Одной из важных проблем при использовании генно-терапевтических препаратов в медицине является эффективность их доставки в эукариотические клетки [1—3]. Широкое использование вирусных векторов, демонстрирующих высокую эффективность доставки генетических препаратов в клетки, ограничено из-за их сильной иммуногенности и высокой стоимости получения [4, 5]. В качестве альтернативных носителей в настоящее время все чаще используют синтетические поликатионные соединения, липиды и пептиды. Хотя их получение дешевле, чем вирусных векторов, недостатком является низкая эффективность и в ряде случаев высокая токсичность [6—9]. Наиболее безопасным может оказаться использование природных поликатионных белков, а также так называемых проникающих в клетки пептидов (CPP — cell penetration peptide). При образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами такие белки/пептиды обеспечивают прямую трансдукцию в ядра клеток, благодаря наличию в своем составе белоктрансдуцирующих доменов (БТД), которые состоят из 10—30 основных аминокислотных остатков [10—13]. Примерами таких белков могут служить гистоны, естественными функциями которых являются связывание и образование прочного комплекса с молекулами ДНК в клетке. Ранее было показано, что все коровые гистоны (Н2А, Н2 В, Н3, Н4) и линкерный гистон Н1 способны образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами и доставлять их в клетки эукариот [14—17]. Условия, и по-видимому, механизм трансфекции клеток плазмидной ДНК с помощью гистона Н1 сильно отличаются от условий трансфекции с использованием коровых гистонов [15, 16]. Механизм проникновения гистоновых комплексов с ДНК в клетку до конца не изучен, ряд авторов показали, что перенос происходит без образования эндосом, тогда как другие эксперименты указывают на эндосомальный путь [16, 18]. Есть данные о прямом переносе химерных белков гистонов Н2А и Н2 В и зеленого флюоресцентного белка в клетки, который происходит за счет гистоновой составляющей [19]. В описанных ранее работах использовали в основном гистоны, полученные экстракцией и очисткой из тканей животных, в ряде случаев использовали суммарную фракцию гистонов [16, 20]. Однако более технологичным являются получение и использование рекомбинантных гистонов, молекулы которых при необходимости легко модифицировать, вводя те или иные дополнительные аминокислотные последовательности, например фрагмент ТАТ-пептида. Фрагмент регуляторного белка вируса иммунодефицита ВИЧ-1 — ТАТ является в настоящее время наиболее изученным представителем негистоновых СРР [21]. Фрагмент ТАТ-пептида, состоящий из 10—15 аминокислотных остатков, в настоящее время используют при создании комплексов ДНК с поликатионами (полиплексов) и вводят в состав липидных векторов [22, 23]. Показано, что в ряде случаев введение ТАТ-пептида значительно увеличивает эффективность трансфекции. Создание химерных белков гистонов с другими CPP и их использование для доставки генетического материала в клетки ранее не были описаны.

В литературе приводится много способов очистки гистонов, в том числе и рекомбинантных. Все они сводятся к использованию ионообменной хроматографии и ВЭЖХ, или, при наличии в структуре белка полигистидиновой последовательности, аффинной хроматографии на никелевой смоле, в ряде случаев дополнительно используют гель-фильтрацию [24—27]. При использовании гистонов для доставки терапевтических препаратов in vivo важно избавляться от бактериальных эндотоксинов как в препаратах гистонов, так и при очистке плазмидного вектора, что редко учитывается в описанных способах очистки рекомбинантных белков из культуры бактериальных клеток. Для получения препаратов плазмидной ДНК с низким содержанием эндотоксина обычно используют специальные наборы для их выделения, включающие стадию очистки от эндотоксина, например наборы фирмы «Qiagen», США. При очистке рекомбинантных гистонов из бактериальных субстанций следует учитывать сильный положительный заряд этих белков [28]. Гистоны прочно связываются с отрицательно заряженными бактериальными эндотоксинами и разделить такие комплексы весьма сложно. Например, при очистке препаратов гистона Н1 только использование сильных кислот при ВЭЖХ приводило к необходимому уровню чистоты [29].

В данной работе для очистки рекомбинантных гистонов человека Н2А, Н2 В и химерного белка, состоящего из гистона Н2А и ТАТ-пептида (Н2А-ТАТ) перед ионообменной хроматографией, мы использовали стадию обработки препаратов соляной кислотой. Кроме того, лизис клеток проводили в растворе 6 М мочевины, что позволило перевести весь белок в растворимую форму. Предложенная схема очистки (лизис клеток в растворе 6 М мочевины, инкубация лизата клеток в 0,25 М HCl, катионнообменная хроматография и ВЭЖХ) позволила снизить содержание эндотоксина более чем в 100 раз и значительно увеличить выход целевого белка. Было показано, что полученные белки способны образовывать комплексы с плазмидной ДНК, и такие комплексы можно эффективно использовать для трансфекции эукариотических клеток.

Создание экспрессирующих векторов. Экспрессирующие векторы конструировали на основе плазмиды pET-32a (+) (Novagen, США). Фрагменты кДНК, соответствующие открытой рамке считывания гистонов Н2А и Н2 В, амплифицировали с помощью праймеров, содержащих сайты рестрикции Nde I и Hind III (для гистона Н2А — GTTAGCATATGTCGGGACGTGGCAAGC и ACTAAGCTTCTACTTGCCCTTGGCCTTGT, для гистона Н2 В — GTTAGCATATGCCTGATCCAGCTAAGT и CTAAGCTTTTATTTGGAGCTGGTGTACT). В качестве матрицы использовали кДНК из лимфоцитов человека и полимеразу Encyclo («Евроген», Россия). Полученные фрагменты обрабатывали рестриктазами Nde I и Hind III («Thermo Scientific», США), очищали методом электрофореза в агарозном геле и клонировали в экспрессионную плазмиду, гидролизованную теми же эндонуклеазами с помощью лигазы Т4 («Thermo Scientific», США). Для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего слитный химерный белок Н2А-ТАТ, использовали тот же Nde I-праймер, что и при клонировании гистона Н2А (см. выше) и Hind III-праймер, последовательность которого комплементарна последовательности ТАТ-фрагмента и 3’-области гистона Н2А (ACTAAGCTTCTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTACTTGCCCTTGGC CTTGTGG). В качестве матрицы использовали плазмиду Н2А-pET. Полученные конструкции Н2А-pET, Н2В-pET и Н2А-ТАТ-pET, несущие фрагменты генов гистонов Н2А и Н2 В человека и белка H2A-TAT (размерами 393, 390 и 435 пар нуклеотидов соответственно) под контролем раннего промотора фага Т7, секвенировали для исключения ошибок работы полимеразы.

Синтез и очистка белков. Полученными конструкциями трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) («Novagen», США). Синтез рекомбинантных гистонов проводили в среде LB с канамицином (30 мг/мл), для индукции синтеза добавляли изопропил-β, D-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ. Клетки собирали центрифугированием и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора («Cole-Parmer», США). Буфер для лизиса клеток: 50 мМ трис-HCl, pH 7,5; 6 M мочевина; 1 мМ ЭДТА; 0,2 М NaCl; 1 мM PMSF. Для очистки белков использовали хроматографическую систему Biologic LP («Bio-Rad», США). Очистку проводили на хроматографической колонке 200×15 мм («Whatman», Англия) с ионообменным сорбентом SP-Sepharose («GEHealthcare», Швеция), фракционирование белков проводили повышающимся линейным градиентом концентрации соли со скоростью потока 1 мл/мин. ВЭЖХ проводили с использованием колонки Supelco BIO Wide Pore C18, 5 мкм, 15×4,6 мм на HPLC-хроматографе («Pharmacia», Швеция) в градиенте концентрации водного раствора ацетонитрила в 0,1% TFA.

Анализ белков. Электрофорез проводили в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Белки окрашивали красителем Coomassie Brilliant Blue R-250 («Bio-Rad», США). Концентрацию белков определяли по методу Брэдфорда с реактивом Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate («Bio-Rad», США). Концентрацию белков также оценивали, измеряя оптическую плотность при 280 нм. Для расчета концентрации белков использовали коэффициенты экстинкции гистонов Н2А и Н2 В. Содержание бактериальных эндотоксинов определяли с помощью гель-тромб LAL-теста согласно протоколу производителя («Cape Cod Inc.», США).

Тест на задержку ДНК в геле. Для формирования комплексов белка с ДНК 0,2 мкг плазмиды смешивали с разным количеством гистонов в 20 мкл фосфатного буфера («DPBS, Gibco», CША). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляли 6 мкл буфера для нанесения на гель (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 30% глицерина) и проводили электрофоретическое разделение в 0,7% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии бромистого этидия.

Клетки. В работе использовали следующие клеточные линии человека — НТ1080 (фибросаркома), HeLa (аденокарцинома шейки матки), А431 (карцинома кожи), OSA (остеосаркома), A375 (злокачественная меланома кожи), NCI-H1299 (немелкоклеточный рак легких), NCI-H322 (бронхоальвеолярная карцинома), HepG2 (карцинома печени), Calu-1 (карцинома легкого), LUDLU-1 (плоскоклеточный рак легких), PANC-1 (карцинома поджелудочной железы), A549 (карцинома легкого), а также COS7 (клетки почек зеленой мартышки, трансформированные SV40) и линии клеток мыши C26 (химически индуцированная опухоль прямой кишки), LLC (карцинома легких Льюис), M3 (меланома Клаудмана), S37 (саркома), B16F1 (меланома). Клетки получены из коллекций ATCC или ECACC. Клетки человека и зеленой мартышки культивировали при 37 °С и 5% CO₂ в среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина («Invitrogen», США). Клетки мыши культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина.

Трансфекцию клеток проводили в 24-луночных планшетах. За 24 ч до трансфекции рассевали по 100 000 клеток в лунку. В работе использовали плазмидный вектор pCMV-Luc («Promega», США), несущий ген люциферазы Photinus pyralis под контролем раннего промотора цитомегаловируса, концентрация 1 мкг/мл. Трансфекцию с Липофектамином 2000 («Invitrogen», США) проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Для получения комплексов гистон—ДНК смешивали 1 мкг плазмиды с разным количеством гистонов (исходная концентрация гистона2 мкг/мкл), доводили объем до 100 мкл буфером DPBS («Gibco», США), инкубировали 30 мин при комнатной температуре, добавляли 100 мкл среды OPTI-MEM («Invitrogen», США) и переносили смесь в лунки планшета. Инкубировали 3 ч при 37 °C и 5% СO₂, затем трансфекционную смесь заменяли на 0,5 мл соответствующей ростовой среды без антибиотиков. Через 48 ч клетки собирали, лизировали и проводили анализ люциферазной активности с помощью набора Dual-Luciferase Reporter Assay System («Promega», США) согласно протоколу производителя. Для определения эффективности трансфекции использовали плазмидный вектор pEGFP-N1 («Clontech», США), несущий репортерный ген зеленого флюоресцентного белка под контролем раннего промотора цитомегаловируса. Трансфекцию проводили в 6-луночном планшете, аналогично описанному выше. Через 48 ч клетки собирали, промывали фосфатным буфером и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение локализации плазмиды в клетке. Флюоресцентное мечение ДНК плазмиды pGFPN1 проводили с использованием набора реагентов Label IT Tracker™ Intracellular Nucleic Acid Localization Kit («Mirus», США) в соответствии с рекомендациями производителя. После трансфекции клеток линий А431 и НТ1080 с помощью Липофектамина 2000 и гистона Н2А (25:1) клетки промывали. Меченные родамином молекулы ДНК и появление зеленого флюоресцентного белка наблюдали с помощью флюоресцентного микроскопа.

Получение и очистка рекомбинантных гистонов. В ходе работы были получены экспрессионные плазмидные конструкции, несущие последовательности, кодирующие полноразмерные рамки считывания генов гистонов Н2А и Н2 В, а также получена экспрессионная конструкция, кодирующая химерный белок, состоящий из гистона Н2А, слитого с ТАТ-пептидом на С-конце. При клонировании генов гистонов и химерного белка из полилинкера плазмиды pET-32a (+) удаляли фрагмент, кодирующий синтез гексагистидинового пептида, тромбина и энтерокиназы. В результате трансляции получали белки, соответствующие только аминокислотным последовательностям целевых гистонов или химерного белка. Аминокислотные последовательности полученных белков представлены на рис. 1.

Для очистки рекомбинантных гистонов и белка Н2А-ТАТ была разработана методика, позволяющая получить препараты, обедненные бактериальным эндотоксином. При используемых нами условиях индукции синтеза белка (1 мМ IPTG, 3 ч при 37 °С) было показано, что больше половины, но далеко не весь целевой белок оказывается в тельцах включения. Для того чтобы увеличить выход белкового продукта, было предложено разрушать клетки ультразвуком в присутствии 6 М мочевины, при этом практически весь белок переходил в растворимую фракцию. Подобный подход для увеличения выхода и быстрой очистки гистонов был описан ранее [30]. Разрушение комплекса положительно заряженных гистонов с бактериальным эндотоксином требует достаточно жестких условий. В работе по очистке рекомбинантного гистона Н1 от эндотоксина [29] хорошие результаты показало использование сильных кислот. Ранее для очистки коровых гистонов из тканей животных широко использовали метод экстракции гистонов из тканей раствором соляной кислоты [31]. В ходе выполнения данной работы мы использовали стадию обработки осветленного клеточного лизата соляной кислотой. Дальнейшую очистку гистоновых белков проводили с помощью ионообменной хроматографии на SP-сефарозе и ВЭЖХ. В результате была предложена следующая универсальная схема очистки белков H2A, H2B и химерного белка H2A-TAT.

1. После выращивания бактериальные клетки собирали центрифугированием и лизировали ультразвуком в присутствии 6 М мочевины, обломки клеток удаляли центрифугированием.

2. К осветленному лизату добавляли соляную кислоту до конечной концентрации 0,25 М, перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре, осадок удаляли.

3. Раствор нейтрализовали (2 М трис), разводили в 2 раза буфером для нанесения и наносили на ионообменную колонку с SP-сефарозой. Элюцию белка проводили градиентом концентрации хлористого натрия, наибольший выход гистонов наблюдался при концентрации соли 0,5 М.

4. Фракции, содержащие гистон, объединяли, добавляли 1/10 объема ацетонитрила и 1/100 объема TFA (рН образца 5,0—6,5) и наносили на колонку Supelco BIO Wide Pore C18, 5 мкм, 15×4,6 мм. Элюцию белков проводили градиентом водного раствора ацетонитрила от 10 до 80%. Выход целевых белков составлял 20—25 мг из 1 л культуральной среды.

4. Фракции, содержащие гистон, объединяли и высушивали на вакуумной центрифуге.

Сухой белок хранили при температуре –20 ^оС. Чистоту препаратов определяли при помощи денатурирующего гель-электpофоpеза в 15% полиакpиламидном геле c окраской гелей кумаccи R-250 (см. рис. 1). Основная полоса препаратов соответствовала по электрофоретической подвижности целевым белкам, доля примесей составляла не более 10%. Дополнительно был проведен масс-спектрометрический анализ мажорных компонент полученных белковых препаратов после трипсинолиза. Во всех случаях в гидролизатах присутствовали пептидные фрагменты, соответствующие последовательностям целевых белков.

Содержание бактериального эндотоксина в препаратах гистонов, полученных при использовании только ионообменной хроматографии и ВЭЖХ, составляло 80—200 эндотоксиновых единиц (ЭЕ) на 1 мг белка, что значительно превышало нормы для инъекции животным. Добавление к стадии обработки лизата клеток соляной кислоты позволило снизить концентрацию эндотоксинов в конечных препаратах до 1—2,5 ЭЕ/мг белка (допустимая норма содержания эндотоксина при использовании рекомбинантных лекарственных препаратов, установленная Всемирной организацией здравоохранения, ЕС и FDA до 5 ЭЕ/мг) [32, 33].

Таким образом, дополнительная стадия обработки гистоновых белков соляной кислотой позволила снизить содержание бактериального эндотоксина приблизительно в 100 раз. В результате предложенной схемы очистки получали препараты целевых белков, в которых остаточное содержание эндотоксинов позволяло использовать их для экспериментов как in vitro, так и in vivo.

Образование комплексов гистонов с плазмидной ДНК. Результаты экспериментов по торможению вхождения комплексов в агарозный гель показали, что полное связывание гистона H2A и белка H2A-ТАТ с плазмидной ДНК происходит при их весовом соотношении 2:1 (2 мкг белка на 1 мкг плазмиды). Соотношение N/P, где N — количество положительно заряженных групп в образце белка, а P — количество отрицательно заряженных фосфатных остатков ДНК, при этом составляло 1:1. Белки смешивали с ДНК в количествах, которые соответствовали соотношениям N/P 0,5, 1, 2, 3 и 4. В случае гистона H2B полное связывание плазмиды наблюдалось при весовом соотношении белок: плазмида 4:1. На рис. 2 приведены

Использование гистонов для трансфекции (трансдукции) клеток плазмидной ДНК. Способность положительно заряженных белков обеспечивать доставку ДНК в клетки (трансфекцию) изучали в условиях in vitro. Плазмидную ДНК, несущую ген люциферазы светлячка (pCMV-Luc) или ген флюоресцентного белка GFP (pEGFP-N1), смешивали с исследуемыми белками в фосфатно-солевом буфере. Готовили комплексы с разным весовым соотношением белок/плазмида (w/w от 4 до 50, что соответствовало N/P от 5,0 до 25). При весовом соотношении белок: плазмида 4:1, когда по результатам торможения вхождения комплексов в агарозный гель ДНК полностью связывается белком, эффективность трансфекции была низкой. Наибольшая активность люциферазы после трансфекции наблюдалась при соотношении гистон: плазмида 25:1, что соответствовало соотношению N/P 12,5. Мы проводили трансфекцию клеток разного происхождения — 12 линий клеток человека, одной линии клеток зеленой мартышки и 5 линий клеток мыши. Активность люциферазы после трансфекции комплекса плазмиды с гистоном Н2 В в изученных клеточных линиях была низкой. Наибольший уровень активности люциферазы после трансфекции плазмиды pCMV-Luc в комплексе с гистоном Н2А наблюдался в клетках фибросаркомы человека линии НТ1080, однако даже в этом случае он составлял только 10—15% от активности люциферазы после трансфекции плазмиды с помощью липофектамина 2000. Активность люциферазы после трансфекции других линий клеток составляла 5—20% от активности люциферазы после трансфекции клеток линии HT1080. Люциферазная активность при трансфекции клеток линии HT1080 комплексом плазмиды pCMV-Luc с химерным белком Н2А-ТАТ была сравнима с получаемой при использовании гистона H2A (рис. 3).

Определение цитотоксичности с помощью МТТ-теста показало, что использованные белки не приводят к гибели клеток даже при добавлении в концентрациях, в 10 раз превышающих использованные при трансфекции. Длительное (в течение нескольких месяцев) хранение препаратов комплексов белок: плазмида при –20 °С и многократное их замораживание—оттаивание не приводило к снижению эффективности трансфекции.

В проведенных нами экспериментах с использованием меченных тетраметилродамином молекул ДНК было определено, что уровни проникновения плазмидной ДНК в клетки в комплексах с липофектомином 2000 и гистоном Н2А одинаковы в клетках линий А431 и HT1080. Однако наблюдаемый при этом уровень экспрессии белка GFP при трансфекции клеток с помощью липофектомина 2000 был в несколько раз выше, чем в случае использования гистона Н2А, причем уровень трансфекции с помощью гистона Н2А-клеток линии HT1080 был выше в несколько раз, чем клеток линии А431, что подтверждает полученные нами ранее результаты. Значительные различия в экспрессии репортерного белка, по-видимому, не связаны со способностью комплексов белок/ДНК проникать через клеточную мембрану, а вызваны другими причинами, требующими дальнейшего исследования. Возможно, эффективность трансфекции определяется сложностью преодоления ядерной мембраны или зависит от прочности комплекса ДНК с гистоном.

Таким образом, в ходе выполнения работы было продемонстрировано, что рекомбинантные гистоны человека Н2А, Н2 В и химерный белок Н2А-ТАТ обладают трансфицирующей активностью в комплексе с ДНК. В литературе приводятся данные о высокой эффективности разных коровых гистонов. Так, группа Балики [14, 34] показала наиболее высокую трансфекционную активность гистона Н2А, однако в работах группы Вагстаффа [19] приводятся данные о большей эффективности гистона Н2 В. В ряде работ продемонстрирована высокая эффективность использования и других коровых гистонов — Н3 и Н4 [16]. В нашей работе комплекс гистон Н2В—плазмида оказался малоэффективным при трансфекции всех исследованных линий клеток. В то же время высокая эффективность при использовании гистона Н2А наблюдалась только для клеток линии НТ1080 (фибросаркома человека). Уровень трансфекции клеток других линий человека и мыши был значительно ниже как по данным измерения свечения зеленого флюоресцентного белка, так и по результатам измерения уровня люциферазной активности. Пока неясно, с чем связана специфичность трансфекции линии клеток НТ1080. В ранее описанных экспериментах по трансфекции с гистонами эта линия клеток не использовалась и каких-либо указаний на клеточную специфичность ранее не описано. Существуют указания, что использование ТАТ-пептида в составе различных полиплексов и липосом повышает уровень трансфекции плазмидной ДНК в различные клетки [23, 35], но до настоящего времени не имелось данных об использовании химерных белков гистонов и ТАТ-пептида. Полученный нами химерный белок, состоящий из ТАТ-пептида и гистона Н2А, демонстрировал одинаково высокую трансфицирующую активность для ряда исследованных клеток, включая клетки НТ1080. Таким образом, химерный белок не проявляет специфичности в отношении клеток разного происхождения и может использоваться как универсальный трансфицирующий агент.

Хотя во всех изученных нами случаях эффективность трансфекции с использованием рекомбинантных гистонов и химерного белка Н2А-ТАТ была ниже, чем для липофектамина 2000, результаты работы свидетельствуют, что гистоны и их производные могут быть использованы для доставки препаратов в клетки млекопитающих. Использование рекомбинантных гистонов дает широкую возможность их модификаций, что может повысить их трансфицирующую активность, а предложенный способ очистки позволяет получить препараты, пригодные для экспериментов in vivo.

Работа поддержана грантом РФФИ 14−04−04589.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции: Зиновьева Марина Валерьевна (Zinovyeva Marina Valerievna); e-mail: mzinov@mail.ru