Анализ иммуномодулирующих белков вируса африканской чумы свиней

Авторы:
  • М. В. Нефедьева
    ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», 601125, пгт. Вольгинский, Владимирская область, Россия
  • И. А. Титов
    ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», 601125, пгт. Вольгинский, Владимирская область, Россия
  • К. А. Мима
    ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», 601125, пгт. Вольгинский, Владимирская область, Россия
  • А. С. Малоголовкин
    ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», 601125, пгт. Вольгинский, Владимирская область, Россия
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(1): 42-48
Просмотрено: 644 Скачано: 185

Введение

Африканская чума свиней (АЧС) — геморрагическая смертельная болезнь домашних свиней и кабанов, вызванная сложным оболочечным дезоксивирусом семейства Asfarviridae. Смертность в инфицированных стадах достигает 100%. Заболевание передается от больных животных и вирусоносителей алиментарным, контактным путем и трансплацентарно [1]. Геном вируса АЧС представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК с ковалентно закрытыми концами и терминальными инвертированными повторами (TIR) [2].

К вирусу АЧС восприимчивы домашние свиньи всех возрастных групп и пород и кабаны. Среди африканских представителей семейства Suidae, дикие африканские и кустарниковые свиньи, бородавочники, могут быть инфицированы вирусом АЧС, но при этом не проявлять клинических признаков. Основным резервуаром вируса в дикой природе в странах Восточной Африки являются мягкие клещи рода Ornithodoros [3].

В зависимости от штамма вируса, вирулентности и способа заражения, наблюдаемые клинические признаки разнообразны в сверхострой, острой, подострой и хронической формах инфекции [4]. Эпидемиология АЧС является весьма сложной и варьирует в зависимости от географических особенностей местности и восприимчивых видов животных (кабан, домашние свиньи, клещи) [3].

Эффективных средств защиты против вируса АЧС до настоящего времени не разработано. Исторические попытки защитить животных инактивированными вакцинами либо потерпели неудачу, либо дали противоречивые результаты. Исследования с использованием аттенуированных вакцин продемонстрировали их потенциал для защиты свиней от экспериментальной инфекции гомологичным вирулентным вирусом, но редко, против гетерологичных вирусов [5—7]. Изучение антигенного разнообразия среди встречающихся в природе изолятов вируса АЧС представляет огромный интерес для разработки вакцин [8].

Недавние исследования указывают, что генетическое разнообразие вируса, определенное путем секвенирования основного белка капсида p72 (ген B646L), самое высокое в Центральной и Восточной Африке [3]. Высокий уровень генетической вариабельности вируса АЧС между различными изолятами объясняется разницей в размере генома, однако большая часть генетической вариации обусловлена изменениями числа и последовательности членов мультигенных семейств (MGF), расположенных на обоих концах генома, где они ограничивают левую и правую вариабельные области (LVR и RVR, соответственно) [9].

Геном вируса АЧС содержит набор генов, кодирующих протеины ответственные за механизмы иммунной эвазии. Диапазон модуляционной активности вирусных протеинов весьма разнообразен и включает в себя: ингибирование гуморального ответа, интерференцию с интерферонами, ингибирование цитокинов и хемокинов, уклонение от цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) и природных клеток-киллеров (NKs), и управление функцией главного комплекса гистосовместимости (MHC I и II), изменение эффекторной функции дендритных клеток и ингибирование апоптоза [10].

Вирус АЧС является макрофаготропным вирусом и может манипулировать как врожденным, так и адаптивным иммунным ответом, модулируя функции макрофагов. Согласно L. Dixon и соавт., было идентифицировано несколько белков вируса АЧС, которые препятствуют развитию иммунной защиты хозяина [11]. К ним относятся ген A238L, кодирующий белок 5el, который выступает ингибитором активации транскрипции иммуномодулирующих генов хозяина, белок k11l (ген I329L), действующий как ингибитор сигнальных путей Toll-подобных рецепторов и белок i14l (ген DP71L), сходный с ICP34.5 фактором нейровирулентности герпесвируса, регулирующий фосфатазную активность клетки-хозяина при инфицировании, вытесняя ингибирующие субстраты из фосфатазы хозяина PP1 и определяющий круг чувствительных хозяев [12—14]. Кроме того, A238L ингибирует зависимые от кальценейрина пути хозяина путем непосредственного связывания кальценейрин фосфатазы [14].

Однако не все известные изоляты вируса АЧС обладают одинаковой иммуномодулирующей активностью [15]. Генетические предпосылки данных различий остаются невыясненными. Таким образом, обнаружение генетических маркеров эволюционной изменчивости в иммуномодулирующих белках вируса АЧС позволит изучить механизмы иммунного уклонения при АЧС.

Цель исследования — провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС, участвующих в иммунном уклонении.

Материал и методы

На первом этапе проведен анализ вариабельности белков 5el, k11l и i14l при помощи веб-сервиса Protein Variability Server методом Симпсона (http://www.expasy.org/proteomics) [16]. Вариабельными считались области, для которых полученные значения превышали пороговое (0,46). Для предсказания наличия и расположения сайтов расщепления сигнального пептида в аминокислотных последовательностях использовали веб-сервер SignalP 4.1. (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1) [17]. Веб-приложение CCTOP (Constrained Consensus TOPology prediction server) обеспечило прогнозирование трансмембранной топологии белков (http://cctop.enzim.ttk.mta.hu) [18].

На следующем этапе работы из Государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ ФИЦВиМ были отобраны 12 изолятов, выделенные из разных регионов Российской Федерации в 2016 г., и 15 штаммов, принадлежащих к различным генотипам [19, 20] и сероиммунотипам вируса АЧС [21]. Для каждого сероиммунотипа использовали аттенуированный и вирулентный штаммы вируса АЧС, указанные в таблице.

Штаммы вирусов АЧС, использованные в работе

Подбор праймеров для амплификации копий генов A238L, I329L и DP71L осуществляли с помощью сравнения и анализа нуклеотидных последовательностей этих генов штаммов и различных изолятов вируса АЧС, опубликованных в международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) с помощью программ BioEdit 7.0.1, Oligo 6.0. и веб-сервера IDT DNA (https://eu.idtdna.com/site).

Выделение ДНК из крови и суспензии органов проводили набором ДНК-сорб-B («Интерлабсервис», Россия), в соответствии с инструкцией производителя. Для оптимизации температурных режимов ПЦР и амплификации последовательностей генов использовали термоциклер T100 («Bio-Rad Laboratories», США).

Анализ продуктов реакции осуществляли при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле и учитывали на ChemiDoc MP («Bio-Rad Laboratories», США) путем обнаружения специфических полос в треках с исследуемыми образцами относительно фрагмента маркера молекулярного веса и расчетного значения длины ПЦР-продукта. Очистку ПЦР-продуктов из агарозного геля осуществляли коммерческим набором QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) и Cleanup-standard («Евроген», Россия). Сиквенсовую реакцию проводили набором Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», США). Для проведения секвенирования использовали секвенатор Genetic Analyzer 3130 («Applied Biosystems», США).

Множественное выравнивание последовательностей генов вируса АЧС выполнено с помощью вариантов метода ClustalW и MUSCLE [22]. Для построения филогенетических древ применяли метод максимального правдоподобия с дополнительным бутстрэп-анализом 1000 случайных выборок с использованием программы Mega 6.0 [23].

Для анализа синонимичных (синонимичная дистанция, dS) и несинонимичных замен (несинонимичная дистанция, dN) на сайт в генах A238L, I329L и DP71L, а также числа потенциально синонимичных и несинонимичных сайтов для каждого кодона на основании гипотезы о равных частотах всех нуклеотидных замен использовали пакет программы SNAP (Synonymous Non-synonymous Analysis Program) (www.hiv.lanl.gov).

Результаты и обсуждение

Результаты анализа вариабельности белков 5el, i14l и k11l различных штаммов вируса АЧС показали, что у белка 5el наблюдается 13 вариабельных сайтов, часть из которых располагается в участке IκB — подобного домена, состоящего из 3 повторов анкиринов (с 87 по 178 аминокислоту) и на С-терминальном конце мотива PxIxITxC/S, который связывает каталитическую субъединицу кальценейрина — серинтреонин фосфатазу (с 200 по 213 аминокислоту) (рис. 1).

Рис. 1. Результаты анализа вариабельности белков 5el — IkB гомолога и ингибитора кальций нейрин фосфатазы; i14l — белка, сходного с HSV ICP34.5 фактором нейровирулентности; k11l — белка ингибитора передачи сигналов TLR.
Повторяющиеся белки анкирины, хотя и отсутствуют в большинстве вирусов, но также распространены и среди поксвирусов. Консервативные аминокислотные остатки анкиринов имеют решающее значение для фолдинга и стабильности белка, а также участвуют в присоединении других белков к разным участкам клеточной мембраны [24].

Анализ белка I14L показывает, что этот белок консервативен среди различных штаммов вируса АЧС, однако имеет 7 вариабельных сайтов. Все белки, кодируемые этим геном, содержат центральную область с высококонсервативным 56 аминокислотным доменом и мотивом PP1c_bdg (с 7 по 57 аминокислоту в короткой форме и со 123 по 170 аминокислоту в длинной форме) регуляторных субъединиц (15A и 15B) белковой фосфатазы 1, расположенных на карбоксильном конце, общих для MyD116 и ICP34.5. Этот консервативный С-конец, по-видимому, является связующей областью каталитической субъединицы протеинфосфатазы-1 (PP1C), которая обнаружена как в вирусе простого герпеса, так и у мышей и человека [25].

Высокогликозилированный белок k11l, экспрессируемый в клеточной мембране и на ее поверхности, содержащий лейцин-богатые повторы похожие на TLR3, является консервативным и не имеет выраженной вариабельности. Для него наблюдается лишь 8 вариабельных сайтов, часть из которых попадает во внеклеточный топологический домен (с 17 по 239 аминокислоту), а также во внутриклеточный топологический домен (с 261 по 329 аминокислоту). Трансмембранный участок белка находится на С-конце (с 240 по 260 аминокислоту) (см. рис. 1).

В результате наблюдений D. Chapman и соавт. белки 5el и i14l отнесены к вариабельным, в работе V. de Oliveira и соавт. белок k11l — консервативный, а в работах J. Neilan и соавт. и C. Abrams и соавт., напротив, белок 5el признан консервативным [12, 26—28]. Согласно результатам наших исследований (см. рис. 1), изученные белки вируса АЧС являются консервативными, особенно в сравнении с другими вариабельными белками вируса АЧС (CD2V, p54) [29].

Для того чтобы определить генетическую связь на уровне нуклеотидных последовательностей между штаммами и изолятами вируса АЧС, мы провели секвенирование и множественное выравнивание конкатенированного набора генов A238L, I329L и DP71L.

По результатам секвенирования гены A238L и I329L изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2016 г., являются идентичными родительскому штамму Georgia_2007/1, который является представителем II генотипа.

Согласно полученным результатам по гену I329L, мы можем разделить имеющиеся изоляты на 5 основных кластеров, которые коррелируют с их генотипами (рис. 2).

Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная методом максимального правдоподобия на основе конкатенированных нуклеотидных последовательностей 15 штаммов 7 сероиммунотипов вируса АЧС. В легенде указаны штаммы и изоляты: — выделенные от свиней, — клещей, — бородавочников и — адаптированные к культуре клеток.
В первый кластер входят штаммы из Юго-Восточной Африки V генотипа, 3-го и 7-го сероиммунотипов, полногеномные изоляты Warthog и Pretorisuskop/96/4, XIX и XX генотипов, 2-го сероиммунотипа. Второй кластер состоит из представителей РФ II генотипа 8-го сероиммунотипа. В отдельный кластер попадают штаммы I генотипа 2-го сероиммунотипа. Четвертый кластер составляют штаммы и изоляты европейского происхождения 1-го и 4-го сероиммунотипов, за исключением изолята Benin 97/1 афри-канского происхождения, принадлежащих I генотипу. В пятый кластер были отнесены штаммы и изоляты X генотипа, выделенные на территории Танзании и Кении, а также некоторые представители VIII и IX генотипов. Изоляты из Южной Африки и Португалии с неопределенным и 2-м сероиммунотипом, не входили ни в одну из групп перечисленных кластеров.

Интересен факт, что у 6 восточноафриканских штаммов X генотипа (ТКФ, Наньюки, ТСП-80, ТСП-80/300, ТС-7, ТС-7/27−230), как у полногеномных изолятов Ken05/Tk1, Kenya 1950, Malawi Lil-20/1 и штамма Ken06. Bus, ген DP71L образуется путем слияния 13L и 14L. Для примера, результаты детекции продуктов амплификации 2 форм гена DP71L показаны на рис. 3.

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации гена DP71L, кодирующего белок i14l. М=100 п.о.
Результаты наших исследований подтверждают ранее полученные данные R. Bishop и соавт. [30].

Ранее проведенные исследования показали, что методика конкатенированных генов может разрешить неоднозначности в филогенетических построениях на основе отдельных генов. Конкатенация больших мультигенных наборов данных для повышения точности филогенетического логического вывода является принятой методикой для кластеров, состоящих из ортологичных генов [3].

Широко применяется конкатенация в таксонах, в которых имеются полные геномы, например в прокариотах [31], и таксоны с небольшими геномами органелл, такие как митохондрии животных [32]. Конкатенация последовательностей может скрывать основное дерево видов при наличии различных филогенетических сигналов в эволюции отдельных генов [3].

В нашей работе аминокислотные последовательности трех протеинов 5el, k11l и i14l от 32 штаммов вируса АЧС были сконкатенированы в одну псевдопоследовательность и использовались для расчета соотношения несинонимичной (dN) — синонимичной замены (dS) на сайт (отношение dN/dS).

Количество синонимичных замен на синонимичный сайт преобладало над количеством несинонимичных на несинонимичный сайт 0,2788>0,0678 (dS>dN, pS>pN). При подсчете соотношения dN/dS значение составляет 0,2432<1. Это свидетельствует об очищающем (стабилизирующем) отборе на уровне нуклеотидных последовательностей.

Очищающий отбор встречается наиболее часто, и он характерен для нуклеотидных последовательностей, кодирующих структурно-функционально сформированные белки. Сравнение скоростей синонимичных и несинонимичных замен по генам вируса АЧС выявило от 14 до 18 генов, которые подвергаются положительному (позитивному) отбору [26]. Роль иммунной системы в отношении вариабельности последовательностей может влиять на эволюцию последовательностей некоторых генов вируса АЧС, что, следовательно, может привести к смещению времени жизни «последнего общего предка» (TMRCA). Более низкие скорости несинонимичных изменений обнаруживаются в вирусах, передаваемых векторами — членистоногими, что отражает повышенное очищающее давление отбора, связанное с репликацией в различных видах хозяев. Возможно, что многие мутации, которые происходят внутри хозяев, удаляются при передаче между ними из-за сильного очищающего отбора, в первую очередь из-за несоответствия цитотоксического иммунного ответа хозяев, осуществляемого Т-лимфоцитами.

В работе Е. de Villiers и соавт. были исследованы 4 модели замены кодонов (M1, M2, M7 и M8). Модель M2 идентифицировала 14 генов вируса АЧС под положительным отбором. К ним относятся белки мультигенных семейств 360 и 505, несколько гипотетических белков, гомолог CD2v, несколько ферментов и вирусный шаперон B602L, который обеспечивает правильное складывание основного белка капсида p72. Самая строгая модель для положительного отбора, M8, идентифицировала восемнадцать генов, восемь из которых находятся под положительным отбором и представляют собой гены, которые могут участвовать в модуляции функций клетки-хозяина [3].

Данные анализа соотношения несинонимичных и синонимичных мутаций на широком уровне генома показывают несколько генов, которые могут оказаться под селективным давлением.

Заключение

Диапазон групповой вариабельности белков ранее изучали различные группы исследователей на примере белков p17 [34], p54 и CD2v [15, 26, 33].

Характеристика вариабельности отобранной нами группы генов вируса АЧС представляет большой интерес для поиска генетических различий и маркеров эволюционной изменчивости в иммуномодулирующих белках, а также может послужить выявлению таргетных участков в геноме вируса АЧС для разработки вакцин.

Полученные результаты по данным биоинформатического анализа показали, что белки 5el и i14l имеют внутриклеточные участки, белок k11l имеет внеклеточный и внутриклеточный топологические домены и трансмембранный участок. Наличие единичных нуклеотидных замен в этих участках может свидетельствовать о большей консервативности данных белков.

Степень нуклеотидных замен конкатенированных генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС, определенная в этом исследовании, выявила очищающий (стабилизирующий) отбор на уровне нуклеотидных последовательностей. В результате анализа нуклеотидных последовательностей, полученных в результате секвенирования генов A238L, I329L и DP71L, можно сделать вывод, что эти гены являются консервативными, при этом имеют внутри себя вариабельные участки. Все российские изоляты вируса АЧС, выделенные в 2016—2017 гг., имеют идентичные последовательности генов А238L и I329L, что свидетельствует об общности их происхождения. Топология филогенетического древа по гену I329L полностью совпадает с филогенетическим древом, построенным на основе псевдопоследовательности из 7 иммуномодулирующих генов. Таким образом, ген I329L может являться генетическим маркером общности происхождения. Белок i14l вируса АЧС имеет 2 формы: длинную (184 аминокислоты) и краткую (от 70 до 72 аминокислот), что является уникальным среди вариантов вируса АЧС.

Используя полученные данные, можно предсказать возможное участие этих генов в изменении уровня вирулентности, присущего выбранным штаммам, а также способность являться факторами вирулентности вируса АЧС.

Работа выполнена в рамках государственного задания 0615−2017−0001.

Благодарность. Работа выполнена в рамках государственного задания при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Долевое участие авторов: написание текста, сбор и обработка материала, выполнение отдельных этапов экспериментальной части — Нефедьева М.В., проведение секвенирования генов — Титов И.А., статистическая обработка вариабельности белков — Мима К.А., концепция и дизайн исследования, редактирование текста — Малоголовкин А.С..

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Сведения об авторах

Сведения об авторах:

М.В. Нефедьева [Nefedeva M.V.] https://orcid.org/0000-0002-6143-7199

И.А. Титов [Titov I.A.] https://orcid.org/0000-0002-5821-8980

К.А. Мима [Mima K.A.] https://orcid.org/0000-0001-7184-6968

А.С. Малоголовкин [Malogolovkin A.S.] https://orcid.org/0000-0003-1352-1780

Для корреспонденции: Малоголовкин Александр Сергеевич, канд. биол. наук, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии ФГБНУ Федерального исследовательского центра вирусологии и микробиологии, заместитель директора; e-mail: malogolovkin@inbox.ru

Список литературы:

  1. Sanchez-Vizcaino JM. African Swine Fever. In: Straw B, D’Allaire S, Mengeling W, Taylor D, (eds). Diseases of Swine. 9th edition. USA: Iowa State University; 2006.
  2. Rodriguez JM, Moreno LT, Alejo A, Lacasta A, Rodriguez F, Salas ML. Genome sequence of african swine fever virus BA71, the virulent parental strain of the nonpathogenic and tissue-culture adapted BA71V. PLoS ONE. 2015;10(11):e0142889. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142889
  3. De Villiers EP, Gallardo C, Arias M, Da Silva M, Upton C, Martin R, et al. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences. Virology. 2010;400:128-136. https://doi.org/10.1016/j.virol.2010.01.019
  4. Sanchez-Vizcaıno JM, Mur L, Gomez-Villamandos JC, Carrasco JL. An Update on the Epidemiology and Pathology of African Swine Fever. J Comp Pathol. 2015;152:9-21. https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2014.09.003
  5. Rock DL. Challenges for African swine fever vaccine development — «...perhaps the end of the beginning». Vet Microbiol. 2017;206:52-58. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2016.10.003
  6. Колбасов Д.В., Балышев В.М., Середа А.Д. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней. Ветеринария. 2014;8:3-8.
  7. King K, Chapman D, Argilaguet JM, Fishbourne E, Hutet E, Cariolet R, et al. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation. Vaccine. 2011;29(28):4593-4600. https://doi.org/10.1159/000170936
  8. Dixon LK, Abrams CC, Chapman DD, Goatley LC, Netherton CL, Taylor G, et al. Prospects for development of African swine fever virus vaccines. Dev Biol (Basel). 2013;135:147-157. https://doi.org/10.1159/000170936
  9. Nix RJ, Gallardo C, Hutchings G, Blanco E, Dixon LK. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions. Arch Virol. 2006;151(12):2475-2494. https://doi.org/10.1007/s00705-006-0794-z
  10. Dixon LK, Baylis SA, Vydeingum S, Twigg SRF, Hammond JM, Hingamp PM, et al. African swine fever virus genome content and variability. Arch Virol. 1993;7:185-199. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-9300-6_15
  11. Dixon LK, Abrams CC, Bowick G, Goatley LC, Kay-Jackson PC, Chapman D, et al. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. Vet Immunol Immunopathol. 2004;100(3-4):117-134. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2004.04.002
  12. De Oliveira VL, Almeida SC, Soares HR, Crespo A, Marshall-Clarke S, Parkhouse RME. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV). Arch Virol. 2011;156:597-609. https://doi.org/10.1007/s00705-010-0894-7
  13. Zsak L, Lu Z, Kutish GF, Neilan JG, Rock DL. An african swine fever virus virulence-associated gene NL-S with similarity to the herpes simplex virus ICP34.5 gene. J Virol. 1996;70(12):8865-8871.
  14. Granja AG, Perkins ND, Revilla Y. A238L inhibits NF-ATc2, NF-kappa B, and c-Jun activation through a novel mechanism involving protein kinase C-theta-mediated up-regulation of the amino-terminal transactivation domain of p300. J Immunol. 2008;180(4):2429-2442. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1490049
  15. Chapman DA, Tcherepanov V, Upton C, Dixon LK. Comparison of the genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. J Gen Virol. 2008;89(2):397-408. https://doi.org/10.1099/vir.0.83343-0
  16. Garcia-Boronat M, Diez-Rivero CM, Reinherz EL, Reche PA. PVS: a web server for protein sequence variability analysis tuned to facilitate conserved epitope discovery. Nucleic Acids Res. 2008;36:35-41. https://doi.org/10.1093/nar/gkn211
  17. Nielsen H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. In: Kihara D., (eds). Protein Function Prediction. Springer. 2017:59-73. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7015-5_6
  18. Dobson L, Remenyi I, Tusnady GE. CCTOP: a Consensus Constrained TOPology prediction web server. Nucleic Acids Res. 2015;43(1):408-412. https://doi.org/10.1093/nar/gkv451
  19. Gallardo C, Mwaengo DM, Macharia JM, Arias M, Taracha EA, Soler A, et al. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. Virus Genes. 2009;38(1):85-95. https://doi.org/10.1007/s11262-008-0293-2
  20. Bastos AD, Penrith ML, Cruciere C, Edrich JL, Hutchings G, Roger F, et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Arch Virol. 2003;148(4):693-706. https://doi.org/10.1007/s00705-002-0946-8
  21. Середа А.Д., Балышев В.М. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней. Вопросы вирусологии. 2011;56(4):38-42.
  22. Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 2004;32(5):1792-1797. https://doi.org/10.1093/nar/gkh340
  23. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2013;30(12):2725-2729. https://doi.org/10.1093/molbev/mst197
  24. Mosavi LK, Cammett TJ, Desrosiers DC, Peng ZY. The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition. Protein Sci. 2004;13(6):1435-1448. https://doi.org/10.1110/ps.03554604
  25. Jousse C, Oyadomari S, Novoa I, Lu PD, Zhang Y, Harding HP, et al. Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2a phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J Cell Biol. 2003;163:767-775. https://doi.org/10.1083/jcb.200308075
  26. Chapman DA, Darby AC, Da Silva M, Upton C, Radford AD, Dixon LK. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. Emerging Infect Dis. 2011;17(4):599-605. https://doi.org/10.3201/eid1704.101283
  27. Neilan JG, Lu Z, Kutish GF, Zsak L, Lewis TL, Rock DL. A conserved African swine fever virus I kappa B homolog, 5el, is nonessential for growth in vitro and virulence in domestic swine. Virology. 1997;235(2):377-385. https://doi.org/10.1006/viro.1997.8693
  28. Abrams CC, Chapman DA, Silk R, Liverani E, Dixon LK. Domains involved in calcineurin phosphatase inhibition and nuclear localisation in the African swine fever virus A238L protein. Virology. 2008;374(2):477-486. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001492
  29. Мима К.А., Бурмакина Г.С., Титов И.А., Малоголовкин А.С. Иммунологически значимые гликопротеины p54 и cd2v вируса африканской чумы свиней: биоинформатический анализ генетических вариаций и гетерогенности. Сельскохозяйственная биология. 2015;50(6):785-793. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.6.785rus
  30. Bishop RP, Fleischauer C, de Villiers EP, Okoth EA, Arias M, Gallardo C, et al. Comparative analysis of the complete genome sequences of Kenyan African swine fever virus isolates within p72 genotypes IX and X. Virus Genes. 2015;50(2):303-390. https://doi.org/10.1007/s11262-014-1156-7
  31. Brown JR, Douady CJ, Italia MJ, Marshall WE, Stanhope MJ. Universal trees based on large combined protein sequence data sets. Nat Genet. 2001;28:281-285. https://doi.org/10.1038/90129
  32. Miya M, Nishida M. Use of mitogenomic information in teleostean molecular phylogenetics: a tree-based exploration under the maximum-parsimony optimality criterion. Mol Phylogenet Evol. 2000;17:437-455. https://doi.org/10.1006/mpev.2000.0839
  33. Rowlands RJ, Duarte MM, Boinas F, Hutchings G, Dixon LK. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoros erraticus. Virology. 2009;393(2):319-328. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.07.040
  34. Suarez C, Gutierrez-Berzal J, Andres G, Salas ML, Rodriguez JM. African Swine Fever Virus Protein p17 Is Essential for the Progression of Viral Membrane Precursors toward Icosahedral Intermediates. J Virol. 2010;84(15):7484-7499. https://doi.org/10.1128/JVI.00600-10