДНК можно судить об объеме опухолевого процесса, непосредственно связанного с повреждением окружающих тканей [2]. Если вкДНК происходит из высокомолекулярной ДНК нейтрофилов (нейтрофильные внеклеточные ловушки, neutrophil extracellular traps, NETs) [3], то по уровню вкДНК можно судить о системном ответе на наличие опухолевого процесса, что связано с усилением ангиогенеза, метастазированием или образованием опухоль-индуцированных тромбоэмболий [4]. Если же вкДНК имеет преимущественно опухолевое происхождение, то становится очевидной перспектива использования вкДНК в жидкостной биопсии и молекулярном профилировании опухоли. Наличие мутаций, обнаруженных и в опухолевой ткани, и в вкДНК, может служить доказательством опухолевого происхождения вкДНК.

Цель исследования — изучение мутационного статуса гена EGFR вкДНК плазмы крови и сопоставление с мутационным статусом опухоли у больных немелкоклеточным раком легких (НМРЛ) для выявления возможных источников происхождения вкДНК.

Исследование было выполнено в два этапа. Первый этап — определение мутационного статуса гена EGFR (мутация L858R в 21-м экзоне и микроделеции в экзоне 19 (747—750 нуклеотиды)) на ограниченной выборке пациентов (n=13) с диагнозом немелкоклеточного рака легких (аденокарцинома и плоскоклеточный рак). Второй этап — метаанализ сопоставимости встречаемости мутации гена EGFR (мутация L858R в 21-м экзоне и микроделеции в 19-м экзоне) в ткани опухоли и вкДНК крови больных НМРЛ.

В группу больных для исследования мутационного статуса вкДНК плазмы крови и ДНК опухоли вошли пациенты с диагнозами: НМРЛ, аденокарцинома (76,9%) и НМРЛ, плоскоклеточный рак (23,1%). У пациентов был проведен забор образцов плазмы крови и образцов опухоли, полученной как интраоперационно, так и из парафиновых блоков с тканью. В данной группе были 7 (53,8%) женщин и 6 (46,2%) мужчин, средний возраст 57±6 лет.

Мутационный статус гена EGFR в вкДНК плазмы и ДНК опухоли определяли с помощью набора реагентов для выявления мутаций L858R и del746—750 в гене EGFR («Биолинк», Россия) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на амплификаторе BioRadCFX 96.

Методология проведения метаанализа выполнена в соответствии с положениями инструкции «Предпочтительные параметры отчетности для систематических обзоров и метаанализа (PRISMA)» [5].

В поисковых системах PubMed, MEDLINE, Cochrane Central Register of Controlled Trials (CENTRAL) проведен поиск по таким ключевым словам, как cell free DNA, EGFR, circulating DNA, NMCL, Non-Small Cell Lung Cancer, circulating tumor DNA, free DNA. Ограничения по дате и языку публикаций отсутствовали. Найденные исследования анализировали по следующим критериям: дизайн, число включенных пациентов, оценка встречаемости мутации гена EGFR в ткани опухоли и вкДНК крови. Риск систематической ошибки и качество методологии включенных в анализ исследований оценивали с помощью разработанного организацией «Кокрановское сотрудничество» инструмента оценки риска систематической ошибки на основе принципов Кокрановского руководства по систематическим обзорам медицинских вмешательств [5].

Для статистической обработки данных использовали Excel из пакета OfficeXP («Microsoft», США), Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США), Origin («Originlab», США). Для исследования гетерогенности полученных данных применяли Q-тест и I². При I²=0% подразумевалось отсутствие гетерогенности между исследованиями, а значения больше 0% указывали на растущую гетерогенность.

Количество публикаций в поисковых системах PubMed, MEDLINE по таким ключевым словам, как cell free DNA, EGFR, circulating DNA, NMCL, Non-Small Cell Lung Cancer, circulating tumor DNA, free DNA, увеличивается с каждым годом (рис. 1),

Для проведения метаанализа выполнен поиск по ключевым словам. Было найдено 588 публикаций, 381 работа была удалена после прочтения названия и резюме. Более тщательной оценке подвергнуто 207 статей, из них только 91 работа подошла под критерии включения в обзор (рис. 2).

В соответствии с критериями включения для выполнения метаанализа было объединено 28 исследований, включающих 3371 человека, в которых дана оценка сопоставимости мутационного статуса гена EGFR вкДНК плазмы крови и ткани опухоли (табл. 1).

При выполнении метаанализа показано отсутствие гетерогенности между исследованиями (Q=0,001699, I²=0), средневзвешенный процент совпадения мутационного статуса опухоли и вкДНК плазмы крови составил 88,1%, 95% доверительный интервал (ДИ) 86,96—89,18 (см. табл. 1).

При исследовании молекулярно-генетических изменений в образцах опухоли и вкДНК плазмы крови у больных с НМРЛ показано, что активирующая мутация в гене EGFR в нашей выборке встретилась у 2 (15%) пациентов, из них эта же мутация была обнаружена в вкДНК плазмы в 50%. У остальных пациентов не было мутации ни в образцах опухоли, ни в вкДНК плазмы. Активирующая мутация была обнаружена у пациентов с гистологическим типом аденокарциномы. Процент совпадения мутационного статуса опухоли и вкДНК крови (конкорданс) составил 92,3%, 95%ДИ 63,9—99,8 (рис. 3).

Исходя из проведенного метаанализа видно, что, даже несмотря на небольшой объем выборки, нами получены сходные со средними показателями данные (см. рис. 3).

Принципиальным в данной работе являлось не столько число пациентов, у которых обнаружена мутация, сколько процент соответствия (конкорданс) мутационного статуса вкДНК плазмы и ДНК опухоли. Как у пациентов, включенных в наше исследование, так и по результатам проведенного метаанализа видно, что мутационный статус вкДНК плазмы крови в большинстве случаев (>88%) соответствует мутационному статусу опухоли.

Полученные результаты позволяют говорить об опухолевом происхождении вкДНК, что открывает новые возможности для понимания биологической роли вкДНК плазмы крови и оценки перспектив применения данного биомаркера в клинической практике.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:alexa-1808@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-4249-8225