Вирус гепатита, А (ВГА) является представителем рода Hepatovirus, семейства Picornaviridae и вызывает гепатит, А у людей и некоторых приматов. Вирионы ВГА представляют собой сферические частицы 27—32 нм в диаметре. Одноцепочечная молекула РНК положительной полярности упакована в капсид, формируемый структурными белками VP1, VP2, VP3, VP4. Кристаллическая структура вирусной частицы ВГА была определена ранее [1]. Неструктурные белки 2А, 2 В, 2С, 3А, 3С^pro и 3D^pol являются функциональными в процессе репликации вирусного потомства.

К настоящему времени расшифровано 111 полных и около 7000 частичных геномов ВГА, которые были изолированы при вспышках гепатита А, а также получены в процессе адаптации вируса к репликации в клеточных культурах. Самые ранние пробы, в которых была обнаружена РНК ВГА, датируются 1957 г. [2]. На момент написания данной статьи были известны полные геномы только двух российских штаммов ВГА — МВ-7/4647 (EU251188) и представленного здесь MB-7/293 (HQ437707) [3].

Продуцентами для вакцин против гепатита, А «Avaxim», «Havrix» и «Vaqta» являются штаммы ВГА, для культивирования которых используются клетки Medical Research Council 5 (диплоидные клетки легкого человека). Производимая в России вакцина Геп-А-ин-Вак основана на штамме ВГА HAS-15, культивируемом в клетках 4647 (клетки почки зеленой мартышки). Штаммы ВГА, используемые в производстве вакцин, в силу их репликативных свойств требуют длительной инкубации инфицированных клеточных культур (24—28 сут). Это существенно осложняет технологический процесс и приводит к его удорожанию. Описаны относительно быстрорастущие штаммы ВГА: FG, HM175/43C и HM175/24A, которые приобрели быстрые репликативные свойства после адаптации к культуре клеток FRhK (клетки почки эмбриона макаки-резус) [4—6]).

В 1988 г. во время вспышки гепатита, А в Новосибирске (Сибирский федеральный округ, Россия) от больного был выделен изолят ВГА, который после адаптации к клеточной культуре FRhK, проявил быстрые репликативные свойства и получил название «штамм MB-7» [7]. В дальнейшем путем длительного пассирования штамма MB-7 в культуре клеток 4647 был получен штамм МВ-7/4647 (VBA-07), сохранивший способность к быстрому росту. Полная последовательность генома штамма МВ-7/4647 была определена и проанализирована в работе [3].

В представленной работе приведены результаты исследования репликативных свойств полученного методом биоселекции нового быстрорастущего штамма ВГА MB-7/293 (адаптированный к культуре клеток НЕК293 вариант штамма МВ-7/4647) и рассмотрены особенности его генома в сравнении с родительским штаммом МВ-7/4647 и другими быстрорастущими штаммами ВГА. Идентичность антигенных свойств штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 была подтверждена нами ранее [8]. Штамм MB-7/293 рекомендуется для использования в производстве экономически выгодных иммунопрофилактических и диагностических препаратов.

Клеточные культуры и вирусы. В исследовании использовали культуры клеток 4647 (клетки почки зеленой мартышки) и HEK293 (клетки почки эмбриона человека, экспрессирующие гены Е1А и Е1 В аденовируса 5-го серотипа), полученные из банка клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Клетки культивировали в среде Игла ДМЕМ (GibcoBRL), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭСТ) (GibcoBRL), 2 мМ L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина сульфата при 37 °C в культуральных пластиковых флаконах («Costar», США). Для снятия клеток с субстрата применяли 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Культивирование и определение инфекционной активности in vitro штамма МВ-7/4647 проводили согласно [3]. Адаптацию штамма МВ-7/4647 к культуре клеток НЕК293 проводили методом биоселекции как описано в [8]. Полученный в результате адаптации штамма МВ-7/4647 к культуре клеток НЕК293, штамм MB-7/293 (ГепА-293) был подвергнут двум циклам клонирования методом предельных разведений, после чего были получены препаративные количества клонированного вируса. Препарат вируссодержащей суспензии клонированного штамма MB-7/293 с инфекционным титром 10⁹ ИД₅₀/мл (50% инфицирующая доза/мл) и содержащий ВГА-специфический антиген в титре 1:5120 был помещен на хранение при минус 70 °C.

Сравнительное исследование кинетики накопления инфекционного вируса и вирусного антигена в клетках НЕК293 и 4647 инфицированных штаммами МВ-7/4647 и MB-7/293. Клетки НЕК293 и 4647 культивировали как монослойные культуры в культуральных флаконах 25 см² («Orange», США). Посадочная доза клеток НЕК293 и 4647 составляла 10⁶ клеток на флакон. При достижении культурами субконфлюентного состояния (70—80% от монослоя) проводили инфицирование штаммами МВ-7/4647 или MB-7/293 с множественностью 1,0 ИД₅₀ на клетку. После адсорбции (1,5 ч при 37 °С) клетки отмывали, добавляли свежую культуральную среду и инкубировали при 37 °C. Клетки отбирали на 0-е сутки (инокулированные и сразу же отмытые клетки) и далее на 4, 5, 6, 7, 10, 12 и 14-е сутки после инфицирования для количественного определения содержания антигена ВГА и инфекционного вируса (клетки из каждого флакона снимали с субстрата раствором Версена, ресуспендировали в 1 мл среды Игла ДMЕМ, трехкратно замораживали—оттаивали, клеточные лизаты осветляли центрифугированием и полученные супернатанты анализировали). Титр вирусспецифического антигена определяли иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием тест-системы Вектогеп А-а/г-стрип (ЗАО «ВекторБиАльгам», Новосибирск) согласно инструкции по применению. Инфекционный титр вируса штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 определяли микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах («Orange scientific», США). С этой целью клетки 4647 высаживали на планшет в среде Игла ДMЕМ с 5% ЭСТ (20 тыс. кл./лунка в объеме 150 мкл на лунку) и инкубировали при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Через сутки из лунок отбирали культуральную среду и проводили инфицирование клеток стандартными десятикратными разведениями тестируемых вируссодержащих суспензий в объеме 50 мкл на лунку (по 4 лунки на разведение). После адсорбции (1,5 ч при 37 °С) клетки отмывали, добавляли по 150 мкл среды Игла ДMЕМ с 5% ЭСТ на лунку и инкубировали в течение 10 сут. Учет результатов проводили по выявлению антигена ВГА в лизатах клеток (после трехкратного замораживания—оттаивания), отобранных из каждой лунки планшета для титрования методом ИФА («Вектогеп А-а/г-стрип»). Значение титра вируса выражали через ИД₅₀.

Определение и анализ геномной РНК штамма MB-7/293. Выделение вирусной РНК и синтез кДНК проводили cогласно [3]. Реакцию РНК-лигирования проводили в 50 мкл реакционной смеси следующего состава: 5 мкг РНК, 2 мкл ингибитора рибонуклеаз RNAsin («Promega», США) 50 ед. активности и 1 мкл РНК-лигазы 1 фага Т4 («New England Biolabs», Англия) 20 ед. активности в прилагаемом реакционном буфере. Реакционную смесь инкубировали 45 мин при 37 °C. Полученный препарат РНК осаждали стандартным образом. Затем проводили синтез кДНК с праймера 811—780 (табл. 1).

Вторичную структуру 5’-нетранслируемых областей (5’-НТО) РНК рассчитывали с помощью программы Gene Bee service (http://www.genebee.msu.su/). Расчет профилей гидрофобности белков осуществляли методом Kyte и Doolittle (https://web.expasy.org/).

3D-структуры были рассчитаны на платформе SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) и представлены в программе Pymol (https://pymol.org/).

Сравнительное исследование репликативных свойств штаммов MB-7/293 и МВ-7/4647 in vitro. Результаты определения кинетики накопления инфекционного ВГА и вирусспецифического антигена в культурах клеток НЕК293 и 4647, инфицированных в идентичных условиях штаммами MB-7/293 и МВ-7/4647, представлены на рис. 1.

Для сравнения продуктивности штаммов MB-7/293 и MB-7/4647 в идентичных условиях проводили инфицирование культур клеток НЕК293 и 4647, соответственно (культуральные флаконы 175 см², множественность заражения 1 ИД₅₀/кл). Инфицированные клетки отбирали в сроки, когда концентрация вирусспецифического антигена достигала максимального значения на соответствующей культуре (клетки НЕК293, инфицированные штаммом MB-7/293, через 6 сут после заражения; клетки 4647, зараженные штаммом MB-7/4647, через 12 сут). В полученных клеточных лизатах (клетки ресуспендировали в 1 мл среды и подвергали трехкратному замораживанию—оттаиванию) определяли титры вирусспецифического антигена и инфекционные титры. Титры антигена ВГА в клетках НЕК293 и 4647, инфицированных штаммами MB-7/293 и MB-7/4647, составили 1:2560 и 1:640 соответственно, инфекционные титры 8,8±0,4 Lg ИД₅₀/мл и 7,0±0,4 Lg ИД₅₀/мл соответственно. Таким образом, штамм MB-7/293 при культивировании на культуре клеток НЕК293 значительно превосходил родительский штамм MB-7/4647, культивированный на клетках 4647, как по продуктивности (количеству инфекционного вируса и вирусспецифического антигена), так и по кинетике накопления антигена ВГА.

Сравнительный анализ последовательностей геномов штамма MB-7/293 с родительским MB-7/4647 и другими быстрорастущими штаммами ВГА. Нуклеотидная последовательность генома штамма МВ-7/293 с 84-го нуклеотида (н.) по 7450-й н. была определена путем секвенирования перекрывающихся последовательностей ПЦР-фрагментов, полученных с помощью специфических праймеров (см. табл. 1).

Данные о геномах ВГА часто не содержат информации о первых 5’-концевых нуклеотидах нетранслируемой области. Для определения 5’-НТО нами была осуществлена сшивка концов геномной РНК с помощью РНК-лигазы. Посредством обратной транскрипции со специфического праймера была получена кДНК, после чего был амплифицирован фрагмент со 126-го по 1-й н., сшитый с 7055-го по 6832-й н. При последующем секвенировании была определена последовательность первых 83 н. 5’-НТО.

Полная последовательность генома штамма MB-7/293 была депонирована в GenBank под номером HQ437707. Филогенетический анализ полной нуклеотидной последовательности генома штамма МВ-7/293 позволил отнести его к IA генотипу, как и МВ-7/4647 [3]. Гомология геномов штамма МВ-7/293 с исходным МВ-7/4647 составила 99,7%. Рекомбинационных явлений в геноме МВ-7/293 не было выявлено.

В последовательности генома штамма MB-7/293 в сравнении со штаммом MB-7/4647 идентифицировано 3 нуклео-тидные замены в 5’-НТО и 20 в транслируемой области, которые приводили к заменам десяти аминокислотных остатков (а.о.) в белках VP3, VP1, 2 В и 2С (табл. 2).

Обнаруженные в 5’-НТО замены в 13-м (С→U) и 21-м (G→A) нуклеотидах приводят к увеличению петли с 5 до 7 н. в расчетной вторичной структуре РНК, что, возможно, приводило к стабилизации петли в результате снижения внутреннего сопротивления и могло сказаться на эффективности репликации. Мутация U→G в 702 н. в районе IRES (internal ribosome entry site) приводит к изменению энергетической выгодности связи шпильки-стебля с 22,1 до 22,5 ккал/мол.

У штамма МВ-7/293, так же как у штамма МВ-7/4647 и двух быстрорастущих штаммов HM175/43C (M59809), HM175/24A (M59810), в отличие от штамма HAS-15 (JQ425480) и других штаммов ВГА, не обладающих быстрорастущим фенотипом, присутствует вставка из 13 н. в 5’-НТО. Эти 13 н. (149-GTAAATATTGATT-161) являются повтором и находятся в самом начале IRES.

Выявленные особенности в IRES могут вызывать изменения трансляционной активности вируса ввиду того, что IRES обеспечивает связывание мРНК ВГА с рибосомой для трансляции [10]. Ранее было показано, что мутации в IRES играют важную роль в изменении клеточного тропизма у пикорнавирусов [11].

Сравнительный анализ транслируемой области геномов штаммов МВ-7/4647 и МВ-7/293 показал, что найденные отличия приводят к заменам а.о. в структурных белках VP3 (1) и VP1 (1) и в неструктурных 2 В (5) и 2С (3) (см. табл. 2).

На рис. 2 приведена

При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей со штаммом HAS-15 и рядом других штаммов у штаммов МВ-7/4647 и МВ-7/293 была выявлена замена в 72 а.о. белка VP3, Asp (316) →His. Интересно, что в той же самой позиции у ранее описанных быстрорастущих вариантов ВГА HM175/43C и HM175/24A была идентифицирована замена Asp (316)→ Ala. Этот а.о. также экспонирован на поверхности вириона (данные не показаны). Следует отметить, что 72 а. о. VP3 входит в состав эпитопа, ответственного за взаимодействие с клеточным рецептором [12].

Идентифицированная замена в белке VP1 (95 а.о. Leu (586)→Mеt) у штамма МБ-7/293 уникальна среди описанных штаммов ВГА и локализуется в ранее выявленном иммунодоминантном районе [13]. На рис. 2 (выделено черными шарами) проиллюстрировано расположение этого а.о. на месте стыковки белков VP1 из пяти разных протомеров в области вершины икосаэдра у оси 5-го порядка, где эти а.о. формируют небольшое углубление. Интересно, что это место стыковки белков VP1 из разных протомеров было нами замечено при замещении а.о. у штамма МБ-7/293, адаптированного к линии клеток человеческого происхождения — HEK293, после родителя МБ-7/4647, адаптированного к клеткам почки зеленой мартышки — 4647, т. е. при смене хозяина.

Непонятными являются причина и последствия появления делеции в N-концевой части белка VP1 ВГА. Делеция 6 а.о. в белке VP1 (517Thr-Thr-Met-Arg-Asp-Leu522) была обнаружена у быстрорастущих штаммов GBM/FRhK и FG ([9], [5]). Ранее в работе B. Robertson и соавт. высказывалось предположение, что появление данной делеции, обусловлено пассированием ВГА на культуре клеток FRhK [14]. Поскольку не несущие этой делеции быстрорастущие штаммы МB-7/293, МБ-7/4647, HM175/43C и HM175/24А имеют пассажную историю культивирования на клетках FRhK, это предположение представляется сомнительным.

Все известные быстрорастущие штаммы ВГА приобрели способность к быстрому росту после их первичной адаптации к клеткам FRhK, что, возможно, связано с эволюционной адаптацией вируса к специфическому кругу хозяев.

Следует отметить, что наибольшее число замен было выявлено в неструктурных белках 2 В (5) и 2С (3), что согласуется с данными литературы о значительной изменчивости этих белков при адаптации к клеточным культурам [15]. Было показано, что белки 2 В и 2С отвечают за взаимодействие с мембранными структурами клеток при формировании репликативного комплекса [16, 17]. Белок 2 В влияет на транспорт белков хозяина и опосредованно на синтез интерферона, подавляя иммунный ответ [18, 19].

Стоит особо отметить замену в белке 2 В, Lys (839)→ Asn, у штамма МБ-7/293 рядом с сайтом протеолиза 2А/2B (Gln837/Ala838), которая присутствует у других быстрорастущих штаммов HM175/43C и HM175/24A и предположительно может влиять на скорость созревания этих белков и изменение репликативной активности вируса. Остальные мутации в неструктурных белках были штамм-специфическими и не совпадали с известными заменами в геномах штаммов, адаптированных к клеточным культурам.

Белок 2 В имеет альфа-спиральный трансмембранный домен, позволяющий ему заякориваться в мембране эндоплазматического ретикулума клетки-хозяина. Методом рентгеноструктурного анализа установлена структура цитоплазматической части белка 2 В [17]. Аминокислотные замены 10-го а.о., Glu (847)→Asp, и 24-го а.о., Asp (861)→ Asn, имеющиеся в белке 2 В штамма МБ-7/293, локализованы на концах бета-структур β1 и β3, описанные в работе [17]. Поэтому они могут оказывать влияние на стабильность шпильки β2—β3 и взаимодействие мономеров белка 2 В между собой. Анализ гидрофобности белкового профиля выявил, что в белке 2 В штамма МВ-7/293 в отличие от штамма МВ-7/4647 произошло повышение гидрофобности на участке 839—847 а.о. (N-конец белка) за счет мутаций 2-го а.о., Lys (839)→Asn, 7-го а.о., Tyr (844)→ Cys, и 10-го а.о., Glu (847)→Asp. Таким образом, можно предположить значимость выявленных мутаций для взаимодействия мономеров белков 2 В между собой и их функционирования.

В белке 2С (РНК-хеликаза) было выявлено повышение гидрофобности на N-концевых участках 1087—1090 а.о. за счет мутации 4-го а.о., Asn (1089)→Tyr, и снижение гидрофильности 1101—1109 а.о. за счет мутации 18-го а.о., Ser (1105)→Asn, а также снижение гидрофобности на участке 1127—1135 а.о. за счет мутации 44-го а.о., Val (1131)→Ile. Данные рентгеноструктурного анализа для этого белка пока отсутствуют. Замены, произошедшие в N-конце белка 2С, экспонированном на поверхности белка, вероятно, важны в белковых взаимодействиях.

При анализе полноразмерной геномной РНК было установлено, что геном штамма MB-7/293 отличается от MB-7/4647 тремя нуклеотидными заменами в 5’-НТО и двадцатью в кодирующей области, которые приводят к заменам десяти а.о. в белках VP3, VP1, 2 В и 2С. Сравнительный анализ штаммов MB-7/293 и MB-7/4647 с другими штаммами ВГА, включая ранее описанные быстрорастущие штаммы, позволил выдвинуть следующие наиболее вероятные причины влияния выявленных мутаций на репродуктивные свойства вируса: 1) замены в 13-м и 21-м н. в 5’-НТО приводили к стабилизации РНК-петли, что может сказаться на эффективности репликации; 2) присутствие вставки-повтора из 13 н. (149—161) в районе начала IRES и мутация в 702-м н. в IRES, что может повлиять на трансляционную активность; 3) замена в 72-м а.о. белка VP3 Asp (316)→His, которая может влиять на скорость и прочность связывания этого белка с клеточным рецептором; 4) замена в белке 2 В, Lys (839)→Asn, у штамма МБ-7/293 рядом с сайтом протеолиза 2А/2B, которая может влиять на скорость созревания этих белков и изменение репликативной активности вируса.

Таким образом, в результате проведенной адаптации штамма ВГА MB-7/4647 к клеточной культуре НЕК293 получен и охарактеризован быстрорастущий штамм MB-7/293 (ГeпA-293), существенно превосходящий родительский штамм по продуктивности при культивировании in vitro, перспективный для использования в производстве экономически выгодных иммунопрофилактических и диа-гностических препаратов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Сведения об авторах:

Сведения об авторах

Бондаренко Татьяна Юрьевна [Bondarenko Tatyana Yurievna], к.б.н., научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; e-mail: lemtat@ngs.ru; https://orcid.org/0000-0002-0346-7736

Терновой Владимир Александрович [Ternovoi Vladimir Aleksandrovich], канд. биол. наук, зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии ООИ, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0003-1275-171X

Святченко Виктор Александрович [Svyatchenko Victor Aleksandrovich], к.б.н., зав. лабораторией вирусологии флавивирусов, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0002-2729-0592

Киселев Николай Николаевич [Kiselev Nikolai Nikolaevich], старший научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0002-9737-9130

Швалов Александр Николаевич [Shvalov Aleksandr Nikolaevich], канд. ф.-м.н., с.н.с. отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора, 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0001-6890-1575

Куслий Александр Георгиевич [Kusliy Aleksandr Georgievich], канд. биол. наук, директор по качеству ЗАО «ВекторБиАльгам», 630559, р.п. Кольцово, Новосибирская область, Россия; https://orcid.org/0000-0002-0732-9314

Нетесов Сергей Викторович [Netesov Sergei Viktorovich], член-корреспондент РАН, д-р биол. наук, зав. лабораторией бионанотехнологии, микробиологии и вирусологии Факультета естественных наук Новосибирского государственного университета, 630090, Новосибирск, Россия; https://orcid.org/0000-0002-7786-2464.

Для корреспонденции: Бондаренко Татьяна Юрьевна, канд. биол. наук, научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Роспотребнадзора; e-mail: lemtat@ngs.ru