В настоящее время госпитальные инфекции представляют собой большую проблему для здравоохранения во всем мире [1—3]. В России доля изолятов грамотрицательных бактерий среди бактериальных возбудителей нозокомиальных инфекций (НИ) в 2013—2014 гг. составила 76,5% [4—6]. В последние 2 десятилетия среди возбудителей НИ отмечается тенденция к увеличению доли множественно лекарственно-устойчивых (МЛУ), экстремально устойчивых (ЭУ) и пан-устойчивых (ПУ) бактерий [7].

Большую роль в мобилизации и распространении генетических детерминант антибиотикорезистентности у бактерий играют мобильные генетические элементы (МГЭ): плазмиды, бактериофаги, транспозоны, IS-элементы [8]. Интегроны — природные системы клонирования и экспрессии мобильных генных кассет, улавливаемых с помощью сайтспецифической рекомбинации, распространяются с помощью МГЭ и играют особую роль, поскольку являются «депо генов антибиотикорезистентности», аккумулирующим эти гены в виде генных кассет [9] и обеспечивающим их экспрессию с сильного интегронного промотора [10]. Интегроны широко распространены в геномах бактерий, выделяемых в разных экологических нишах: в госпитальной среде, в объектах внешней среды, в организмах человека и животных [11—14].

К настоящему времени на основании различий в первичной структуре гена интегразы описаны 5 классов интегронов, наиболее распространенными среди которых являются интегроны классов 1 и 2 [15]. В базе данных GenBank NCBI на дату 14.02.18 представлено 31 078 интегронов класса 1 и 27 624 интегронов класса 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Описано более 130 генных кассет, более 80 наборов генных кассет в интегронах класса 1 и 6 типов наборов генных кассет в интегронах класса 2 [16]. В Российской Федерации также широко распространены интегроны классов 1 и 2 в геномах мультирезистентных штаммов грам-отрицательных бактерий [17—21].

Цель данной работы — детекция и характеристика интегронов классов 1 и 2 в геномах грамотрицательных бактерий, выделенных в Москве и в других регионах РФ в 2003—2015 гг.

Наша лаборатория не имела непосредственного контакта с пациентами лечебных учреждений. Изучаемые штаммы бактерий были получены в ходе сотрудничества с микробиологическими лабораториями ООО «Национальное агентство клинической фармакологии и фармации», Москва; ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург; ФГАУ «Национальный научно-практический центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, Москва; ГБУЗ «Инфекционная клиническая больница № 1 Департамента здравоохранения Москвы». Изучаемые штаммы в своих названиях не содержат персональных данных о пациентах, таких как фамилия, имя, этническая принадлежность, возраст, религия, гендерная принадлежность и др. В соответствии с законодательством Российской Федерации каждый пациент при поступлении в лечебное учреждение подписывал информированное согласие на проведение медицинских процедур и диагностических тестов.

Антибиотикорезистентные клинические штаммы грам-отрицательных бактерий выделены в Москве и других регионах России (n=1248) в 2003—2015 гг., в том числе штаммы семейства Enterobacteriaceae (n=694) и группы неферментирующих грамотрицательных бактерий (n=552). Бактерии культивировали при температуре 37 °C на питательных средах бульон и агар Мюллера—Хинтон («Himedia», Мумбаи, Индия). Видовую идентификацию бактерий проводили на приборах Vitek-2 Compact («Biomerieux», Лион, Франция) и MALDI-TOF Biotyper («Bruker», Карлсруэ, Германия). Бактериальные изоляты хранили в 40% глицерине при температуре –70 °С.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных препаратов: ампициллин (AMP); амоксициллин/клавулановая кислота (AMC); амоксициллин-сульбактам (AMS); цефуроксим (CXM); цефокситин (CEX); цефотаксим (CTX); цефтриаксон (CRO); цефтазидим (CAZ); цефоперазон-сульбактам (CFP); цефепим (FEP); имипенем (IPM); меропенем (MEM); доксициклин (DOC); тигециклин (TGC); ципрофлоксацин (CIP); хлорамфеникол (CHL); гентамицин (GEN); тобрамицин (TOB); амикацин (AMK); триметоприм (TMP); котримоксазол (CTZ); нитрофурантоин (NIT); колистин (CST) определяли на приборе Vitek-2 Сompact (Biomerieux, Лион, Франция). Интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с указаниями Европейского комитета по тестированию антимикробной чувствительности «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 7.1, 2017−03−10» (http://www.eucast.org). В качестве внутренних стандартов использовали чувствительный штамм E. coli ATCC 25922 и высоко-устойчивый штамм E. coli ATCC 35218.

Методом ПЦР со специфичными праймерами опре-деляли гены, кодирующие бета-лактамазы 5 типов: bla_CTX-M [22], bla_TEM [23], bla_SHV [19], bla_OXA [24], bla_VIM [25], bla_NDM [26], а также интегразы класса 1 [27] и класса 2 [28], и наборы кассет интегронов классов 1 и 2 [29]. Состав реакционной смеси и режимы амплификации соответствовали ранее описанным для обозначенных праймеров. В качестве матрицы для амплификации использовали термолизаты [19]. ПЦР проводили в приборах GradientPalmCycler («Corbertt Research», Мортлейк, Австралия) и Терцик («ДНК-Технология», Протвино, Россия) с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации в 1,5% агарозном геле.

Реакцию секвенирования осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 kit («Thermo Fisher Scientific», Уолтем, США) на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (SYNTOL, Москва, Россия).

Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью программ Vector NTI9 («Invitrogen», Уолтем, США), CHROMAS (Technelysium Pty Ltd.; http://technelysium.com.au) и веб-ресурса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Анализ структуры интегронов проводили с помощью веб-ресурса INTEGRAL (http://integrall.bio.ua.pt/?).

Подсчет количества ссылок на интегроны в базе данных GenBank осуществляли на дату 10.03.18, производя поиск по названиям генных кассет в разделе «Nucleotide» веб-ресурса NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

В базе данных GenBank размещены 95 нуклеотидных последовательностей интегронных наборов кассет 22 интегронов класса 1 и 20 нуклеотидных последовательностей интегронных наборов кассет 4 интегронов класса 2 (табл. 1).

Клинические штаммы грамотрицательных бактерий (n=1248), в том числе Pseudomonas aeruginosa (n=320), Klebsiella pneumoniae (n=271), Acinetobacter baumannii (n=232), Escherichia coli (n=191), Enterobacter spp. (n=132), Proteus spp. (n=67), Citrobacter freundii (n=13), Serratia spp. (n=8), Morganella morganii (n=7), Salmonella enterica (n=2), Achromobacter xylosoxidans (n=2), Providencia spp. (n=2), Shigella flexneri (n=1), выделены из дыхательной системы (n=493), мочевыделительной системы (n=379), хирургических ран (n=159), пищеварительного тракта (n=77), крови (n=60), нервной системы (n=28), кожи и слизистых оболочек (n=15) от пациентов многопрофильных стационаров Москвы и других регионов РФ в 2003—2015 гг., а также из госпитальной среды (n=37). Анализ чувствительности к антимикробным препаратам показал преобладание штаммов, устойчивых к бета-лактамам, в том числе к пенициллинам (99% штаммов), цефалоспоринам (95%) и карбапенемам (20%); к аминогликозидам (87%), хлорамфениколу (74%) и сульфаниламидам (72%) (рис. 1, а).

Высокий уровень устойчивости изучаемых штаммов к бета-лактамам — пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемам — ассоциирован с наличием у них генов бета-лактамаз типов bla_TEM (35% штаммов), bla_SHV (25%), bla_CTX-M (38%), bla_OXA (31%), bla_VIM (3%) и bla_NDM (2%) (рис. 2).

В ходе исследования выявлено 842 интегрона, в том числе класса 1 — 737 интегронов (59% штаммов) и класса 2 — 105 интегронов (8% штаммов). При этом интегроны детектированы в 43% штаммов энтеробактерий и в 25% штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий. Наибольшее количество интегронов класса 1 выявлено у E. coli, P. aeruginosa и K. pneumoniae, а интегронов класса 2 — у P. mirabilis (табл. 2).

В ходе исследования выявлено 22 варианта наборов генных кассет в интегронах класса 1 и 4 варианта — в интегронах класса 2 (рис. 3).

В клиническом штамме E. coli I-7433, выделенном из мочи пациента в стационаре Москвы в 2014 г., идентифицирован новый интегрон класса 1, которому в базе данных INTEGRAL присвоен номер In1249. Секвенирование вариабельной части этого интегрона выявило наличие 3 генных кассет (dfrA12s-orfF-aadA2), причем генная кассета dfrA12s [GenBank KT316808] является новым аллелем гена, кодирующего дигидрофолат-редуктазу, которая обеспечивает устойчивость к триметоприму. Анализ первичной структуры гена показал наличие значимой нуклеотидной замены Т305-С, которая привела к аминокислотной замене Val102-Ala в составе кодируемого фермента.

В клиническом штамме S. flexneri Y-5, выделенном во время вспышки дизентерии в Якутске в 2010 г., идентифицирован новый интегрон класса 2, в котором структура генной кассеты dfrA1 нарушена вставкой последовательности IS911 (1256 п.н.). Данная структура генетической кассеты (dfrA1-IS911-sat1-aadA1) не была описана ранее и депонирована нами в базе GenBank под номером HM592262. Уникальность структуры и присутствие во всех изолятах S. flexneri, выделенных при вспышке дизентерии, позволили использовать интегрон класса 2 в качестве молекулярно-генетического маркера для эпидемиологического анализа и сделать вывод о клональности данной вспышки.

В ходе исследования идентифицированы генные кассеты 31 типа. Анализ представленности этих типов кассет в базе данных GenBank показал, что более распространенными у бактерий на дату 10.03.18 являлись генные кассеты aadB, aacA4, aacC1, aadA1, aadA2, aadA5, blaVIM-2, dfrA1, dfrA7, dfrA12, orfC, orfE, orfY и sat1, а менее распространенными — aacA1, aadA6, aadA7, blaPSE1, dfrB4, ereA2, smr2 и dfrA12s (табл. 3).

Интегроны классов 1 и 2 являются важным молекулярно-генетическим механизмом формирования фенотипа МЛУ у грамотрицательных бактерий, выделенных от пациентов и из госпитальной среды многопрофильных стационаров Москвы и других регионов Российской Федерации в 2003—2015 гг. В ходе исследования подтверждена общепризнанная роль интегронов в качестве своеобразного «депо» генетических детерминант антибиотикоустойчивости и «резерва» для создания новых комбинаций генных кассет. Описанные новые модификации генных кассет (dfrA12s и dfrA1-IS911) могут служить полезными молекулярно-генетическими маркерами для отслеживания распространенности кассет, эволюции наборов генных кассет и при эпидемиологическом анализе. Проведенный анализ генных кассет на основании представленности в базе данных GenBank и идентифицированных в ходе исследования указывает на широкую распространенность интегронов классов 1 и 2 в геномах клинических штаммов бактерий, выделенных в разных регионах мира.

Авторы благодарны за предоставленные для исследования клинические штаммы бактерий к.б.н. А.Н. Круглову, с.н.с. (ООО «НАКФФ», Москва), д.б.н., проф. С.В. Сидоренко (ФГБУ «ДНКЦ ИБ ФМБА», Санкт-Петербург), д.м.н., доценту О.Н. Ершовой (ФГАУ «ННПЦН им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, Москва), к.м.н. В.Е. Маликову (ГБУЗ «ИКБ № 1 ДЗМ»).

Работа выполнена в рамках Федеральной темы НИР 049 Роспотребнадзора «Мониторинг и изучение свойств возбудителей пищевых и госпитальных инфекций, разработка средств их диагностики» (2016—2020 гг.).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Для корреспонденции: Кузина Екатерина Сергеевна, аспирант ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Оболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: e.leonova@mail.ru