В середине XIX в. анатом Йохан Мюллер впервые описал эмбриональный проток — предшественник женской половой системы, из которого при развитии эмбриона по женскому типу формируются матка, фаллопиевы трубы и верхняя часть влагалища. Впоследствии он был назван «мюллеров проток». Другой физиолог — Каспар Вольф — исследовал проток, являющийся предшественником органов мужской половой системы, из которого при развитии эмбриона по мужскому типу на 8—10-й неделе гестации формируются придатки яичка, семенные пузырьки и семявыносящий проток. Впоследствии он был назван «вольфов проток». В начале I триместра в организме эмбриона присутствуют и вольфов, и мюллеров протоки.

Роль антимюллерова гормона (АМГ) в половой дифференциации плода была впервые описана Альфредом Йостом в 1947 г. [1]. Исследователем было показано, что при формировании плода по мужскому типу происходит регрессия мюллерова протока под влиянием АМГ, вырабатывающегося клетками Сертоли. Соответственно в мужском организме АМГ выделяется с высокой интенсивностью в течение фетального периода и в детстве, однако уровень экспрессии снижается, когда половые клетки в яичках начинают процесс мейоза — в пубертатный период и у взрослых мужчин. В связи с этим определение уровня сывороточного АМГ у мужчин используется для оценки наличия тестикулярной ткани и функции клеток Сертоли — в основном у мальчиков с низким уровнем тестостерона в препубертате, в комплексе с оценкой лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и тестостерона [2, 3].

У женщин синтез АМГ происходит в клетках яичников и отмечается примерно с 23-й недели гестации, достигая пиковых значений, наоборот, в период пубертата [4]. Ориентировочно до 25 лет концентрация АМГ остается на достаточно стабильном уровне, после чего начинает проявляться выраженная отрицательная корреляция с возрастом; снижение до неопределяемых концентраций достигается примерно за 5 лет до наступления менопаузы [5—8].

Подобное снижение уровня АМГ у женщин обусловлено физиологическими аспектами. Исследователями показано, что девочка рождается с определенным количеством ооцитов, окруженных фолликулярными клетками (примордиальных фолликулов). Число и/или качество ооцитов, отражающее способность к репродукции, принято называть «овариальным запасом» [9]. Количество примордиальных фолликулов в течение жизни женщины будет только уменьшаться. До достижения половой зрелости переходящие в рост примордиальные фолликулы подвергаются дегенерации. После достижения половой зрелости часть растущих примордиальных фолликулов достигает по мере созревания фазы преантрального, малого антрального, антрального и впоследствии доминантного фолликула; при этом до последней стадии доходят единичные фолликулы. Синтез АМГ происходит в клетках гранулезы растущих преантральных и малых антральных фолликулов, диаметром до 8 мм. При этом по принципу обратной связи АМГ как ингибирует первичную рекрутизацию примордиальных фолликулов, так и снижает чувствительность антрального фолликула к ФСГ, ингибируя ФСГ-зависимый рост и отбор преантральных и малых антральных фолликулов. На этапе рекрутизации больших антральных фолликулов, чувствительных к ФСГ, уровень АМГ снижается до недетектируемых уровней, и антральные фолликулы достигают размера 8 мм [10, 11].

Таким образом, предполагается, что концентрация АМГ косвенно отражает количество оставшихся примордиальных фолликулов; фактически, К. Hansen и соавт. [12] сообщили о зависимости между концентрацей АМГ и числом овариальных примордиальных фолликулов (функциональный «овариальный резерв»).

Последние исследования показывают, что АМГ является лучшим маркером овариального резерва по сравнению с возрастом [13] и такими маркерами, как сывороточный ФСГ, эстрадиол, ингибин В и подсчет антральных фолликулов на 3-й день фолликулярной фазы менструального цикла [14]. На практике определение уровня АМГ дает возможность оценить овариальный статус женщины и предположить, можно ли откладывать беременность. При этом референтные интервалы (РИ) позволяют оценить диапазон значений АМГ в рамках 95% перцентиля у условно здоровых добровольцев в группах по возрастам.

Стоит отметить, что у женщин АМГ имеет широкое клиническое применение: он используется в том числе как предиктор ответа на стимуляцию яичников в рамках процедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В этой области применения наибольшее значение будет иметь пороговое значение АМГ, позволяющее предсказать «слабый» овариальный ответ. Так, Болонские критерии, разработанные экспертами в 2010 г., предполагают наличие как минимум двух из трех нижеперечисленных параметров: 1) возраст старше 40 лет или любой другой фактор риска; 2) наличие слабого ответа в анамнезе (<3 ооцитов в протоколе стимуляции); 3) неудовлетворительные тесты на определение овариального резерва: число антральных фолликулов (ЧАФ) <5—7 или уровень АМГ <0,5—1,1 нг/мл [15].

Обновленные критерии POSEIDON, разработанные в 2017 г., делят пациенток на 4 категории в зависимости от уровня АМГ (с единым пороговым значением, принятым как 1,2 нг/мл), возраста и количества ооцитов, определенного с помощью ультразвукового исследования — УЗИ (рис. 1)

При этом крайне важно, чтобы и РИ, и пороговые значения соответствовали методу, используемому лабораторией для измерения АМГ. В связи с тем, что в настоящее время многие лаборатории в мире выполняют тестирование с помощью автоматического метода, исследователи разрабатывают метод-специфические пороговые значения и референтные интервалы. Так, в 2018 г. была опубликована статья V. Baker с результатами исследования порогового значения АМГ автоматическим методом Access AMH («Beckman Coulter Inc.») для женщин со «слабым» овариальным ответом: 0,93 нг/мл [17].

Многими исследованиями показана эффективность применения АМГ при проведении диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) — АМГ является более чувствительным маркером по сравнению с УЗИ яичников. При СПКЯ увеличивается число растущих фолликулов, поэтому уровни АМГ повышаются по сравнению с нормой. Традиционно в диагностике СПКЯ используется подсчет ЧАФ с использованием УЗИ, в ходе которого определяются только самые крупные из растущих фолликулов. АМГ может рассматриваться как более надежный и чувствительный тест для определения избытка фолликулов, чем ЧАФ, так как отражает больше классов фолликулов, включая более маленькие по размеру [18]. Поэтому в 2018 г. группой исследователей — L. Sun и соавт. — были разработаны метод-специфические РИ для женщин без и с СПКЯ [19].

Наличие метод-специфических РИ для разных групп испытуемых особенно важно в связи с отсутствием единого стандарта определения АМГ. Однако даже при наличии РИ в инструкции компании-производителя для врача-клинициста важны РИ, специфичные для конкретной популяции. Так, например, R. Woloszynek и соавт. установили РИ, специфичные для бразильской популяции [20].

Н. Jopling и соавт. разработали РИ для детей с учетом пола для разных возрастных категорий [21]. Сравнение педиатрических РИ, полученных в Великобритании, с указанными в инструкции к методу Access AMH представлено в приложении 1 (доп. табл. 1).

В свою очередь лаборатории зачастую сталкиваются с проблемой установления собственных РИ ввиду трудоемкости и дороговизны процесса.

Цель данного исследования — установление РИ для АМГ для женщин с учетом возраста и мужчин, специфичных для российской популяции. Согласно требованиям международного протокола CLSI ЕР-28 А3С [22], при возможности проведена верификация РИ производителя теста либо установлены новые РИ.

Практическая значимость работы заключается в помощи лабораториям и врачам-клиницистам в разработке популяционно-специфических РИ для АМГ у женщин разных возрастных групп и мужчин.

В исследование были включены 460 добровольцев (436 женщин и 24 мужчины) с субъективно хорошим самочувствием в возрасте от 18 до 60 лет.

Регион проживания Москва и Московская область.

Все участники заполнили анкету с информацией о росте, массе тела, анамнезе, статусе курения (да/нет), а также репродуктивном анамнезе, в том числе об использовании гормональной контрацепции у женщин. От всех добровольцев было получено письменное информированное согласие и согласие на обработку персональных данных.

Критериями невключения являлись беременность, СПКЯ, проведенные операции на яичниках.

У женщин взятие крови было произведено вне зависимости от фазы менструального цикла.

Добровольцы-женщины были разделены на 6 возрастных групп:

— 18—25 лет — 20 человек;

— 26—30 лет — 120 человек;

— 31 год—35 лет — 120 человек;

— 36—40 лет — 120 человек;

— 41 год—45 лет — 28 человек;

— 46 лет и старше — 28 человек.

Взятие крови проводили в клиниках сети «Центр иммунологии и репродукции» (Москва) путем венепункции в пробирки с разделительным гелем и активатором сгустка. После центрифугирования и отделения сыворотки образцы хранили при температуре –20 °С в течение не более 3 мес.

АМГ определяли с помощью теста Access AMH на иммунохимическом анализаторе Access 2 производства компании «Beckman Coulter Inc.» в соответствии с требованиями инструкции к набору реагентов.

Верификацию и валидирование РИ для АМГ проводили в соответствии с рекомендациями международного руководства CLSI EP28-A3C [22] и ГОСТ РФ 53022.3−2008 [23], включающими в том числе следующие требования к числу добровольцев:

— для установления РИ минимальная численность одной обследуемой группы должна составлять не менее 120 человек;

— для верификации существующего РИ минимальная численность одной обследуемой группы должна составлять не менее 20 человек, РИ считается верифицированным при условии, что не более двух значений окажутся за пределами РИ.

В рамках исследования всем женщинам проводили определение ЧАФ (AFC) на УЗИ (аппараты Medison Ultrasound Systems; SonoAceX8, Accuvix V10). УЗИ выполняли в 1—4-й дни менструального цикла (или в любой день при отсутствии менструаций).

Добровольцы-женщины были разделены на три группы:

0 — фолликулы не определяются;

1 — единичные фолликулы (до 10 фолликулов);

2 — достаточное количество фолликулов (11—20 фолликулов);

Данное исследование было одобрено Этическим комитетом клиники ЦИР.

РИ рассчитывали с помощью статистической программы Stata 11 непараметрическим методом (команда centile в программе Stata 11) как для доверительного интервала (ДИ) медианного значения, так и для 90% ДИ пределов Р.И. Непараметрические методы использовали, так как мы не могли утверждать, что существует нормальное распределение величин наблюдаемых нами показателей АМГ как в целом, так и для каждой возрастной группы. Подробнее описание формулы представлено в работе А. Mood и соавт. [24].

Исследование зависимости уровня АМГ от возраста и количества определяемых на УЗИ фолликулов проводили методом корреляции Пирсона, при этом значимым считали значение на 5% уровне значимости (p<0,05).

Достоверность различий между группами с разным количеством фолликулов определяли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни (U-критерий).

Проведено обследование группы из 24 мужчин в возрасте от 21 года до 60 лет. Все значения оказались внутри предложенного производителем РИ, равного 0,73—16,05 пг/мл, который был верифицирован для российской популяции. РИ, рассчитанные в рамках данного исследования на группе из 24 человек, приведены в табл. 1 для информации; при необходимости получения собственных РИ для мужчин исследование будет продолжено на более широкой выборке.

В финальное определение РИ были включены 436 женщин в возрасте от 18 до 60 лет, разделенные по группам в зависимости от числа фолликулов: 0 (не определяются), 1 (единичные) и 2 (достаточное количество).

В группах 18—25 лет, 41 год—45 лет и старше 46 лет проведено обследование не менее 20 пациентов. Все значения для групп 41 год—45 лет и старше 46 лет оказались внутри РИ, приведенных в инструкции производителя реагентов метода Access AMH, что позволило верифицировать их для российской популяции и лаборатории. РИ, рассчитанные в рамках российского исследования для двух последних групп, приведены для информации; при необходимости получения собственных РИ исследование будет продолжено на более широкой выборке (табл. 2).

Для группы в возрасте 18—25 лет был получен узкий РИ и не было выявлено статистических отличий групповой медианы от средней по всей выборке. По нашему мнению, это связано с малым количеством выборки и требует дальнейшего исследования с привлечением большего числа добровольцев данной возрастной категории; в данном исследовании было принято решение об объединении группы в категорию 18 — 30 лет. При этом группа 26—30 лет была исследована независимо.

При предварительном анализе 1—6-й групп видно, что пиковое медианное значение показатель концентрации АМГ для российской популяции достигает в возрастном диапазоне 26—30 лет, начиная прогрессивно снижаться после 35 лет. При этом верхний порог РИ достигает максимума в возрастном диапазоне 31 год—35 лет.

Зависимость концентрации АМГ от возраста представлена на рис. 2.

Как видно, снижение АМГ с возрастом сильно выражено и является статистически достоверным (r_p= –0,42). Следует отметить, что возрастная зависимость не является выраженной до 35 лет (r_p= –0,09), в то время как после 35 лет она является значительной и достоверной (r_p= –0,46). До достижения возраста 30 лет наблюдается статистически незначимая положительная корреляция уровня АМГ с возрастом (r_p=0,066), а после 30 лет — отрицательная значимая корреляция (r_p= –0,43).

С помощью непараметрического критерия Манна—Уитни было определено, насколько уникальным и отличным от общегруппового является показатель медианного значения в каждой из возрастных подгрупп. Было показано, что медианы всех возрастных групп имеют значимые отличия от среднего показателя (табл. 3).

Следует отметить, что у некоторых женщин были выявлены высокие показатели АМГ; наибольшее стандартное отклонение наблюдали в группе 26—30 и 31 год—35 лет. Вероятно, это может быть связано с влиянием на показатели разных индивидуальных характеристик женщин в данном возрастном диапазоне.

Значительная межиндивидуальная вариация может быть обусловлена не только возрастом, но и числом фолликулов, продуцирующих АМГ [10], наличием СПКЯ, менопаузы и генетической предрасположенности. Для определения РИ были исключены женщины, перенесшие операции на яичниках, которые могли бы иметь более низкое значение АМГ, и женщины с множественными фолликулами, уровень АМГ у которых более высокий.

В данном исследовании была отмечена высокая степень корреляции между уровнем АМГ и ЧАФ: для правого яичника r_p=0,64, а для левого — r_p=0,695. Результаты исследования представлены на рис. 3 и

Предыдущие исследования также показали высокую степень корреляции между уровнем АМГ, выполненным автоматическим методом, и ЧАФ (area under curve, AUC=0,85) [25].

В данной работе было продемонстрировано, что в одном и том же возрастном диапазоне в группах, разделенных на основании УЗИ на пациенток с достаточным числом фолликулов и единичными фолликулами, уровень АМГ значительно отличается: среднее значение составляет 2,6 и 1,15 нг/мл соответственно (табл. 4).

Отметим, что при рассмотрении медианных значений основных групп ЧАФ показатель уровня АМГ получается ожидаемым: АМГ возрастает в группах с высоким ЧАФ (табл. 5).

Необходимо отметить, что корреляцию АМГ с возрастом в каждой группе ЧАФ можно рассматривать, но данное сравнение не несет существенной информационной нагрузки в связи с тем, что возраст также имеет высокую степень корреляции с ЧАФ: rp= –0,54 для обоих яичников.

Тем не менее результаты корреляции АМГ с возрастом в каждой группе, определенной согласно ЧАФ, приведены в табл. 6.

Насколько нам известно, данное исследование по установлению РИ для российской популяции является первым. Нами были установлены РИ для 6 групп женщин, разделенных по возрастам, и мужчин в возрастном диапазоне от 18 до 60 лет.

Согласно данным литературы, аналогичное исследование по установлению возрастных РИ было проведено R. Woloszynek и соавт. для бразильской популяции [20]. Результаты сравнения финальных РИ для женщин и мужчин, разработанных для российской популяции, бразильской популяции и инструкции к методу Access AMH, разработанной производителем метода [26], представлены в табл. 7.

Следует отметить, что бразильские исследователи разделили женщин на 3 возрастные категории (18—30, 31 год—40 и 41 год—50 лет). В группе до 30 лет результаты российского исследования оказались несколько ниже, чем бразильского (медиана 3,35 против 3,7; ВП 11,7 против 12,5 соответственно); при этом верхний порог РИ для женщин в возрасте от 18 до 25 лет, приведенный в инструкции к реагенту Access AMH, оказался наиболее высоким.

Показатели медиан и ВП значений АМГ в российской популяции для возрастных групп 26—30 и 31 год—35 лет оказались выше по сравнению с результатами, приведенными в инструкции производителя (медиана 3,38 против 2,27; 2,85 против 1,88; ВП 11,03 против 7,37; 11,61 против 7,35 соответственно). В целом в российской популяции определяются более высокие уровни АМГ во всех возрастных категориях, кроме группы 36—40 лет, где медиана практически совпадает с указанной в инструкции к методу Access AMH. Провести подробное сравнение с бразильским исследованием довольно затруднительно в связи с разными возрастными категориями для РИ; однако можно отметить, что общий тренд является сопоставимым.

У мужчин медиана АМГ для всех возрастов для российской популяции была выше по сравнению с представленной в инструкции к методу. В бразильском исследовании группы были разделены по возрастам, и медианы групп 18—30 и 31 год—40 лет были сопоставимы с российским исследованием; в группе старше 41 года медиана была ниже, что позволяет оценить тренд, однако размер выборки, на наш взгляд, является небольшим для более подробного заключения (см. табл. 7).

Показана ожидаемая высокая степень корреляции возраста и концентрации АМГ, отмечено стремительное убывание АМГ после перехода некоторого порогового значения в районе 35 лет (между 31 и 35 годами). При этом корреляция показателя с возрастом внутри группы 31 год—35 лет значима и составляет –0,23 (внутри других групп таких значимых значений нет, кроме самой последней, включающей в себя довольно обширный возрастной ряд).

Была продемонстрирована выраженная зависимость между уровнем АМГ и ЧАФ. Отмечено значимое различие медиан: 2,6 против 1,15 для пациенток в группах с достаточным и единичным числом фолликулов. Следует отметить, что в нашей выборке уровень менее 1,1 нг/мл определялся у всех женщин старше 46 лет и 7 женщин из 28 в возрасте от 41 года до 45 лет. У 4 из 7 женщин определялось достаточное число фолликулов по УЗИ. В бразильском исследовании [20] у всех женщин старше 40 лет, у 19% в возрасте 18—40 лет уровень АМГ <1,4 нг/мл. В нашем исследовании в выборке женщин до 40 лет уровень АМГ <1,1 наблюдали у 19% женщин, в возрасте до 30 лет — у 4%. Результаты исследования C. Hagen и соавт. показали, что низкий уровень АМГ (0—1,8 нг/мл) у здоровых женщин в возрасте в среднем 25 лет не предсказывал снижения способности к зачатию [6]. Одновременно женщины с высоким уровнем АМГ показывают снижение фертильности, которое может быть связано с присутствием СПКЯ.

В заключение следует отметить, что наличие российских РИ, представленных в данной работе, может помочь лабораториям и врачам клинической практики при оценке характеристик российской популяции относительно уровня АМГ и быть полезным для дальнейших клинических исследований.

Сведения об авторах

Гузов И.И. — https://orcid.org/0000-0002-5628-8758

Печерина Е.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-5974-4942

Ружанская А.В. — https://orcid.org/0000-0002-0889-0066

Козлов В.А. — https://orcid.org/0000-0003-1788-1484

Ласкина О.И. — https://orcid.org/0000-0003-2579-6474

Синтюрина Н.Н. — https://orcid.org/0000-0003-3104-6186

Седышкина Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-8612-4084

Гвоздик Е.Ю. — https://orcid.org/0000-0002-4229-2393

Те С.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-8248-7702

Зенкина А.В. — https://orcid.org/0000-0001-9814-8852

Курганников А.С. — https://orcid.org/0000-0001-7356-7612

Гузов И.И., Печерина Е.Ю., Ружанская А.В., Козлов В.А., Ласкина О.И., Синтюрина Н.Н., Седышкина Е.А., Гвоздик Е.Ю., Те С.А., Зенкина А.В., Курганников А.С. Определение референтных интервалов антимюллерова гормона, специфичных для российской популяции. Лабораторная служба. 2019;8(2):25-35. https://doi.org/10.17116/labs2019802125

Автор, ответственный за переписку: Ружанская Анна Владиславовна — e-mail: aruzhanskaya@beckman.com; тел.: +7(915)021-1332; https://orcid.org/0000-0002-0889-0066

Corresponding author: Ruzhanskaya A.V. — e-mail: aruzhanskaya@beckman.com; tel.: +7(915)021-1332; https://orcid.org/0000-0002-0889-0066