Результаты и обсуждение

Результаты анализа вариабельности белков 5el, i14l и k11l различных штаммов вируса АЧС показали, что у белка 5el наблюдается 13 вариабельных сайтов, часть из которых располагается в участке IκB — подобного домена, состоящего из 3 повторов анкиринов (с 87 по 178 аминокислоту) и на С-терминальном конце мотива PxIxITxC/S, который связывает каталитическую субъединицу кальценейрина — серинтреонин фосфатазу (с 200 по 213 аминокислоту) (рис. 1).

Повторяющиеся белки анкирины, хотя и отсутствуют в большинстве вирусов, но также распространены и среди поксвирусов. Консервативные аминокислотные остатки анкиринов имеют решающее значение для фолдинга и стабильности белка, а также участвуют в присоединении других белков к разным участкам клеточной мембраны [24].

Анализ белка I14L показывает, что этот белок консервативен среди различных штаммов вируса АЧС, однако имеет 7 вариабельных сайтов. Все белки, кодируемые этим геном, содержат центральную область с высококонсервативным 56 аминокислотным доменом и мотивом PP1c_bdg (с 7 по 57 аминокислоту в короткой форме и со 123 по 170 аминокислоту в длинной форме) регуляторных субъединиц (15A и 15B) белковой фосфатазы 1, расположенных на карбоксильном конце, общих для MyD116 и ICP34.5. Этот консервативный С-конец, по-видимому, является связующей областью каталитической субъединицы протеинфосфатазы-1 (PP1C), которая обнаружена как в вирусе простого герпеса, так и у мышей и человека [25].

Высокогликозилированный белок k11l, экспрессируемый в клеточной мембране и на ее поверхности, содержащий лейцин-богатые повторы похожие на TLR3, является консервативным и не имеет выраженной вариабельности. Для него наблюдается лишь 8 вариабельных сайтов, часть из которых попадает во внеклеточный топологический домен (с 17 по 239 аминокислоту), а также во внутриклеточный топологический домен (с 261 по 329 аминокислоту). Трансмембранный участок белка находится на С-конце (с 240 по 260 аминокислоту) (см. рис. 1).

В результате наблюдений D. Chapman и соавт. белки 5el и i14l отнесены к вариабельным, в работе V. de Oliveira и соавт. белок k11l — консервативный, а в работах J. Neilan и соавт. и C. Abrams и соавт., напротив, белок 5el признан консервативным [12, 26—28]. Согласно результатам наших исследований (см. рис. 1), изученные белки вируса АЧС являются консервативными, особенно в сравнении с другими вариабельными белками вируса АЧС (CD2_V, p54) [29].

Для того чтобы определить генетическую связь на уровне нуклеотидных последовательностей между штаммами и изолятами вируса АЧС, мы провели секвенирование и множественное выравнивание конкатенированного набора генов A238L, I329L и DP71L.

По результатам секвенирования гены A238L и I329L изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2016 г., являются идентичными родительскому штамму Georgia_2007/1, который является представителем II генотипа.

Согласно полученным результатам по гену I329L, мы можем разделить имеющиеся изоляты на 5 основных кластеров, которые коррелируют с их генотипами (рис. 2).

В первый кластер входят штаммы из Юго-Восточной Африки V генотипа, 3-го и 7-го сероиммунотипов, полногеномные изоляты Warthog и Pretorisuskop/96/4, XIX и XX генотипов, 2-го сероиммунотипа. Второй кластер состоит из представителей РФ II генотипа 8-го сероиммунотипа. В отдельный кластер попадают штаммы I генотипа 2-го сероиммунотипа. Четвертый кластер составляют штаммы и изоляты европейского происхождения 1-го и 4-го сероиммунотипов, за исключением изолята Benin 97/1 афри-канского происхождения, принадлежащих I генотипу. В пятый кластер были отнесены штаммы и изоляты X генотипа, выделенные на территории Танзании и Кении, а также некоторые представители VIII и IX генотипов. Изоляты из Южной Африки и Португалии с неопределенным и 2-м сероиммунотипом, не входили ни в одну из групп перечисленных кластеров.

Интересен факт, что у 6 восточноафриканских штаммов X генотипа (ТКФ, Наньюки, ТСП-80, ТСП-80/300, ТС-7, ТС-7/27−230), как у полногеномных изолятов Ken05/Tk1, Kenya 1950, Malawi Lil-20/1 и штамма Ken06. Bus, ген DP71L образуется путем слияния 13L и 14L. Для примера, результаты детекции продуктов амплификации 2 форм гена DP71L показаны на рис. 3.

Результаты наших исследований подтверждают ранее полученные данные R. Bishop и соавт. [30].

Ранее проведенные исследования показали, что методика конкатенированных генов может разрешить неоднозначности в филогенетических построениях на основе отдельных генов. Конкатенация больших мультигенных наборов данных для повышения точности филогенетического логического вывода является принятой методикой для кластеров, состоящих из ортологичных генов [3].

Широко применяется конкатенация в таксонах, в которых имеются полные геномы, например в прокариотах [31], и таксоны с небольшими геномами органелл, такие как митохондрии животных [32]. Конкатенация последовательностей может скрывать основное дерево видов при наличии различных филогенетических сигналов в эволюции отдельных генов [3].

В нашей работе аминокислотные последовательности трех протеинов 5el, k11l и i14l от 32 штаммов вируса АЧС были сконкатенированы в одну псевдопоследовательность и использовались для расчета соотношения несинонимичной (dN) — синонимичной замены (dS) на сайт (отношение dN/dS).

Количество синонимичных замен на синонимичный сайт преобладало над количеством несинонимичных на несинонимичный сайт 0,2788>0,0678 (dS>dN, pS>pN). При подсчете соотношения dN/dS значение составляет 0,2432<1. Это свидетельствует об очищающем (стабилизирующем) отборе на уровне нуклеотидных последовательностей.

Очищающий отбор встречается наиболее часто, и он характерен для нуклеотидных последовательностей, кодирующих структурно-функционально сформированные белки. Сравнение скоростей синонимичных и несинонимичных замен по генам вируса АЧС выявило от 14 до 18 генов, которые подвергаются положительному (позитивному) отбору [26]. Роль иммунной системы в отношении вариабельности последовательностей может влиять на эволюцию последовательностей некоторых генов вируса АЧС, что, следовательно, может привести к смещению времени жизни «последнего общего предка» (TMRCA). Более низкие скорости несинонимичных изменений обнаруживаются в вирусах, передаваемых векторами — членистоногими, что отражает повышенное очищающее давление отбора, связанное с репликацией в различных видах хозяев. Возможно, что многие мутации, которые происходят внутри хозяев, удаляются при передаче между ними из-за сильного очищающего отбора, в первую очередь из-за несоответствия цитотоксического иммунного ответа хозяев, осуществляемого Т-лимфоцитами.

В работе Е. de Villiers и соавт. были исследованы 4 модели замены кодонов (M1, M2, M7 и M8). Модель M2 идентифицировала 14 генов вируса АЧС под положительным отбором. К ним относятся белки мультигенных семейств 360 и 505, несколько гипотетических белков, гомолог CD2v, несколько ферментов и вирусный шаперон B602L, который обеспечивает правильное складывание основного белка капсида p72. Самая строгая модель для положительного отбора, M8, идентифицировала восемнадцать генов, восемь из которых находятся под положительным отбором и представляют собой гены, которые могут участвовать в модуляции функций клетки-хозяина [3].

Данные анализа соотношения несинонимичных и синонимичных мутаций на широком уровне генома показывают несколько генов, которые могут оказаться под селективным давлением.